MORFOLOGIA DROBNOUSTROJÓW:

• opis komórki bakteryjnej (łącznie z jej strukturami)→badania mikroskopowe

• ⇓

kształt, wielkość, budowa komórki [cytoplazma+DNA+rybosomy

ułożenie, ściana komórkowa

sposób barwienia błona cytoplazmatyczna

elementy dodatkowe: otoczka,

rzęski, fimbrie, przetrwalniki,

ziarnistości,

plazmidy, transpozony,

• opis kolonii (hodowla na podłożach stałych !)

kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, „wyniosłość”, kolor, konsystencja, zapach, zawieszalność, inne: np.: typ hemolizy na podłożach z krwią:

- alfa - niecałkowita np.: Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)

- beta - całkowita np.: Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty)

- gamma - niecałkowita np.: Corynebacterium spp. (maczugowce)

• typ wzrostu na podłożach płynnych

bezwzględne tlenowce w postaci kożuszka

fakultatywne beztlenowce wzrost dyfuzyjny (w całej objętości podłoża)

bezwzględne beztlenowce w postaci osadu

Kształt i ułożenie:

Kulisty - ziarenkowce = ziarniaki:

dwoinki (Streptococcus pneumoniae - dwoinka zapalenia płuc),

paciorkowce (Streptococcus pyogenes - paciorkowiec ropotwórczy),

gronkowce (Staphylococcus aureus - Gronkowiec złocisty),

pakietowce = sześcianki (Sarcina spp.)

tetrady = czworaczki (Micrococcus luteus)

Cylindryczny - pałeczki (Escherichia coli - pałeczka okężnicy),

- laseczki (Bacillus anthracis - laseczka wąglika)

Ziarniakopałeczki (Yersinia pestis - pałeczka dżumy)

Maczugowce (Corynebacterium diphtheriae - Maczugowiec błonicy)

Spiralny - przecinkowce (Vibrio cholerae - przecinkowiec cholery),

- śrubowce (Spiryllum minor),

- krętki (Treponema pallidum - krętek blady)

Sposób barwienia w metodzie Grama:

Ziarenkowce - większość Gram-dodatnio (kolor fioletowy), wyjątek np.: Gram-ujemna dwoinka zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych - Neisseria meningitidis

Pałeczki - większość Gram-ujemna (kolor czerwony), wyjątek np.: Gram-dodatnia Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp.

Laseczki - Gram-dodatnie

Grzyby - Gram-dodatnie

Maczugowce - Gram-dodatnie

Bakterie spiralne - Gram-ujemne

Krętki - brak wybarwienia w metodzie Grama

Metody barwienia drobnoustrojów

• Bakterie prawie nie załamują światła, w związku z tym aby je uwidocznić trzeba użyć barwnych związków chemicznych - barwników:

• kwaśne służą zazwyczaj do barwienia cytoplazmy oraz składników

pozakomórkowych (eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna)

• zasadowe (auramina, błękit metylenowy, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny,

fuksyna zasadowa) wybarwiają głównie struktury jądrowe.

Preparat wykonujemy a) z materiału pobranego od chorego - preparat bezpośredni,

b) z 18-24h hodowli drobnoustrojów - preparat pośredni.

Techniki barwienia:

• proste Ⴎ 1 barwnik

• złożone Ⴎ Ⴓ 2 barwniki

• pozytywne Ⴎ barwienie struktur drobnoustrojów

• negatywne Ⴎ barwienie tła (nigrozyna, tusz chiński - barwniki grubodyspersyjne) - ocena kształtu i ułożenia komórek

• pozytywno-negatywne Ⴎ nigrozyna, tusz chiński + barwnik zasadowy - uwidocznienie otoczki

• specjalne Ⴎ wizualizacja dodatkowych struktur komórki np.: barwienie rzęsek (metoda Leifsona), ściany komórkowej, otoczki (metoda negatywna), przetrwalników(m. Wirtza-Conklina, Dornera), ziarnistości (m. Neissera)

METODY BARWIENIA

Przygotowanie preparatu (z hodowli) do barwienia:

⇒ przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym → kropla 0,85%NaCl + 1 kolonia bakteryjna

⇒ wysuszenie rozmazu (ogrzanie nie wyschniętego preparatu powoduje uszkodzenie komórki)

⇒utrwalenie preparatu (przeciwdziała zmyciu preparatu podczas barwienia, ułatwia wnikanie barwnika): metody fizyczne (3-4 krotne w płomieniu palnika) i chemiczne (95% etanol)

Typ barwienia	Przykład Zastosowanie		Barwnik Metodyka	Wynik
PROSTE	Metoda Löfflera		Błękit metylenowy - 5' Spłukać wodą	Jednolite niebieskie, (wyjątek Corynebacterium nierównomierne zabarwienie)
PROSTE	-		Safranina j. w.	Jednolite czerwone zabarwienie
PROSTE	-		Fiolet krystaliczny j. w.	Jednolite fioletowe zabarwienie
PROSTE	Negatywne Do obserwacji kształtu drobnoustrojów		Nigrozyna/tusz chiński → na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą barwnika, zrobić rozmaz 2-im szkiełkiem, wysuszyć	Tło ciemne, nie zabarwione (jasne) komórki
ZŁOŻONE	Pozytywno-negatywne obserwacja otoczek wg Burri-Ginsa metoda Dornera - barwienie przetrwalników		Nigrozyna + fuksyna fenolowa Ziehla 1-szy etap j. w., utrwalić w płomieniu, dobarwić fuksyną fenolową 1-2' (spłukać wodą) 1-szy etap j. w., dobarwić safraniną na gorąco!	Ciemne tło, jasne otoczki Czerwone komórki bakterii Ciemne tło, czerwone przetrwalniki
ZŁOŻONE	Metoda Grama - Podział bakterii na Gram - dodatnie i Gram - ujemne	Fiolet krystaliczny 2- 3' (spłukać wodą) Płyn Lugola 1-2' (spłukać) „odbarwiacz” 30'' (spłukać wodą) fuksyna zasadowa 30'' (spłukać wodą)		Gram (+) - fioletowe Gram (-) - czerwone Gram chwiejne - pośrednie między czerwonym a fioletowym (np. Corynebacterium)
ZŁOŻONE	Metoda Neissera - wybarwianie ziaren metachromatycznych (Babes-Ernsta) u Corynebacterium		Neisser I (roztwór bł. metylenowego) Neisser II (roztwór fioletu krystalicznego) zmieszać odczynniki 2:1 barwić 10', (spłukać wodą) Chryzoidyną 10-15”	Komórki bakterii - żółto-zielone, ziarna metachromatyczne - granatowe.
ZŁOŻONE	Metoda Waysona Do barwienia preparatów bezpośrednich		Barwnik Waysona - 2' (fiolet kryst.+ bł. metyl.) (spłukać wodą)	Komórki bakterii ciemno granatowe, inne np.: komórki nabłonkowe, leukocyty jasno-fioletowo-granatowe
ZŁOŻONE	Metoda Wirtza-Conklina - Do barwienia przetrwalników		Safranina/fuksyna - 5' (spłukać wodą) zieleń malachitowa na gorąco! (spłukać wodą)	Komórki bakterii czerwone, Przetrwalniki zielone
ZŁOŻONE	Metody dla bakterii kwasooprnych: Ziehl-Neelson (na gorąco!) Tan-Tien-Hok (na zimno) Kinyoun (na zimno)		Fuksyna karbolowa („do tzw. trzech par”) (delikatnie spłukać wodą), spłukać kwaśnym alkoholem błękit metylenowy 20” (spłukać wodą) Kinyoun 3' (spłukać) Gabett 1' (spłukać wodą) Fuksyna karbolowa 5' (spłukać wodą) spłukać kwaśnym alkoholem 3' (spłukać wodą) zieleń brylantowa 4' (spłukać wodą)	Bakterie kwasooporne np.: Mycobacterium - czerwone Tło i bakterie niekwasooporne - niebieskie. Efekt barwienia j. w. Bakterie kwasooporne czerwone Tło i bakterie niekwasooporne zielone

---