BAKTERIOCYNY.

 

Bakteriocyny są białkowymi substancjami o działaniu antybiotycznym charakteryzującymi się następującymi cechami:

• Wąskie spektrum działania ograniczone do szczepów tego samego gatunku, co producent bakteriocyny oraz wobec bakterii blisko z nim spokrewnionych;

• Zdolność do wiązania się z receptorami na powierzchni wrażliwych komórek;

• Obecność komponenty peptydowej warunkującej aktywność przeciwbakteryjną;

• Działanie bakteriobójcze;

• Lokalizacja genów warunkujących wytwarzanie bakteriocyny, a także czynnika odpowiedzialnego za odporność komórki na własną bakteriocynę na plazmidzie.

Bakteriocyny są wytwarzane przez zarówno bakterie Gram - ujemne jak i Gram - dodatnie.

ANTYBIOTYKI.

Antybiotyki są substancjami o działaniu przeciwbakteryjnym wytwarzanymi przez drobnoustroje (bakterie, grzyby) albo otrzymywanymi syntetycznie lub półsyntetycznie. Mają one zdolność hamowania wzrostu lub zabijania takich mikroorganizmów jak bakterie, grzyby i niektóre pierwotniaki. Nie są natomiast skuteczne przeciw wirusom! Antybiotyki interferują z procesem replikacji, transkrypcji, translacji, syntezą ściany komórkowej, a także mogą hamować czynności błony komórkowej. Dobry antybiotyk nie może być toksyczny dla organizmu człowieka ani działać na niego alergizująco. Antybiotyki powinny być chemicznie trwałe, a także dobrze rozpuszczać się w wodzie, soli fizjologicznej i soku żołądkowym. Ponadto, antybiotyki powinny wykazywać dobrą przenikalność z przewodu pokarmowego do tkanek nie ulegając przy tym degradacji.

Spektrum działania antybiotyków
Szerokie	Wąskie
Antybiotyk wykazuje aktywność zarówno w stosunku do bakterii G(+) jak i G(-).	Antybiotyk wykazuje aktywność jedynie w stosunku do wąskiej grupy bakterii (nawet jednego gatunku).
Ampicylina, chloramfenikol, tetracyklina.	Penicylina G, bacytracyna, wankomycyna.

Bakteriobójcze	Bakteriostatyczne
Penicyliny, bacytracyna, cefalosporyny (działają tylko na komórki rosnące) wankomycyna Antybiotyki aminoglikozydowe: gentamycyna, kanamycyna, neomycyna, streptomycyna, nowobiocyna	Chloramfenikol, tetracykliny, kwas nalidyksowy Antybiotyki makrolidowe

Wykonanie posiewu redukcyjnego.

Posiew redukcyjny wykonuje się na podłożu agarowym na płytkach Petriego.

Julius Petri był współpracownikiem Roberta Kocha. W 1887 roku wynalazł to proste naczynie do hodowli bakterii, stosujemy je do dziś (na rysunku dolna część płytki Petriego).

Posiew redukcyjny umożliwia uzyskanie czystej kultury bakterii, na prawidłowo posianej płytce po całonocnej inkubacji można zaobserwować pojedyncze kolonie bakterii. Każda kolonia to potomstwo jednej bakterii, aby była widoczna gołym okiem, kolonia bakteryjna musi zawierać około 10⁷ komórek. Posiew redukcyjny zwykle stosuje się do przesiewania bakterii z podłóż stałych.

Należy pamiętać, że każdorazowo przed rozsianiem materiału opalamy ezę w płomieniu palnika!!! Materiał mikrobiologiczny nanosimy tylko raz, później jedynie go rozprowadzamy jałową ezą po całej powierzchni płytki.

Wykonanie posiewu w postaci murawy bakterii.

Na płytkę z agarem należy nanieść 0,1 ml płynnej hodowli bakterii. Zawiesinę rozetrzeć jałową głaszczką po całej powierzchni podłoża. W ten sposób po całonocnej inkubacji uzyskujemy murawę bakterii.

Posiew murawowy stosuje się:

• Do określania miana hodowli bakteryjnej - przy wysokim stopniu rozcieńczenia hodowli (~ 10^-6) uzyskuje się pojedyncze kolonie bakteryjne,

• Oznaczania wrażliwości bakterii na chemoterapeutyki,

• W celu uzyskania maksymalnej liczby transformantów,

• W celu uzyskania maksymalnej liczby transduktantów,

Posiew kłuty wykonuje się wkłuwając ezę w słupek.

Posiew rysowy przeprowadza się na powierzchni skosu agarowego Bakterie inkubuje się w cieplarkach. Właściwie wszystkie bakterie, którymi zajmujemy się na ćwiczeniach należą do organizmów mezofilnych - optimum wzrostu w temperaturze 37^oC. Po inkubacji płytki przechowywane są w chłodni (lodówce, temp od + 4 do + 10^oC). W chłodni przechowuje się także wszystkie jałowe pożywki mikrobiologiczne

Nanieść bakterie na szkiełko podstawowe.

• W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli lub pobrać odrobinę bakterii jałową ezą, (czyli wyżarzoną w płomieniu palnika) i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka.

• W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podłożach stałych należy materiał pobrać jałową ezą, (czyli wyżarzoną w płomieniu palnika), następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe.

Zabiegi te mają na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt gęstej zawiesiny. Po wysuszeniu utrwalić preparat przez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Należy uważać, żeby nie trwało to zbyt długo i żeby bakterii nie przypalić!!! Na utrwalone bakterie nakropić fiolet krystaliczny w ten sposób by pokrył on powierzchnię, na którą naniesiono bakterie. Barwnik pozostawić na 2 minuty. Po tym czasie zmyć fiolet wodą destylowaną. Nanieść płyn Lugola na 1 minutę. Płyn spłukać obficie najpierw alkoholem etylowym, a później wodą destylowaną. Nanieść na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40 sekund. Po tym czasie spłukać szkiełko wodą destylowaną i wysuszyć preparat. Przed umieszczeniem na stoliku mikroskopu nanieść na szkiełko kroplę olejku immersyjnego. Oglądać używając obiektywu dającego stukrotne powiększenie. Bakterie określane jako Gram (+) barwią się na kolor niebiesko - fioletowy, bakterie G (-) na czerwono różowy

Metoda Grama.

Barwienie bakterii metodą Grama pozwala wyodrębnić dwie zasadniczo odmienne grupy bakterii. Jakkolwiek sama metoda barwienia wykorzystuje różnicę w budowie ściany komórkowej bakterii, to tak się szczęśliwie składa, że bakterie Gram - dodatnie i Gram - ujemne różnią się pod wieloma innymi względami. Nie wszystkie obecnie poznane bakterie możemy bezpośrednio zaklasyfikować do bakterii Gram-dodatnich lub ujemnych. Należą do nich np. mykoplazmy (Mycoplasma), które nie posiadają ściany komórkowej. Ponadto niektóre bakterie bardzo słabo wybarwiają się metodą Grama i w związku z tym do ich identyfikacji nie stosuje się tej metody barwienia. Tak się dzieje w przypadku

• Mykobakterii (Mycobacterium), które określamy je jako kwasooporne, gdyż raz zabarwione fuksyną karbolową, nie odbarwiają się pod wpływem kwaśnego alkoholu (95 % ETOH, 3 % HCl). Bakterie te barwi się metodą Ziehl - Nielsena,

• Krętków (Treponema, Borrelia),

Należy także pamiętać, że bakterie, których nie zaliczamy do bakterii Gram - dodatnich, także mogą się wybarwiać na niebiesko. Przykładem są archebakterie (pseudomureina). Podobnie, ze względu na obecność ściany komórkowej, Gram - dodatnio wybarwiają się niektóre komórki eukariotyczne np. drożdżaków Candida i Saccharomyces, (co mogliście zaobserwować na ćwiczeniach).

Gram - chwiejność.

Zjawisko Gram - chwiejności dotyczy głównie bakterii Gram - dodatnich z rodzaju Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium. Pewne gatunki bakterii rosnąc w „starej” hodowli (późne fazy wzrostu, zwykle około 8 - 10 godz.) tracą swoją cechę barwliwości. Dzieje się tak na skutek wyczerpania się w pożywce składników niezbędnych do syntezy ściany komórkowe (są to dla bakterii warunki stresowe). Podobnie zachowują się bakterie podczas podziału (etap wytwarzania przegrody podziałowej). Bakterie Gram - zmienne (Gram - chwiejne) oznaczone są gwiazdką

Kiedy bakterie Gram-dodatnie nie są niebieskie.

Działanie czynników, które zaburzają proces syntezy ściany komórkowej (np.: penicylina) bądź uszkadzają ścianę komórkową (lizozym) powoduje, że bakterie Gram - dodatnie barwią się ujemnie.

1

---