Metabolizm bakterii

suma procesów biochemicznych zachodzących w komórce

-katabolizm

-anabolizm

1. Główne składniki komórki bakteryjnej

składnik	% suchej masy	źródło	funkcja
węgiel	50	związki organiczne lub CO2	główny składnik związków organicznych
tlen	20	H2O, związki organiczne	składnik związków organicznych, wody komórkowej, O2 jest akceptorem elektronów i bakterii oddychających tlenowo
azot	14	NH?	Składnik aminokwasów, kw. nukleinowych (nukleotydów), koenzymów
wodór	8	H2O, zw. org.	Główny składnik zw. org. i wody komórkowej
fosfor	3	Nieorg. fosforany (PO4)	Składnik kw. nukleinowych (nukleotydów), fosfolipidów, LPS, kw. tejchojowych
siarka	1	SO2, H2S, organiczne związki siarkowe	Składnik cysteiny, metioniny, glutationu, kilku koenzymów
potas	1	sole potasu	Ko faktory reakcji organicznych, nieorganiczne kationy
magnez	0,5		Składniki przetrwalników
wapń i żelazo	0,5 i 0,2		- // -

2. Podział bakterii uwzględniający źródła węgla i energii

typ bakterii	źródło energii	źródło węgla	przykłady
fotoautotrofy		CO2	Cyanobacteria
fotoheterotrfy		CRG	bakterie zielone, purpurowe
chemoautotrofy	N-CRG	CO2	Bakterie nitryfikacyjne, siarkowe, żelaziste
chemoheterotrofy	ORG	ORG	Większość bakterii, w tym patologiczne dla człowieka

3. Czynniki wzrostu

1) puryny i pirymidyny - synteza kwasów nukleinowych DNA i RNA

2) aminokwasy - biosynteza białek

3) witaminy, koenzymy, grupy funkcjonalne niektórych enzymów

4. Szlaki pozyskiwania energii

-szlak Embdena-Meyerohofa-Parnasa (EMP)

-szlak Entnera-Doudorffa (ED)

* jednakowe dla bakterii tlenowych i beztlenowych (do momentu wytworzenia kw. pirogronowego)

5. Mikroorganizmy rozkładają składniki odżywcze w celu uzyskania energii (w postaci ATP) na drodze:

-oddychania

-fermentacji

-b. beztlenowe - 2 cząsteczki ATP

-b. tlenowe - 34 - // -

6. Oddychanie:

-bardziej wydajne niż fermentacja

-szybkie i całkowite utlenianie składników organicznych do dwutlenku węgla

-transport elektronów przez cytochromy

-fosforylacja oksydatywna ADPATP

-końcowy akceptor elektronów:

-O₂ - oddychanie tlenowe

-związki nieorganiczne - np. S₂O₃^2- - oddychanie beztlenowe

-kataliza i oksydacja cytochromowa - wpływa na zużycie tlenu w komórka oddychających tlenowo

7. Fermentacja

-alkoholowa

-mlekowa

-masłowa

-octanowa

8. Fermentacja - zastosowanie:

bakterie	zastosowanie
kwasu mlekowego	fermentowane napoje mleczne, sery, dekstran
przetrwalnikujące	enzymy, antybiotyki, aceton, butanol
promieniowce	antybiotyki, enzymy
fermentacji alkoholowej	etanol
kwasu octowego	ocet, utlenianie sorbitolu
kwasu propionowego	kwas propionowy, wit. B12, serowarstwo

9. Cechy umożliwiające identyfikację bakterii:

-morfologia

-skład chemiczny ściany komórkowej

-obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych

-zdolność do tworzenia pigmentów

-sposób odżywiania

-wymagania pokarmowe

-źródła C, N, S

-skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji

-wymagania tlenowe

-zakres temperatur i pH wzrostu

-wrażliwość na antybiotyki

-patogenność

-zależności symbiotyczne z innymi organizmami

-środowisko występowania

-obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)

-sekwencja DNA genomowego

10. Różnicowanie drobnoustrojów

11. Metody identyfikacji mikroorganizmów

Podział metod identyfikacji mikroorganizmów

1. biochemiczne

2. biofizyczne

3. biologii molekularnej

4. immunochemiczne

12. Identyfikacja w oparciu o cechy biochemiczne

Reakcje badane:

-zdolność do wzrostu przy wykorzystaniu określonych substratów jako jedynego źródła węgla,

-wytwarzanie określonych produktów ze znanych substratów,

-wytwarzanie gazu,

-fermentacja określonych cukrów,

-wytwarzanie określonych enzymów.

13. Oksydaza

-przenoszenie elektronów przez cytochrom C

-wykrywanie za pomocą odczynnika tetrametylo-parafenylo-diaminy

-reakcja dodatnia - granatowe lub fioletowe zabarwienie kolonii

-reakcja ujemna - zabarwienie inne niż w reakcji dodatniej

-zaleta: szybkie wykonanie, wyraźne wyniki - łatwy odczyt

-przydatność: wstępne różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych, ziarniaków Gram-ujemnych od Gram-dodatnich

- przykład drobnoustrojów oksydazo-dodatnich:

Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Neisseria spp., Moraxella spp., Candida spp.

14. Katalaza

-bierze udział w inaktywowaniu toksycznych form tlenu

2e 4H+ SD

2O₂2O₂^* 2H₂O₂

katalaza O₂

2H₂O₂2H₂O

-wykrywanie - dodanie 3% nadtlenku wodoru do kolonii wyrosłych w czasie >24h na podłożu innym niż agar krwawy

-reakcja dodatnia - wydzielanie tlenu w postaci „bąbelków” (pieni się po dodaniu odczynnika)

-zastosowanie: różnicowanie ziarenkowców Gram-dodatnich, Staphylococcus spp. - dodatnie, Streptococcus spp. - ujemne

15. Fermentacja Durhama

-substraty: glukoza, laktoza

-wskaźnik: czerwień fenolowa

* gaz -, kwas -

* gaz -, kwas +

*gaz +, kwas +

- pałeczki jelitowe

16. Enzymy zewnątrzkomórkowe

-enzymy hydrolityczne - katalizują reakcje rozkładu makrocząsteczek z uwolnieniem cząsteczki wody

-esterazy, lipazy - lipidy

-glikozydazy - polisacharydy

-proteinazy - białka

-deoksyrybonukleazy - DNA

-wykrywanie: dodanie substratu dla enzymu do podłoża (odczyt bezpośredni lub po dodaniu odczynnika)

17. Glikozydazy

-aktywność amylazy i maltazy wykrywa się stosując podłoże zawierające skrobię

-po inkubacji szczepów na podłożu nakrapia się płyn Lugola (I w KI)

*reakcja dodatnia - przejaśnienia na około kolonii (posiew)

*reakcja ujemna - kolor fioletowy

Polisacharydy: -celuloza - celulaza

18. Proteinazy

-rozkład białek do oligosacharydów i aminokwasów

-aktywność wykrywa się na podłożach z kazeiną (24/48h)

-reakcja dodatnia - strefa przejaśnienia wokół i pod kolonią (rozkład kazeiny przez kazeinazę)

- brak reakcji dodatniej - brak przejaśnienia

19. Test na upłynnienie żelatyny

-aktywność żelatynazy

-substrat: żelatyna

-inkubacja 48h w temperaturze 37^oC

-schłodzenie

-reakcja dodatnia - żelatyna przechodzi w stan płynny do 30 min. od końca inkubacji

-reakcja ujemna - żelatyna nie jest upłynniona

20. Deoksyrybonukleaza (DNA-za)

-wykrywanie aktywności na podłożu zawierającym DNA

-inkubacja 24/48h

-dodanie 0,1M HCl

-reakcja dodatnia - przejaśnienie wokół kolonii po dodaniu HCl

-reakcja ujemna- DNA precypituje pod wpływem HCl

21. Rozkład lipidów

Zdolność rozkładu lipidów - potencjalny wskaźnik inwazyjności drobnoustrojów:

-błony komórkowe zwierząt zbudowane są głównie z fosfolipidów

-lipazy

np. test na wykrywanie zdolności wytwarzania lecytynazy rozkładającej fosfolipidy - lecytynę

-opalizująca strefa wokół szczepów świadczy o wyniku dodatnim

22. Esterazy

-wykrywanie na podłożu zawierającym lipidy

-inkubacja 24/48h

-indykator reakcji - błękit spirytusowy

-reakcja dodatnia - przejaśnienie lub ciemna strefa wokół kolonii

-reakcja ujemna - brak przejaśnienia

23. Metabolizm azotu

-białka strukturalne i enzymatyczne

-puryny i pirymidyny

-składniki nieorganiczne (donory lub akceptory elektronów)

- wykrywanie mocznika jako źródła azotu

-test na wykrywanie ureazy

-substrat - mocznik

-odczynnik - czerwień fenolowa

-„+” - kolor czerwony

-„-„ - inny kolor

24. Redukcja azotanów:

-substrat - azotany

-odczynnik - kwas sulfanilowy, dimetyl-alfa-naftylamina

-reakcja dodatnia - kolor czerwony po dodaniu odczynnika

-reakcja ujemna - kolor inny niż czerwony

25. Identyfikacja w oparciu o cechy biochemiczne:

-dawniej stosowano szeregi biochemiczne złożone z kilku-kilkunastu podłóż specjalnych na płytkach lub w probówkach

-obecnie te metody stosowane są w ośrodkach referencyjnych

-w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej wykorzystuje się gotowe panele biochemiczne, np. API, ID, SPECTOR lub systemy półautomatyczne i automatyczne.

26. Zalety mikrometod:

-mniej czaso- i pracochłonne

-umożliwiają szybszą diagnostykę i identyfikację oraz ocenę lekowrażliwości

-oznaczanie wielu prób z zastosowaniem niewielkich ilości odczynników

-duża wiarygodność i powtarzalność uzyskanych wyników

27. Metody biofizyczne

Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznacznie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych

-Techniki elektroforetyczne

-Techniki oparte na chromatografii gazowej

28. Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych

-analiza profili białkowych

-skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych

-sposób postępowania:

-izolacja białek komórkowych

-rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym

-barwienie rozdzielonych białek

-porównanie z profilami białkowymi bazy danych

Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmów.

29. Identyfikacja drobnoustrojów w oparciu o chromatografię gazową

-analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej

-skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny

*analiza ilościowa - określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

*analiza jakościowa - obecność specyficznych kwasów tłuszczowych

*zarówno ilościowy jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez DNA genomowy i nie ma na niego wpływu

30. Różnicowanie prątków na podstawie różnic w składzie kwasów mikolowych

-wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC)

-najlepsza metoda identyfikacji prątków

-czułość 98%

-swoistość 100%

-warunek - uzyskanie szczepu w hodowli

-po ekstrakcji kwasów mykolowych przeprowadza się ich rozdział na specjalnych kolumnach, a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla danego gatunku prątka

-wada: wymagania sprzętowe

31. Metody biologii molekularnej

Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych

-metody hybrydyzacyjne

-metody oparte o technikę PCR

~odcinki genomu na stabilnym DNA:

* sekwencje kodujące białka istotne w metabolizmie bakterii (housekeping genes)

* odcinki DNA wysoce konserwatywne, charakterystyczne dla gatunku

Zastosowanie:

-identyfikacja drobnoustrojów

*trudnych w hodowli, niehodowanych (Helicobacter pylori, Neisseria?, Borrelia?, Chlamydia?, Mycoplasma?)

*długorosnących (Mycobacterium MTC)

*wymagających w hodowli specjalnych systemów zabezpieczeń

-broń biologiczna (Bacillus anthracis, Brucella melitensis,Yersenia pestis, Burkholderia mallei, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Coxiella burneti)

-wykrywanie markerów lekooporności

-drobnoustroje istotne epidemiologicznie

* gen Meca u metcilinoopornych szczepów S. aureus

-drobnoustroje długorosnące trudne w hodowli

-porównanie szczepu, analiza pokrewieństwa (RFLP, PFGE)

32. Metody hybrydyzacyjne

Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych

-sondy to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu

-kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany:

*radioaktywnym fosforem (32P) lub wodorem (3H)

*barwnikiem fluorescencyjnym (hybrydyzacja FISH)

*enzymem

-------------------------------

Dot blot

Southern blofting

FISH (in situ) - hybrydyzacja fluorescencyjna in situ umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

33 Metody wykorzystujące technikę PCR

Technika PCR - enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów

-gen kodujący

Odmiany PCR stosowane najczęściej w mikrobiologii

-gniazdowy PCR

-większa specyficzność niż w klasycznym PCR

-produkty amplifikacji pierwszej pary substratów są matrycą dla drugiej pary

-odwrócony PCR

-matryca - mRNA

-multiplex PCR

-kilka par starterów jednocześnie

-RT-PCR (real time), PCR w czasie rzeczywistym (oznaczanie liczby kopii genów)

Sposób postępowania:

- amplifikacja fragmentu DNA

- sekwencjonowanie

- porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów (5% różnica)

1

katabolizm

duże

cząsteczki

budowa

antygenowa

skład ściany komórkowej

anabolizm

małe

cząsteczki

+

energiaa

budowa

genomu

właściwości

biochemiczne

Różnicowanie

drobnoustrojów

O = C

NH₂

NH₂

Ureaza, H₂ O

O

2 NH₃ + CO₂

NO₃ → NO₂ → NH₃ lub N₂

---