Techniki przygotowania i barwienia preparatów mikroskopowych.
Techniki mikroskopowania.
Struktury anatomiczne istotne w identyfikacji i diagnostyce drobnoustrojów.
Ocena morfologii drobnoustrojów.
TECHNIKA BARWIENIA
Bakterie prawie nie załamują światła, w związku z tym, aby je uwidocznić, należy użyć barwnych związków chemicznych. Barwienie jest procesem drastycznym, w trakcie którego następuje śmierć komórki. W większości metod, komórki barwią się jednolicie.
Stosowane barwniki możemy podzielić na:
Kwaśne - eozyna, fuksyna kwaśna
Zasadowe - błękit metylenowy, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny.
Barwienie ma na celu:
a) umożliwić obejrzenie układu przestrzennego morfologii i anatomii komórek
b) wykazać obecność bakterii w badanym preparacie
Przygotowanie preparatu z hodowli:
1. Przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym - pobrać jedną kolonię ezą i rozetrzeć na szkiełku.
2. Połączyć z kroplą 0,9% NaCl
3. Pozostawić do wyschnięcia
4. Utrwalić w płomieniu palnika
Metody barwienia:
Proste (jeden barwnik):
Pozytywne (barwią się komórki bakteryjne)
Negatywne (barwi się tło)
Złożone (kilka barwników):
Pozytywne (j. w. )
Pozytywno - negatywne (barwią się elementy komórek bakteryjnych i tło - metoda uwidaczniania otoczek)
Ocena morfologii komórki:
a) wynik barwienia
b) wielkość
c) układ
d) kształt komórki bakteryjnej
e) obecność i ułożenie rzęsek
f) obecność otoczki
g) obecność ciał zapasowych
h) obecność, kształt, wielkość, ułożenie przetrwalników
Typ barwienia |
Metoda |
Metodyka |
Wynik |
Proste - pozytywne |
Metoda Löfflera |
Błękit metylenowy - 5 min Spłukać wodą |
Jednolite niebieskie, (wyjątek Corynebacterium - zabarwione nierównomiernie) |
Proste - pozytywne |
Barwienie safraniną |
Safranina - 5 minut |
Jednolite czerwone zabarwienie |
Proste - negatywne |
Barwienie nigrozyną lub tuszem chińskim
|
Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą barwnika, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz |
Tło ciemne, niezabarwione drobnoustroje (otoczki) |
Złożone pozytywno - negatywne |
Barwienie otoczek wg Burri - Ginsa |
Nigrozyna + fuksyna fenolowa Ziehla Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą nigarozyny, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz. Dobarwić fuksyną fenolową - 1-2 min |
Ciemne tło, jasne otoczki, czerwone komórki bakteryjne |
Złożone pozytywno - negatywne |
Barwienie przetrwalników wg Dornera |
Na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą nigarozyny, drugim szkiełkiem wykonać rozmaz. Dobarwić safraniną na gorąco. |
Ciemne tło, czerwone przetrwalniki
|
Złożone - pozytywne |
Metoda Grama |
Fiolet krystaliczny - 2-3 min Spłukać wodą Płyn Lugola - 1-2 min Spłukać wodą Odbarwiacz Spłukać wodą Fuksyna zasadowa - 0,5 min Spłukać wodą |
Gram dodatnie - fioletowe Gram ujemne - czerwone
Gram chwiejne - czerwono- fioletowe (np. Corynebacterium)
|
Złożone - pozytywne |
Metoda Neissera Wybarwianie ziaren metachromatycznych (Babesa-Ernst'a) u Corynebacterium
|
Neisser I (roztwór błękitu metylenowego) Neisser II (roztwór fioletu krystalicznego). Zmieszać odczynniki w stosunku 2:1, barwić 10 min. Chryzoidyna 10 - 15 s
|
Komórki bakterii - żółto - zielone, ziarna metachromatyczne - granatowe.
|
Złożone - pozytywne |
Metoda Waysona Do barwienia preparatów bezpośrednich
|
Barwnik Waysona - 2 min (fiolet krystaliczny + błękit metylenowy)
|
Komórki bakterii ciemnogranatowe, inne np. nabłonki, leukocyty jasnofioletowo - granatowe
|
Złożone - pozytywne |
Metoda Wirtza-Conklina do barwienia przetrwalników
|
Safranina - 5 min Spłukać wodą Zieleń malachitowa na gorąco Spłukać wodą |
Komórki bakterii czerwone, Przetrwalniki zielone
|
Złożone - pozytywne |
Metody barwienia bakterii kwasoopornych: Ziehl - Neelsena |
Fuksyna karbolowa na gorąco Spłukać wodą Spłukać kwaśnym alkoholem
|
Bakterie kwasooporne - czerwone Tło i pozostałe bakterie - niebieskie
|
Złożone - pozytywne |
Metody barwienia bakterii kwasoopornych Kinyoun - Gabett'a |
Błękit metylenowy 20 min
|
Efekt barwienia j.w.
|
Złożone - pozytywne |
Metody barwienia bakterii kwasoopornych: Kinyoun
|
Barwnik Kinyoun - 3 min Barwnik Gabett'a Spłukać wodą Fuksyna karbolowa - 5 min Spłukać wodą Kwaśny alkohol- 3 min Spłukać wodą Zieleń brylantowa 4 min Spłukać wodą |
Bakterie kwasooporne czerwone Tło i pozostałe bakterie - zielone
|
BUDOWA KOMÓRKI BAKTERYJNEJ
struktury podstawowe
· ściana komórkowa
· błona cytoplazmatyczna
· cytoplazma
· rybosomy
· nukleoid
struktury dodatkowe
· otoczki
· rzęski
· fimbrie
· przetrwalniki
· wtręty komórkowe
· plazmidy
ŚCIANA KOMÓRKOWA
Zbudowana jest z peptydoglikanu (mureiny). Cząsteczka peptydoglikanu jest zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które łączą się w sieć za pomocą mostków peptydowych.
Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwuckrów:
→ N-acetyloglukozaminy
→ Kwasu N-acetylomuraminowego (występuje wyłącznie u organizmów prokariotycznych).
Do kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest tetrapeptyd Często w jego składzie spotyka się aminokwasy występujące jedynie u bakterii ( np. kwas mezodwu-aminopimelinowy, izomery D alaniny i kwasu gluta-minowego).
Wiązania krzyżowe peptydoglikanu powstają przez połączenie tetrapeptydów sąsiadujących łańcuchów mostkiem peptydowym
Wiązanie powstaje pomiędzy przedostatnią resztą jednego tetrapeptydu (przeważnie L-lizyna lub kwas mezodwuaminopimelinowy) a ostatnią resztą drugiego tetrapeptydu (zwykle D-alanina)
Mostki zbudowane są przeważnie z glicyny lub L -alaniny.
Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej dzielimy bakterie na Gram - dodatnie i Gram - ujemne.
Ściana komórkowa bakterii Gram - dodatnich
Grubość: 20 - 80 nm
Składa się w 60-100% z peptydoglikanu tworzącego trójwymiarową sieć. Złożony z linijnych polimerów N-acetyloglukozaminy i kw. N-acetylomuraminowego.
Peptydoglikan bakterii Gram - dodatnich może być hydrolizowany przez lizozym. Hydrolizowane jest wiązanie pomiędzy kw. N-acetylomuraminowym a N-acetyloglukozaminą.
U niektórych bakterii przy aminocukrach występują dodatkowe grupy O-acetylowych, które czynią peptydoglikan niewrażliwym na działanie lizozymu.
Charakterystycznymi składnikami ścian komórkowych bakterii Gram - dodatnich są także kwasy tejchojowe (rybitolowy i glicerolowy) ich obecność ma znaczenie taksonomiczne.
U niektórych bakterii Gram - dodatnich mogą występować w ścianach komórkowych polisacharydy i kwasy mykolowe
Białka ściany komórkowej np. białko M u Streptococcus pyogenes gr. A mogą być antygenami i warunkować właściwości chorobotwórcze bakterii.
Ściana komórkowa bakterii Gram - ujemnych
Grubość: 10 nm
Bardziej złożona budowa chemiczna i strukturalna
Składa się z czterech warstw:
1. Lipopolisacharyd
2. fosfolipidy
3. białka
4. peptydoglikan
Lipopolisacharyd (LPS), endotoksyna:
Heteropolimer zbudowany z trzech składowych
Lipid A
Oligocukier rdzeniowy - podobny u wszystkich bakterii Gram - ujemnych, często nazywany antygenem wspólnym (CA - common antigen) lub antygenem Kunina
Antygen somatyczny (antygen O): leży najbardziej zewnętrznie, składa się z podjednostek oligocukrowych
Jest odpowiedzialny za wiele objawów chorobowych u ludzi i zwierząt; najpoważniejszym z nich jest wstrząs endotoksyczny
Fosfolipidy - podobne do fosfolipidów błony komórkowej, tworzą dwie warstwy skierowane do siebie regionami hydrofobowymi.
Białka główne - wiążą się między sobą, z LPS i peptydoglikanem, tworzą kanały porynowe
Peptydoglikan: cieńszy, struktura dwuwymiarowa, bardziej elastyczny, nie występują mostki peptydowe tworzące wiązania krzyżowe, wiąże się z błoną cytoplazmatyczną wiązaniami jonowymi.
BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA
Wykazuje typową dla wszystkich błon elementarnych strukturę trójwarstwową i zbudowana jest z lipidów (20-35%) i białek (50-75%).
NUKLEOID
Obszar komórki prokariotycznej będący odpowiednikiem jądra komórkowego u Eukaryota.
Nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową.
Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA.
Niektóre funkcje organizmu (np. oporność na antybiotyki, synteza bakteriocyn) są kodowane przez plazmidy - samoreplikujące się, zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA.
Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki.
CYTOPLAZMA
Wodny roztwór związków wielkocząsteczkowych, soli mineralnych, cukrów prostych, aminokwasów, kwasów tłuszczowych i związków wysokoenergetycznych o charakterze koloidu, w którym zawieszone są biologicznie czynne struktury: nukleoid, plazmidy, rybosomy, materiał zapasowy (ziarnistości, wtręty, kryształki, kropelki).
RYBOSOMY
Rybosomy u Prokaryota są mniejsze niż u Eukaryota, mają niższą masę cząsteczkową i stałą sedymentacji Svedberga, wynoszącą 70S.
ZMIENNE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ
OTOCZKI
Chronią bakterie przed wyschnięciem, ułatwiają adhezję, chronią przed reakcją obronną zakażanego organizmu, mogą być czynnikiem zjadliwości.
Można je uwidocznić pod mikroskopem świetlnym stosując barwniki nie przechodzące przez materiał otoczkowy, np. nigrozynę, czerwień Kongo, tusz chiński. W technice barwienia negatywnego na ciemnym tle preparatu pojawiają się jasne otoczki.
RZĘSKI
Rzęski są to wyrostki o średnicy 12-18 nm i długości do 20 μm.
Za pomocą ciałka bazalnego są zaczepione jednym końcem w błonie cytoplazmatycznej.
Umiejscowienie i liczba rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne.
Obecność i ułożenie rzęsek na komórce:
ditrychalne (dwurzęse)
monotrychalne (jednorzęse)
lophotrychalne (czuborzęse)
jednobiegunowe
dwubiegunowe
perytrychalne (wkołorzęse)
FIMBRIE / PILE
Niektóre bakterie gram-ujemne mogą wytwarzać nitkowate, zakotwiczone w cytoplazmie wyrostki - fimbrie.
Są to długie, cienkie, proste nici o średnicy 3-25 nm, długości do 12 μm.
Grubsze wyrostki, zwane też pilami płciowymi (pilami typu F), służą podczas koniugacji do przenoszenia DNA.
PRZETRWALNIKI (ENDOSPORY)
Niektóre gatunki bakterii mają zdolność wytwarzania przetrwalników (rodzaje: Bacillus, Clostridium)
W razie występowania niekorzystnych warunków środowiska rozpoczyna się proces sporulacji, w którym następuje zagęszczenie protoplazmy, ustają procesy metaboliczne, zawartość przetrwalnika jest otaczana grubą ścianą.
Przetrwalniki są bardzo odporne na działanie niekorzystnych czynników fizycznych i chemicznych
Po zaistnieniu korzystnych warunków środowiskowych rozpoczyna się kiełkowanie (germinacja) przetrwalników.
Ułożenie przetrwalników:
Centralne
Paracentralne
Subterminalne
Termialne
5