Rodzina Brucellaceae

Brucella:

*gram -

*małe, pałeczki o wyglądzie zarniako-pałeczek (ułożone pojedynczo,rzadziej prami lub w krótkie łańcuszki)

*brak rzęsek -> nieruchliwe

*nie wytwarzają przetrwalników, ani otoczek

*tlenowe aczkolwiek wiele szczepów, szczególnie w pierwszym pasażu izolacyjnym wymaga obecności do 10% CO₂ w atmosferze.

*słabo kwasoodporne - barwią się zmodyfikowaną metodą Ziehl-Neelsena na czerwono

*słabo rośnie na podłożach podstawowych - najczęściej do wzbogacenia stosuje się:

->Krew, surowicę, glicerol, wyciąg wątrobowy,pepton tryptozowy

dodatek surowicy do podłoży jest nie tyle elementem ich wzbogacenia ole sposobemneutralizowania inhibitorów wzrostu obecnych w piększości peptonów podłoży podstawowych.]

*agar ziemniaczany wzmaga wzrost brucelli

*rosną stosunkowo wolno 3-6 dni, a przy izolacji z materiału chorobowego wzrost może nastąpić dopiero po 2-3 tygodniach

* brucella jest pasożytem wewnątrzkomórkowym, człowiek zakaża się wszystkimi gatunkami brucella oprócz B.ovis

*zarazki są oporne na czynniki środowiska, dobrze znoszą niską temperaturę

*utrzymują się przy życiu w wodzie, glebie, pyle, produktach mlecznych do 30-40 dni a w tkankach i wydzielinach nawet do 120dni w temp pokojowej w lodach do miesiąca

KOLONIE:

1.na agarze:

• Forma S:

• Okrągłe,

• Gładkie,

• Błyszczące,

• Barwy szarej

• Forma R:

• Płaskie

• Brzeg nieregularny

• Ziarnista powierzchnia

2.Podłoże płynne:

*delikatne zmętnienie

*nieznaczny osad - przez dłuższej inkubacji staje się lepki i śluzowaty (1-3 tygodni)

ANTYGENY:

• Pałeczki Brucella zawierają dwie substancje antygenowe A i M ( występują na powierzchni kom. i decydują o odczynie aglutynacji)

• U B. ovis - Z

CHOROBOTWÓRCZOŚĆ:

B. abortus - głównie ronienie zakaźne bydła (może być chorobotwórcza dla ludzi) - charakterystycznym objawem jest ronienie, może występować także zatrzymanie łożyska, jałowość, zapalenie wymienia. U zw. Nie ciężarnych wywołuje schorzenia wymienia, węzłów chłonnych i jądra samców.

B. suis - przede wszystkim chorobotwórcza dla świń (może wywoływać brucellozę ludzi)

B. melitensis - pałeczka gorączki maltańskiej; wywołuje schorzenia kóz, owiec i ludzi w krajach o ciepłym klimacie(basen morza śródziemnego)

B. neotomae- izolowana od szczura pustynnego, niechorobotwórcza

B.ovis- powoduje zapalenie najądrzy u tryków, moga chorować samice, nie przenosi się na człowieka(przenosi się drogą płciową)

B. canis - patogenny dla psów, infekcja przenosi się na człowieka,u suk chroniczna niepłodność, sporadycznie może dochodzić do zakażenia człowieka

• U osobników męskich zapalenie jąder

• Zakażone krowy wydalają pałeczki Brucella z wodami płodowymi, łożyskiem, siarą, mlekiem, niekiedy moczem

• Czynnikami chorobotwórczymi są endotoksyna i wielocukier zewnętrznej części ściany kom., który wiąże się z limfocytami B

PATOGENEZA:

*Źródłem zakażenia są chore zwierzęta, ich wydaliny w okresie ronienia, mleko i produkty

mleczne, rzadziej mięso

*Zakażenie następuje drogą pokarmową, płciową, przez uszkodzoną skórę

*Po wniknięciu do organizmu jest pochłaniana przez kom. fagocytujące w których namnaża się i trafia do regionalnych węzłów chłonnych i następnie przewodem piersiowym do krwi, a z nią do narządów miąższowych i stawów

*wykazuje szczególne powinowactwo do ciężarnej macicy a zwłaszcza do omoczni

• Tu znajduje sie erytrol i hormony sterydowe co ułatwia bakteriom namnażanie się - erytrol nie występuje w łożysku człowieka

• W wyniku namnożenia się zarazków dochodzi do zaburzeń odżywiania płodu, jego zakażenia i obumarcia, co objawia się ronieniem

*U zwierząt nieciężarnych B. abortus atakuję wymię, węzły chłonne nadwymieniowe

*Choroba przechodzi II etapowo:

• I etap: faza ostra występuje gorączka falującą.

• II etap: przewlekły w narządach miąższowych tworzą sie ziarniaki, które ulęgają zropieniu i serowaceniu przypominają zmiany gruźlicze

DIAGNOSTYKA:

1. Materiał do badań

• łożysko, wody płodowe, martwe płody (a szczególnie ich żołądki), siarę, krew, jądra i najądrze, sperma, gruczoł mlekowy, węzły chłonne nadwymieniowe

2. Badanie mikroskopowe

• Rozmazy barwimy zmodyfikowana metoda Ziehl-Nielsena

• W mikroskopie widoczne są skupiska czerwonych ziarniako-pałeczek

3. Badanie hodowlane

• Zawsze przy pierwszych posiewach należy zapewnić warunki tlenowe z dodatkiem 5-10% CO₂.

• Hodowle inkubuje sie w 37 C przez przynajmniej 15 dni.

• Podłoża musza być bardzo bogate zawierające peptony, surowice bydlęcą lub końską, wyciągi z wątroby, z drożdży.

• Kolonie są bardzo drobne, szpilkowate, z czasem mętnieją.

4. Badania serologiczne

• Do wykrywania swoistych przeciwciał, jak również wykazania antygenu w badanym materiale

• Przeciwciał przeciwko pałeczkom Brucella szuka się najczęściej w surowicy i mleku

• Aglutynacja z surowicą, odtłuszczonym mlekiem lub serwatką - odczyn Wrighta

• OWD - pozwala na potwierdzenie wyniku uzyskanego metoda aglutynacji i na odróżnienie zwierząt chorych od zdrowych - szczepionych przeciwko brucelozie

• Wynik dodatni tylko w odczynie aglutynacji - najprawdopodobniej zwierzę jest zdrowe ale szczepione przeciw brucelozie

• Odczyn antyglobulinowy lub hemaglutynacji pośredniej - przy braku rozpozna po zastosowaniu odczynu aglutynacji i OWD

• Próba pierścieniowa - z pełnym (nieodtłuszczonym mlekiem)

• Do próbki mleka dodaje się barwny antygen (pałeczki z rodzaju Brucella)

• Jeżeli w mleku znajdują się swoiste przeciwciała, antygen łączy się z nimi tworząc większe konglomeraty, które są wynoszone na kuleczkach tłuszczu na powierzchnie

• Powstaje barwny pierścień

• Nie należy do próby pobierać mleka o krów w ostatnich 3 miesiącach przed wycieleniem, przez 3 tygodnie po porodzie oraz od sztuk szczepionych

• Odczyn Holta - do wykrywania obecności pałeczek w treści żołądka poronionego płodu

5. Badania biologiczne

• na świnkach morskich

• 2 świnki zakaża sie badanym rozcierem badanego materiału domięśniowo.

• Począwszy od 2 tygodni po zakażeniu bada się ich krew na obecność przeciwciał anty Brucella.

• Po 3 tygodniach usypia sie jedna świnkę a po 6 druga

• Sekcyjnie stwierdza się obrzęki stawów, węzłów chłonnych i śledziony, zmiany ziarninowe.

6. Badanie alergiczne

• Test śródskórny

Testy biochemiczne - BIOTYPOWANIE Brucella:

1. Zapotrzebowanie na CO_2:

• hodowanie w warunkach tlenowych z 5-10% CO₂

2. Wytwarzanie H₂S:

• na specjalnym agarze skośnym z paskiem testowym bakterie hoduje sie 4 dni. Zaczernienie- dodatnim wyniku - Brucella abortus (ma zdolność do wytwarzania H₂S)

3. Aktywność ureazy na podłożu Kristensena:

• na skutek rozkładu mocznika do amoniaku kolor podłoża zmienia sie na różowy. Brucella ovis.

4. Barwienie tioniną (niebieski kolor) fuksyną zasadową (czerwony):

• barwniki dodaje sie do agaru, jeśli widoczny jest wzrost bakterii wynik dodatni.

5. Aglutynacja z monospecyficznymi surowicami:

• B. melithensis, abortus i sius kiedy rosną w formie gładkiej posiadają antygeny powierzchniowe N i A.

• Aby przeprowadzić próbę, zawiesinę bakterii należy ogrzewać w 60 C przez 14min, po czym krople zawiesiny miesza sie z kropla surowicy wzorcowej, aglutynacja wychodzi natychmiast.

6. Typowanie przy udziale fagów:

• przygotowuje sie kolejne rozcieńczenia bilisi-fagów i miesza sie z zawiesiną bakteri:

• następuje liza bakterii i płyn staje sie klarowny.

• Próba jest dodatnia dla Brucella abortus i suis.

7. Testy oksydatywnego metabolizmu:

• określa sie zużytkowanie tlenu przez pałeczki Brucella w obecności określonych węglowodanów i aminokwasów.

• Próbę przeprowadza sie w specjalnym aparacie Wartburga

8. Próba biologiczna na świnkach morskich:

• 2 świnki zakaża sie badanym rocie rem badanego materiału domięśniowo.

• Począwszy od 2 tygodni po zakażeniu bada się ich krew na obecność przeciwciał anty Brucella.

• Po 3 tygodniach usypia sie jedna świnkę a po 6 druga

• Sekcyjnie stwierdza się obrzęki stawów, węzłów chłonnych i śledziony, zmiany ziarninowe.

Metoda zmodyfikowana metoda Ziehl-Neelsena (MZN)

Metoda służy do barwienia bakteri MZN-dodatnich, barwią sie na kolor jasno czerwony inne bakterie na niebiesko.

Tok barwienia:

1.termicznie utrwalony preparat barwić rozcieńczoną fuksyną jak przy metodzie Grama przez ok 15min

2.usunąć barwnik przy przechylaniu szkiełka i nalać 0,5% r-r kwasu octowego na 15s

3.usunąć poprzedni odczynnik przez przechylenie szkiełka i nalać błękit metylenowy Lofflera przez 2min

4.spłukać wodą destylowaną i wysuszyć

wynik: metoda jest zalecana do barwienia bakterii o nieznacznym podwyższonej oporności na przenikanie barwnika.