ODCZYNY SEROLOGICZNE

- metody wykazywania obecności i stężenia przeciwciał w surowicy i innych płynach tkankowych lub wykrywania antygenu przy użyciu znanej surowicy odpornościowej.

Pozwalają na rozpoznawanie chorób zakaźnych, przebiegających zarówno w formie ostrej jak i przewlekłej.

Trzy grupy:

- Umożliwiające bezpośrednio wykryć związany antygen z przeciwciałem.

- Wykazujące efekty łączenia się antygenu z przeciwciałem.

- Oceniające odpowiedź immunologiczną In vivo.

ODCZYNY WYKAZUJĄCE KOMPLEKSY ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO:

- odczyny immunofluorescencyjne (IF), służą do wykrywania antygenu znajdującego się w tkankach, płynach ustrojowych, wydzielinach i wydalinach. Stosuje się tzw. koniugaty, tj. swoiste przeciwciała znakowane barwnikiem fluoryzującym. Najczęściej używany jako barwnik jest izocyjanian fluoresceiny (FITC), który łatwo łączy się z immunoglobulinami, nie zmieniając przy tym właściwości reagowania z antygenem. Po naświetleniu promieniami ultrafioletowymi barwnik emituje zielone światło, co pozwala na stwierdzenie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego obecność kompleksów antygen-przeciwciało.

- bezpośredni odczyn immunofluorescencji, wykazywanie antygenu (bakterii, wirusów) w badanym materiale. Przeciwciała znakuje się barwnikiem FITC, pokrywa się nimi preparat i przetrzymuje w temp. 37^oC przez 30-60 min.. Dalej przemywa się kilkakrotnie preparat aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Po wysuszeniu ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obecność świecących zielono-żółtych kompleksów dowodzi obecności antygenu.

Badanie kału na obecność prątków gruźlicy, tkanki mózgowej przy podejrzeniu listeriozy czy wścieklizny, narządów wew. przy poszukiwaniu bakterii beztlenowych, do wykrywania wirusa pomoru świń.

- pośredni odczyn immunofluorescencji, głównie do wykazania antygenu w tkankach. Preparat pokrywa się swoistą surowicą, po inkubacji spłukuje buforowym roztworem 0,85% NaCl. Następnie pokrywa się surowicą antyglubolinową znakowaną FITC. Po następnej inkubacji i przemyciu preparat ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obecność ognisk fluorescencji dowodzi obecności antygenu w badanym preparacie.

ODCZYNY WYKAZUJĄCE EFEKTY ŁĄCZENIA SIĘ ANTYGENU Z PRZECIWCIAŁEM:

odczyny dwufazowe: faza I - swoiste wiązanie się antygenu z przeciwciałem, faza II uzależniona jest od stanu fizycznego antygenu i warunków środowiskowych. Jeżeli np. przeciwciało wiąże się z rozpuszczalnym antygenem powstają kompleksy precypitacyjne, jeżeli z antygenem upostaciowanym jest aglutynacja. Jeżeli reakcja wiązania antygenu z przeciwciałem powoduję aktywację dopełniacza mówimy o odczynach komplementarnych.

- odczyn precypitacji, polega na łączeniu się antygenu koloidalnego - bezpostaciowego ze swoistym przeciwciałem w obecności elektrolitów. Wynik reakcji charakteryzuje się zmętnieniem, a później tworzeniem się delikatnego precypitatu. Odczyn uwarunkowany jest w dużym stopniu stosunkami ilościowymi reagentów. Zahamowanie odczynu może wystąpić przy nadmiarze antygenu i przeciwciał. W obu przypadkach tworzą się rozpuszczalne, nieprecypitujące kompleksy. Przy optymalnych proporcjach antygen-przeciwciało dochodzi do krzyżowych połączeń między cząsteczkami antygenu i formowania się dużych kompleksów precypitacyjnych.

TECHNIKI PRECYPITACYJNE:

- próba pierścieniowa, do wykrywania antygenu, małą ilość surowicy odpornościowej na dno probówki i nawarstwia się odrobinę roztworu antygenu. W wyniku łączenia się a. z prz. w ciągu 1-2 min. tworzy się delikatny pierścień na granicy płynów. W diagnostyce wąglika jako tzw, odczyn Ascoliego.

- test flokulacji, zmieszanie roztworu a. z surowicą odp. i obserwowanie po okresie inkubacji powstałego precypitatu. Aby uniknąć hamowania precypitacji przy nadmiarze a. nastawia się odczyn w kilku probówkach, zwierające kolejne rozcieńczenia a. i dodaje się stałą dawkę surowicy. Określanie stężenia toksyny stanowiącej materiał wyjściowy do produkcji anatoksyny - szczepionki do uodporniania zwierząt.

- precypitacja w żelu, test podwójnej immunodyfuzji, a. i sur. są w basenikach wyciętych w żelu agarowym, skąd dyfundują we wszystkich kierunkach. Na granicy zetknięcia się a. z prz. Tworzy się linia precypitacyjna w ciągu 24-48 h inkubacji w temp. pokojowej. Preparaty zawierające różne frakcje antygenowe, będą dawać kilka prążków precypitacyjnych w zależności od ich ruchliwości w żelu. W ten sposób można stwierdzić liczbę a. w badanym preparacie, jak i ustalić stopień ich pokrewieństwa antygenowego. Jeżeli są identyczne a. utworzą się linie strątu łączące się ze sobą, jest to tzw. reakcja identyczności. Jeżeli a. są różne nastąpi przecięcie się wytworzonych przez nie prążków - reakcje nieidentyczności. Reakcja częściowej identyczności charakteryzuje się tworzeniem tzw. ostrogi, co świadczy, że jeden z a. podobnych ma dodatkową determinantę antygenową. Służy do badania struktury antygenowej drobnoustrojów, np. włoskowca różycy, wirusa pryszczycy, do celów diagnostycznych, można wykazać obecność swoistych przeciwciał w surowicach koni chorych na niedokrwistość zakaźną i bydła chorego na białaczkę.

- immunodyfuzja radialna, polega na migracji a. z basenu do żelu nasyconego swoistymi przeciwciałami. Stężenie surowicy w żelu jest oznaczone i stałe, natomiast zmienne w poszczególnych basenach są ilości a.. W wyniku reakcji a. z prz. wokół basenów powstają strąty precypitacyjne w formie pierścieni. Średnica tych pierścieni jest proporcjonalna do ilości badanego a.. Określa się koncentrację a., do wykazania prz. przeciwko Mycoplasma mycoides.

- immunoelektroforeaza

- immunoelektroprecypitacja

- dwukierunkowa immunoelektroforeaza

ODCZYN AGLUTYNACJI:

Prz. co najmniej dwuwartościowe po związaniu się ze swoistym a. na powierzchni takich cząsteczek korpuskularnych jak: bakterie, krwinki, plemniki, powodują ich aglutynację, czyli zlepianie. Aglutynacja to zjawisko 2 fazowe. I etap - wiązanie się swoistych prz. z a.. II etap - immunoglobuliny (prz.) naładowane słabo dodatnio zobojętniają wzajemne odpychanie się ujemnie naładowanych cząsteczek a., prowadząc do ich adherencji i wypadania kompleksów z r-ru w obecności elektrolitów. Najłatwiej wiążą a. i aglutynują wielowartościowe prz. klasy IgM, a klasy IgG i IgA są mało aktywne. Aglutyniny stwierdza się głównie w surowicy, gdzie pojawiają się już w czasie choroby, zwykle na 6-10 dzień po zakażeniu, i utrzymują się od kilku do kilkunastu miesięcy. Aglutyniny nie inaktywują drobnoustrojów, tylko ich agregację i immobilizację w kapilarach naczyń krw. Gdzie łatwo ulegają fagocytozie. Odczyny aglutynacyjne są wykorzystywane w serodiagnostyce brucelozy, salmonellozy, leptospirozy. Na podstawie stężenia prz. - miana surowicy badanych zwierząt można stawać rozpoznanie choroby. Miano to odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, przy którym następuje jeszcze widoczny odczyn aglutynacji. Aglutynacja ma jeszcze zastosowanie przy identyfikacji a. bakt. za pomocą zestawu surowic o określonej swoistości. Ma to znaczenie w różnicowaniu drobnoustrojów o zbliżonych cechach morfologicznych i właściwościach fizjologicznych.

- techniki aglutynacji bezpośredniej, Aglutynacja probówkowa, surowicę rozcieńcza się r-rem 0,85% NaCl a następnie do probówek ze wzrastającymi rozcieńczeniami surowicy dodaje się tyle samo a. Probówki z reagentami pozostawia się przez 2 h w cieplarce w 37^oC, a potem w temp. pok. Wynik reakcji odczytuje się na drugi dzień. Określa się miano surowicy, przy nadmiarze prz. jest prozona - zahamowanie zjawiska aglutynacji. Jest też przy prz. które nie mają zdolności aglutynacji mino wiązania się z a. - przeciwciała niekompletne. Może być też takie usytuowanie determinantów, że są trudno dostępne dla receptorów prz. lub oba receptory prz. połączą się z determinantami na jednym a.

Aglutynacja płytkowa, kroplę surowicy, krwi lub mleka miesza się z kroplą barwionego antygenu na płycie szklanej, a wynik odczytuje się już po kilku min. trzymania płyty w temp. pok. Jest to metoda często stosowana w terenie.

Aglutynacja mikroskopowa, odczyn na szkiełkach przedmiotowych lub na specjalnej płycie szklanej, wynik odczytuje się pod mikroskopem po 5-10 min. od nastawienia aglutynacji. Przy rozpoznawaniu leptospirozy. Niektóre gatunki bakterii lub ich formy dysocjacyjne nie tworzą jednorodnej zawiesiny w r-rze fizj. NaCl. Ulegają one bez obecności prz. samoistnemu zlepianiu i wypadają z r-ru jako aglutynaty. Zjawisko to nosi nazwę aglutynacji spontanicznej lub rzekomej.

- aglutynacja bierna, trzy składniki biorące udział: a. w postaci koloidalnej, swoiste do niego prz., bierny nośnik a.. Najczęściej nośnikami są erytrocyty owcy lub człowieka, cząstki lateksu czy bentonitu. Jako a. stosuje się wyciągi polisacharydowe, lipopolisacharydowe, glikoproteidy. A. opłaszcza się nośnikami i miesza się z przeciwciałami swoistymi dla zaadsorbowanych a.. Wynik odczytuje się po 24 h przetrzymywania w temp. pok..

- odczyn antyglobulinowy Coombsa, pośredni odczyn aglutynacyjny służący do wykrywania niekompletnych prz.. Prz. takie są jednowartościowe i po połączeniu ze swoistym a. tworzą małe kompleksy nie wypadające z r-ru. Obecność tych prz. można jednak wykryć dodając np. do zawiesiny pałeczek z rodzaju Brucela, związanych ze swoistymi prz. niekompletnymi surowicy antyglobulinowej. Surowicę taką uzyskuje się uodporniając królika globulinami bydlęcymi. Surowica królicza zawiera wówczas kompletne prz. antyglobulinowe, które reagują z globulinami, czyli prz. niekompletnymi związanymi z bakteriami i powstają duże kompleksy, wypadające z r-ru w postaci widocznych makroskopowo aglutynatów. Wykorzystywane jest jako test uzupełniający obok odczynu aglutynacji i OWD. Czasem ma zastosowanie w rozpoznawaniu listeriozy.

- odczyn zahamowania hemaglutynacji, szereg drobnoustrojów ma zdolność aglutynacji czerwonych krwinek ssaka np. wirus grypy, rzekomego pomoru drobiu, ale tracą tę właściwość po związaniu ze swoistym prz.. Do stałej dawki a. z 4-8 jednostkami hemaglutynacyjnymi dodaje się kolejno wzrastające rozcieńczenia surowicy. Po inkubacji miesza się kompleksy a.-prz. z zawiesiną przemytych erytrocytów. Za jednostkę hemaglutynacyjną uznaje się minimalną dawkę zarazka powodującego hemaglutynację. Identyfikacja nieznanego zarazka o właściwościach hemaglutynacyjnych lub wykrywanie prz. w badanej surowicy przy użyciu znanego wirusa lub bakterii.

- współaglutynacja, aglutynowanie przez prz. obok zarazka homologicznego również zwykle w niższym mianie bakterii antygenowo pokrewnych.

- paraaglutynacja, zjawisko zlepiania przez surowice osobników chorych nie tylko zarazków związanych etiologicznie z daną jednostką chorobową ale także innych nie spokrewnionych szczepów bakterii w org. chorego.

ODCZYNY KOMPLEMENTARNE:

- odczyn wiązania dopełniacza, służy do wykrywania i określania albo prz. w surowicy albo a. w materiale badanym. Wykorzystywane jest zjawisko, że krw. czerwone uczulone swoistymi prz. ulegają lizie pod wpływem działania komplementu. Obejmuje dwa układy. I - testowy, a.+inaktywowana badana surowica (bez dopełniacza)+świeża surowica świnki morskiej jako źródło komplementu. Jeżeli zwierze ma w surowicy prz. wówczas wiążą one swoisty a. a powstały kompleksprzyłącza w całości dopełniacz. Zużycie dopełniacza w tym układzie może być wykazane po dodaniu II systemu wskaźnikowego. Układ wskaźnikowy zawiera zawiesinę czerwonych krwinek barana oraz tzw. amboceptor hemolityczny, czyli inaktywowaną surowicę królika uodpornionego krwinkami barana. W przypadku związania dopełniacza w I układzie, uczulone krwinki układu II nie ulegną lizie, natomiast liza tych krwinek będzie świadczyła o braku swoistych prz. w badanej surowicy układu I. Przed nastawieniem odczynu składniki obu układów muszą być dokładnie wymiareczkowane. Dosanie ściśle określonej ilości dopełniacza ma zasadnicze znaczenie - nadmiar komplementu będzie powodował zawsze hemolizę krw., niedobór wywoła niekompletną hemolizę. Zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych (bruceloza, nosacizna, ch. pęcherzykowa świń), określanie serotypów poszczególnych drobnoustrojów. W diagnostyce serologicznej brucelozy jako tzw. odczyn Holta słuzy niekiedy do wykrywania a. w badanym materiale (np. w zawartości żołądka poronionego płodu) przy użyciu wzorcowej brucelozowej surowicy odpornościowej.

- pośredni odczyn wiązania dopełniacza, stosowany u ptaków których surowice po związaniu się ze swoistym a. nie przyłączają dopełniacza świnki morskiej. Trudność tę rozwiązano wprowadzając do odczynu surowicę odpornościową ssaka, zawierającą swoiste prz. dla użytego a., jako 6 składnik. W przypadku obecności w badanej surowicy ptasiej prz. dochodzi do połączenia ich z a. Kompleksy te nie wiążą jednak dopełniacza, który przechodzi do II układu i powoduje lizę krwinek barana. Przy braku swoistych prz. a. zwiąże się z prz. surowicy wskaźnikowej i przyłączy dopełniacz. Wobec braku dopełniacza w II układzie nie będzie lizy.

- odczyn konglutynacji, dwa układy: I - zamiast surowicy świnki morskiej jest świeża surowica końska zawierająca niekompletny dopełniacz. II - zamiast amboceptora jest zwyczajna surowica bydlęca, zawierająca konglutyninę wykorzystywaną jako wskaźnik wiązania niekompletnego dopełniacza. Przy badaniu surowic źrebnych klaczy, osłów, mułów. Jeżeli w surowicy badanego zwierzęcia są obecne prz., wiążą one a. i dopełniacz. Krwinki układu wskaźnikowego nie ulegają agregacji. Gdy jest brak swoistych prz. w badanej surowicy - zdrowe zwierze, niezwiązany dopełniacz z I układu wywołuje w II układzie aglutynację krwinek barana. Konglutynina jest normalnym, ciepłostałym składnikiem surowicy tylko bydlęcej, nie jest immunoglobuliną.

ODCZYNY KOMÓRKOWE IN VITRO:

- test hamowania migracji, wykorzystuje dwa zjawiska: zdolność makrofagów do wędrowania po gładkiej szklanej powierzchni, właściwośc wydzielania limfokin przez uczulone limfocyty T przy powtórnym kontakcie ze swoistym a.. Jedną z takich limfokin jest czynnik hamujący migrację, tzw. MIF. Odczyn polega na hamowaniu wędrówki makrofagów jako kom. wskaźnikowych przez MIF wytwarzany przez limfocyty w warunkach In vitro. Odczyn wykonuje się albo metodą kapilarną albo na płytkach w agarozie. Metoda kapilarna polega na tym, że cienkie szklane rurki wypełnia się zawiesiną komórek pochodzących od uczulonego zwierzęcia. Mogą to być komórki wysięku otrzewnowego, krwi obwodowej, kom. śledziony czy węzłów chłonnych. Kapilary umieszcza się w specjalnych komorach, z których część jest wypełniona tylko podłożem odżywczym a część podłożem zawierającym swoisty a.. Komory przetrzymuje się przez 24h w temp. 37^oC. W hodowlach kontrolnych kom. wędrują z rurek tworząc charakterystyczne pola migracji. W komorach z a. uczulone uprzednio limf. przy ponownym kontakcie z a. wydzielają MIF, który hamuje migrację makrofagów. Za pomocą aparatu powiększającego można określić wymiary strefy migracji i obliczyć jej pow. za pomocą planimetru. Stopień hamowania migracji wyraża się w % według wzoru: 1- śr. obszar migracji w obecności a./ --- bez a. * 100

- test transformacji blastycznej, wykorzystuje właściwości przekształcania się limf. w kom. blastyczne pod wpływem swoistego a., na który jest uczulony dawca limf.. Zawiesinę kom. limfoidalnych grasicy, węzłów chłonnych lub śledziony zawiesza się w podłożu odżywczym z dodatkiem antygenu i bez antygenu (kontrola) i inkubuje się przez 48-72h w 37^oC w cieplarce z dopływem 5% CO₂. Z kolei hodowle odwirowuje się, wykonuje rozmazy i zabarwia. Wzór: liczba blastów w hodowli z a./ --- bez a., jest to ocenianie morfologiczne procesów transformacji przez obliczanie procentu kom. blastycznych w stosunku do ogólnej liczby kom.

ODCZYNY NEUTRALIZACYJNE:

Polegają na badaniu działania ochronnego surowic odpornościowych In vivo lub In vitro.

- odczyn seroneutralizacji

- odczyn hamowania hemadsorpcji, hemadsorpcja - przyleganie krwinek czerw. Do zakażonych kom.. Identyfikacja wirusw nie mających właściwości cytoplazmatycznych.

- odczyn redukcji liczby łysinek, łysinki są wynikiem lokalnego namnażania się wirusa i wywoływania lizy w jednowarstwowej hodowli kom. w miejscach zaadsorbowania się zarazka.

---