© Copyright by $taś

- 1 -

ODCZYNY SEROLOGICZNE I ETODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ STOSOWANE W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ

Odczyny serologiczne stosowane w diagnostyce wirusologicznej są oparte na reakcji antygenu z przeciwciałem

swoiście przeciwko niemu skierowanym. Odczyny te wykorzystuje się do wykrywania:

Antygenów obecnych w pobranym materiale klinicznym (tzw. szybkie lub bezpośrednie metody
diagnostyczne)
Antygenów po namnożeniu wirusa we wrażliwych komórkach (w hodowli komórkowej zarodku kurzym,
zwierzętach laboratoryjnych)
Przeciwciał obecnych w surowicy chorego będących następstwem reakcji immunologicznej na toczące
się zakażenie

W zależności od celu, w jakim stosujemy odczyn serologiczny, gdy poszukujemy obecności antygenu posługujemy
się surowicami wzorcowymi o znanej specyficzności lub gdy chcemy określić miano przeciwciał – wzorcowymi
antygenami

Określając poziom przeciwciał w surowicy chorego , można ustalić rozpoznanie na podstawie wykazania:

Co najmniej 4-krotnego przyrostu miana w 2 próbkach surowicy pobranych w odstępie 2-3 tygodni
(najlepiej w okresie ostrym choroby i rekonwalescencji) lub
Obecności swoistych przeciwciał klasy IgM

Najczęściej stosowane odczyny:

Odczyn neutralizacji (ONt)
Odczyn immunoenzymatyczny (ELISA)
Odczyn immunofluorescencyjny (OIF)
Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)
Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA)
Odczyn radioimmunologiczny (RIA)
Odczyn aglutynacji cząstek opłaszczonych wirusem
Odczyn hemolizy radialnej

Metoda immunodyfuzji
Metoda immunoblotu (Western blot, WB)

Odczyn neutralizacji (ONt)

To najczulszy i najbardziej swoisty odczyn stosowany zarówno do wykrywania wirusów obecnych w
badanym materiale, jak i przeciwciał w surowicy chorego

Niedogodnością ONt jest pracochłonność i stosunkowo długi czas oczekiwania na wynik
ONt znajduje głównie zastosowanie w diagnostyce enterowirusów
Istotą odczynu jest zobojętnienie wirusa przez swoiste przeciwciała, co objawia się utratą jego właściwości
zakaźnych.

o

Reakcję zobojętniania przeprowadza się w probówce wobec stałej dawki wirusa (gdy określamy
poziom przeciwciał) lub wobec surowicy odpornościowej o znanym mianie (gdy typujemy
nieznany wirus)

Wynik reakcji zobojętnienia jest niewidoczny i można go ocenić dopiero po wprowadzeniu reagentów do
układu indykatorowego
Mieszaniną wirusa i surowicy zakaża się wrażliwy obiekt biologiczny, jakim może być zwierzę
doświadczalne, zarodek kurzy lub hodowla komórkowa. Brak objawów zakażenia jest wynikiem dodatnim.
Dla właściwej interpretacji wyniku konieczne jest przeprowadzenie niezbędnych kontroli.

Wartość miana przeciwciał neutralizujących określa takie najwyższe rozcieńczenie surowicy pacjenta,

które zobojętnia właściwości patogenne użytego wirusa w danym systemie biologicznym.

Odczyn immunoenzymatyczny (EIA, ELISA)

Pozwala na jakościową i ilościową ocenę obecności szukanego antygenu lub przeciwciała, który wiąże
się ze związanym, (faza stała) przeciwstawnym reagentem.

W wyniku reakcji cały kompleks antygenu z przeciwciałem jest unieruchomiony, w związku z czym nie
ulega wymyciu w procesie odpłukiwania nadmiaru niezwiązanych reagentów i można go wykazać po
dodaniu kolejnego przeciwciała połączonego z enzymem (najczęściej jest to peroksydaza chrzanowa lub

fosfataza alkaliczna).
Pod wpływem enzymu następie zmiana zabarwienia dodanego w kolejnym etapie reakcji substratu, np.
aminoetylokarbozolu lub dwuaminobenzydyny. Powstałe zabarwienie jest proporcjonalne do ilości
powstałych kompleksów antygen-przeciwciało. Wynik reakcji może być oceniany wizualnie lub

© Copyright by $taś

- 2 -

spektrofotometrycznie. Stosując enzymatycznie znakowane przeciwciała swoiste dla poszczególnych klas
immunoglobulin, można wykrywać obecność przeciwciała klasy IgG,M,A.
Odmianą metod immunoenzymatycznych stosowaną do wykrywania antygenów w utrwalonych
skrawkach histologicznych lub preparatach komórkowych, z wykorzystaniem

przeciwciał znakowanych

peroksydazą lub fosfatazą

jest metoda PAP i APAAP. W tych odczynach poszukiwany produkt reakcji

antygenu z przeciwciałem „mostkuje się” za pośrednictwem dodatkowej antyglobuliny (surowicy
wiążącej) z kompleksem zawierającym przeciwciało-enzym. Utworzenie takiego kilkuwarstwowego
kompleksu w reakcji wieloetapowej wpływa na znaczne zwiększenie czułości tych metod. Wynik reakcji
odczytywany jest pod mikroskopom (powiększenie 100-400x)

Zaletą metod immunoenzymatycznych jest bezpieczeństwo i szybkość wykonania odczynu, prostota
odczytu i interpretacji wyniku oraz możliwość pełnej automatyzacji. Odczyny te są szeroko stosowane w
diagnostyce, np. zakażeń wirusami hepatotropowymi, wirusami z rodziny Herpesviridae

W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (1), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała.
W przypadku zastosowań diagnostycznych dostępne są zwykle gotowe, opłaszczone antygenem płytki. Na tak przygotowane podłoże
nanosi się surowicę pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji płytkę się przepłukuje. Jeżeli przeciwciała skierowane przeciwko
antygenowi znajdowały się w surowicy, zwiążą się one z antygenem na płytce (2). Za pomocą drugiego przeciwciała lub innego
wyznakowanego ligandu (które wiąże się z jakimś innym epitopem) można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę (4,
5), co może dostarczyć dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecność tylko przeciwciał IgM
świadczy o tym, że chory przechodzi pierwsze w życiu zakażenie danym drobnoustrojem, zaś obecność IgG świadczy o kolejnym
zakażeniu). To drugie przeciwciało lub inny enzym przekształca dodatkowo bezbarwny lub niefluoryzujący substrat w barwny lub
fluoryzujący produkt. A intensywność kolory lub fluorescencji jest następnie mierzona dla każdej próby i stanowi podstawę obliczenia ilości
obcego w niej Ag.

Odczyn immunofluorescencyjny (OIF)

W przypadku wykrywania antygenów wirusowych stosuje się przeciwciała wzorcowe skoniugowane z
barwikami fluorescencyjnymi, np. izotiocyjanianem fluoresceiny lub rodaminy (surowice znakowane).

Reakcje przeprowadza się na utrwalonych rozmazach z materiałów klinicznych lub preparatach
histologicznych. W miejscu ekspresji antygenu wirusa na powierzchni komórki następuje reakcja
serologiczna, polegająca na utworzeniu kompleksu przeciwciało-antygen. Niezwiązane przeciwciała
spłukuje się, a wynik reakcji odczytuje się w mikroskopie fluorescencyjnym.

Do wykrywania przeciwciał obecnych w surowicy pacjenta stosuje się pośredni OIF. Jako antygenu używa
się hodowle komórkowe zakażone laboratoryjnym szczepem danego wirusa. Kompleks antygen-
przeciwciało uwidacznia się za pośrednictwem dodatkowej, znakowanej immunoglobuliny zawierającej
przeciwciała swoiste dla ludzkiej globuliny uzyskane w toku immunizacji zwierząt.

Powszechnie stosuje się zarówno bezpośredni i pośredni OIF. Znalazł on, między innymi zastosowanie w tzw.
szybkich metodach diagnostycznych, w rozpoznawaniu zakażeń dróg oddechowych.

Odczyn radioimmunologiczny (RIA)

W metodzie tej jako znacznika używa się pierwiastka promieniotwórczego
Wykrycie poszukiwanego składnika odbywa się za pomocą pomiaru promieniowania izotopu związanego

z jedną ze składowych reakcji antygen-przeciwciało. Można dokonywać pomiaru radioaktywności
powstałego kompleksu lub supernatantu, po oddzieleniu tegoż kompleksu.

Najczęściej stosowanym izotopem znacznikowym jest 125

J.

Metoda RIA cechuje bardzo wysoka czułość;
Ich ograniczeniem jest konieczność wyposażenia laboratorium w odpowiedni sprzęt oraz zapewnienie
bezpieczeństwa pracy.

Odczyn RIA do niedawna stosowany był w diagnostyce zakażeń wywołanych wirusem zapalenia wątroby
typu B

Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

Istotą odczynu jest wiązanie dopełniacza (pochodzącego z surowicy świnki morskiej) przez swoisty
kompleks antygen-przeciwciało (I faza reakcji).
To czy został on związany stwierdza się w II fazie reakcji przez dodanie do układu „uczulonych” krwinek

baranich, to jest krwinek opłaszczonych swoistymi dla nich przeciwciałami (amboceptor hemolityczny).

Ulegają one hemolizie tylko wtedy, gdy dopełniacz nie został związany w I fazie reakcji.
Brak hemolizy oznacza wynik dodatni, gdyż wskazuje, że w I fazie reakcji powstał kompleks antygen-
przeciwciało, który związał całkowicie dopełniacz
OWD znalazł zastosowanie głównie do określania miana swoistych przeciwciał, np. dla wirusa herpes
simplex, cytomegalii.

© Copyright by $taś

- 3 -

Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA)

Odczyn ten można stosować w diagnostyce wirusów, które posiadają zdolność hemaglutynacji, tj.
aglutynowania krwinek czerwonych różnych gatunków zwierząt lub ludzkich „0”Rh(-)(np. ortomyksowirusy,

paramyksowirusy, wirus różyczki),.
Jeżeli w badanej surowicy znajdują się przeciwciała dla określonej hemaglutyniny wirusowej, to po
dodaniu wirusa , a następnie odpowiednich krwinek czerwonych nie dochodzi do ich aglutynowania.
Za miano surowicy przyjmuje się to największe rozcieńczenie, w którym występuje zahamowanie
hemaglutynacji.
Ponieważ wiele surowic ludzkich i zwierzęcych zawiera nieswoiste czynniki hamujące aglutynację
erytrocytów, co może powodować fałszywie dodatnie wyniki, przed użyciem surowic do OZHA konieczne
jest zniszczenie lub usunięcie tych inhibitorów.

o

W tym celu stosuje się wiele metod, np. ogrzewanie, traktowanie przesączem hodowli bulionowej
przecinkowca cholery (RDE), adsorpcję kaolinem.

Odczyn aglutynacji cząstek opłaszczonych wirusem

Antygen wirusowy zostaje zaadsorbowany na powierzchni nośnika, np. lateksu, bentonitu, erytrocytów
(mówimy wówczas o hemaglutynacji pośredniej).
Następnie dodaje się surowicę zawierającą przeciwciała, które reagują z tym opłaszczonym na nośniku
antygenem à następuje wytrącenie cząstek nośnika i ich zlepianie (aglutynacja)

Metoda ta znalazła zastosowanie głównie w tzw. szybkich testach diagnostycznych w wykrywaniu np.

rotawirusów w kale pacjenta

Odczyn hemolizy radialnej

Jest odczynem wykorzystującym właściwości hemolityczne dopełniacza

1. Antygen wirusowy opłaszcza się na powierzchni erytrocytów.
2. Erytrocyty z opłaszczonym antygenem wirusowym miesza się następnie z płynną, podgrzaną agarozą i

rozlewa do płytek Petriego

3. Po zakrzepnięciu wycina się w agarozie dołki, do których wlewa się badane surowice.
4. W czasie kilkugodzinnej inkubacji następuje dyfuzja przeciwciał (z badanej surowicy w tych „dołkach”) i

ich połączenie z antygenami znajdującymi się na erytrocytach (w agarozie)

5. Na powierzchnię pytek nanosi się wtedy roztwór dopełniacza, który powoduje lizę tych krwinek, na których

powstał kompleks antygen-przeciwciało.

6. Wielkość strefy hemolizy wokół dołków odpowiada ilości obecnych w surowicy swoistych przeciwciał.

Metoda immunodyfuzji

W tej metodzie, w środowisku żelu agarowego, następuje wędrówka naprzeciw siebie antygenu i
przeciwciała.
W miejscu ich zetknięcia powstaje linia precypitacji, której natężenie jest wykładnikiem stężenia
reagujących składników.

Metoda ta jest przydatna głównie do wykrywania rozpuszczalnych antygenów wirusowych

o

Stosowana była np. w diagnostyce wirusowego zapalenia wątroby typu B, obecnie wyparta przez
metody immunoenzymatyczne

Metoda immunoblotu, Western blot (WB)

Metoda ta umożliwia jednoczasowe wykrycie w surowicy pacjenta obecności przeciwciał reagujących z
różnymi białkami danego wirusa

1. Namnożoną i oczyszczoną zawiesinę wirusa poddaje się trawieniu,
2. uzyskane w ten sposób białka wirusowe rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym, zgodnie

z ich masą cząsteczkową.

3. Pasma poszczególnych białek są przenoszone („blotting”) na błonę nitrocelulozową, z którą silnie się wiążą
4. Po wypłukaniu i wysuszeniu błonę tnie się na paski używane do odczynu właściwego,
5. Na pasek nanosi się badaną surowicę
6. po okresie inkubacji swoiste przeciwciała wiążą się z odpowiednimi białkami wirusowymi

© Copyright by $taś

- 4 -

7. Po odpłukaniu niezwiązanych fragmentów dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej

immunoglobulinie wyznakowane enzymem.

8. Dodany w kolejnym etapie substrat barwi te prążki, na których zaszła reakcja antygen-przeciwciało.

Odczyn ten jest obecnie stosowany jako test potwierdzający w diagnostyce zakażeń HIV

W diagnostyce wirusologicznej coraz częściej stosuje się metody biologii molekularnej umożliwiające wykrywanie
genomu wirusowego. Metody te wymagają znajomości sekwencji poszczególnych nukleotydów w wirusowym DNA
lub RNA. Bardzo wysoka czułość tych technik może być przyczyną uzyskiwania fałszywie dodatnich wynikó·, stąd
konieczność zachowani odpowiedniego reżimu postępowania i ostrożnej interpretacji wyników

Metoda hybrydyzacji

Wykorzystuje zjawisko komplementarności zasad purynowych i pirymidynowych.

1. W pierwszym etapie reakcji następuje denaturacja kwasu nukleinowego (pod wpływem temperatury,

rzadziej działania chemicznego) do pojedynczej nici.

2. Dodana sonda genetyczna (fragment oligonukleotydów o znanej sekwencji, charakterystycznej dla

poszukiwanego wirusa) łączy się (hybrydyzuje) w miejscach, gdzie sekwencja nukleotydów jest
komplementarna do obecnej w badanej próbce.

a. W zależności od znacznika, z którym połączona jest sonda genetyczna (barwnik fluorescencyjny,

enzym, białko, radioizotop) stosujemy różne sposoby detekcji reakcji hybrydyzacji.

W praktyce stosujemy odmiany:

o

Hybrydyzacja in situ

·

w tej samej odmianie reakcję hybrydyzacji przeprowadza się na utrwalonym

skrawku tkanki lub rozmazie komórkowym.

·

Metoda ta umożliwia zlokalizowanie poszukiwanych sekwencji wirusowych
wewnątrz zakażonej komórki

o

Hybrydyzacja typu „Southern blot”

·

DNA wyizolowany z badanej próbki poddaje się działaniu enzymów
restrykcyjnych, które tną nić kwasu nukleinowego na krótsze fragmenty
oligonukleotydów.

·

Fragmenty te rozdziela się elektroforetycznie,

·

Następnie, po utrwaleniu, przenosi się na filtr nitrocelulozowy, na którym
przeprowadza się hybrydyzację z sondą genetyczną.

·

Porównanie prążków uzyskanych z materiału klinicznego i wirusa prototypowego
umożliwia dokładne określenie typu wyizolowanego wirusa i umożliwia
dochodzenie epidemiologiczne

o

hybrydyzacja typu „Northern blot”

·

w przypadku gdy rozdział dotyczy fragmentów RNA

Polimerazowa reakcja łańcuchowa, PCR

Umożliwia w warunkach in vitro, w ciągu kilku godzin, zwielokrotnienie pojedynczej kopii fragmentu
wirusowego DNA miliony razy, do takich ilości, które jesteśmy w stanie wykryć dostępnymi nam metodami

1. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze, aparacie charakteryzującym się możliwością szybkich zmian

temperatury

2. Próbkę badanego materiału poddaje się działaniu wysokiej temperatury (>90°C) w celu uzyskania

pojedynczej nici DNA (denaturacja).

3. Po ochłodzeniu do 50-60°C dodaje się primery (startery o budowie oligonukleotydowej), przyłączające się

w sposób swoisty, na zasadzie komplementarności, do dwóch fragmentów przeciwległych nici DNA.

4. Do mieszaniny reakcyjnej, odpowiednio zbuforowanej dodajemy także termostabilną polimerazę DNA oraz

nukleotydy konieczne do syntezy DNA.

5. W temperaturze 70-75°C w obecności polimerazy następuje dobudowywanie komplementarne nici DNA,

zapoczątkowane w miejscach przyłączenia się primerów. Jest to pierwszy cykl reakcji PCR

6. Następnie temperaturę podnosi się, aby denaturować nowo powstałe nici DNA.
7. Reakcję przyłączania primerów i polimeryzacji powtarza się automatycznie, zazwyczaj 30-40-krotnie.

© Copyright by $taś

- 5 -

a. Powielanie kopii DNA leżących między zastosowanymi primerami jest możliwe tylko wówczas, gdy

nastąpiło połączenie primerów z homologiczną sekwencją w poszukiwanym kwasie nukleinowym.

8. Otrzymane DNA rozdziela się w żelu poliaktylamidowym lub agarozowym i uwidacznia w świetle UV przez

dodanie bromku etydyny.

9. O swoistości przeprowadzonej reakcji PCR można przekonać się, wykonując, hybrydyzację otrzymanego

produktu z sondą rozpoznającą zwielokrotnione fragmenty kwasu nukleinowego.

W przypadku wykrywania wirusów zawierających RNA w pierwszym etapie reakcji musi nastąpić
przepisanie informacji genetycznej na nić DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy (metoda RT PCR)