opis kolonii (hodowla na podłożach stałych !)kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, „wyniosłość”, kolor, konsystencja, zapach, zawieszalność, inne: np.: typ hemolizy na podłożach z krwią

typ wzrostu na podłożach płynnychbezwzględne tlenowce w postaci kożuszka fakultatywne beztlenowce wzrost dyfuzyjny (w całej objętości podłoża) bezwzględne beztlenowce w postaci osadu

Kształt i ułożenie:

Kulisty - ziarenkowce = ziarniaki: dwoinki (Streptococcus pneumoniae - dwoinka zapalenia płuc), paciorkowce (Streptococcus pyogenes - paciorkowiec ropotwórczy),

gronkowce (Staphylococcus aureus - Gronkowiec złocisty),pakietowce = sześcianki (Sarcina spp.)tetrady = czworaczki (Micrococcus luteus)

Cylindryczny - pałeczki (Escherichia coli - pałeczka okężnicy), laseczki (Bacillus anthracis - laseczka wąglika), Ziarniakopałeczki (Yersinia pestis - pałeczka dżumy), Maczugowce (Corynebacterium diphtheriae - Maczugowiec błonicy),

Spiralny - przecinkowce (Vibrio cholerae - przecinkowiec cholery), śrubowce (Spiryllum minor), krętki (Treponema pallidum - krętek blady)

Sposób barwienia w metodzie Grama: Ziarenkowce - większość Gram-dodatnio (kolor fioletowy), wyjątek np.: Gram-ujemna dwoinka zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych - Neisseria meningitidis, Pałeczki - większość Gram-ujemna (kolor czerwony), wyjątek np.: Gram-dodatnia Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp. Laseczki - Gram-dodatnie, Grzyby - Gram-dodatnie, Maczugowce - Gram-dodatnie, Bakterie spiralne - Gram-ujemne, Krętki - brak wybarwienia w metodzie Grama

Metody barwienia drobnoustrojów Bakterie prawie nie załamują światła, w związku z tym aby je uwidocznić trzeba użyć barwnych związków chemicznych - barwników: kwaśne służą zazwyczaj do barwienia cytoplazmy oraz składników

pozakomórkowych (eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna), zasadowe (auramina, błękit metylenowy, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny, fuksyna zasadowa) wybarwiają głównie struktury jądrowe. Preparat wykonujemy a) z materiału pobranego od chorego - preparat bezpośredni, b) z 18-24h hodowli drobnoustrojów - preparat pośredni. Techniki barwienia: proste Ⴎ 1 barwnik, złożone Ⴎ Ⴓ 2 barwniki, pozytywne Ⴎ barwienie struktur drobnoustrojów, negatywne Ⴎ barwienie tła (nigrozyna, tusz chiński - barwniki grubodyspersyjne), pozytywno-negatywne Ⴎ nigrozyna, tusz chiński + barwnik zasadowy, specjalne Ⴎ wizualizacja dodatkowych struktur komórki np.: barwienie rzęsek, ściany komórkowej, otoczki, przetrwalników, ziarnistości

METODY BARWIENIA

Przygotowanie preparatu (z hodowli) do barwienia:

⇒ przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym → kropla 0,85%NaCl + 1 kolonia bakteryjna

⇒ wysuszenie rozmazu (ogrzanie nie wyschniętego preparatu powoduje uszkodzenie komórki)

⇒utrwalenie preparatu (przeciwdziała zmyciu preparatu podczas barwienia, ułatwia wnikanie barwnika): metody fizyczne (3-4 krotne w płomieniu palnika) i chemiczne (95% etanol)

Metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej:BAKTERIOLOGICZNE, IMMUNOLOGICZNE, MOLEKULARNE

badanie: mikroskopowe, hodowlane, metabolizmu drobnoustrojów (identyfikacja do gatunku)

Jak badamy drobnoustroje? 1)wstępna obserwacja mikroskopowa - morfologia komórki 2)izolacja drobnoustroju w czystej hodowli a) izolacja czystych kultur (czysta hodowla) *metoda bezpośrednia - mikromanipulator, metoda rozcieńczeń *metoda płytkowa - posiew redukcyjny პ kolonia = cfu (colony forming units - jednostki tworzące kolonie, j.t.k.)

b) wybór odpowiedniego podłoża c)dobór warunków hodowli 3)ocena morfologii drobnoustroju - morfologia kolonii, typ wzrostu n podłożu płynnym 4)zbadanie jego właściwości fizjologicznych 5)zbadanie udziału izolowanego drobnoustroju 6)ocena antybiotykowrażliwości drobnoustroju (antybiogram) CECHY POŻYWKI: 1)odpowiednie pH (7,0 - 7,4), 2)skład, stężenie soli mineralnych 3)izotoniczność, potencjał oksydo-redukcyjny 4)klarowność, sterylność PODŁOŻA HODOWLANE: 1)Podział ze względu na stan skupieniu (zawartość agaru) a)płynne b)półpłynne (0,5% - 1% agaru) - ocena zdolności ruchu Ⴍ c)stałe (1,5% - 3% agaru) - płytki Petri'ego, skosy 2)Podział ze względu na skład a)naturalne (o nieokreślonym składzie chemicznym) np.: mleko, krew, surowica b) sztuczne (o nieokreślonym składzie chemicznym) c)syntetyczne (o określonym składzie chemicznym) 3)Podział ze względu na funkcje i skład a)proste (agar tryptozowo-sojowy, woda peptononowa) b)wzbogacone (agar z krwią baranią, bulion mózgowo-sercowy) c)wybiórczo-namnażające (agar Sabourauda, p. z cetrimidem) d)wybiórczo-różnicujące (p. McConkey'a, p. Chapmana) e)różnicujące (ocena fermentacji cukrów, wytwarzania ureazy) f)specjalne (p. czekoladowe, Loefflera, Loewensteina-Jensena) g)chromogenne (MRSA agar, RLM - Rapid Listeria monocytogenes) h)transportowe, transportowo-namnażające (Uromedium) DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - SKŁADNIKI ODŻYWCZE 1)Bakterie wybredne: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae 2)Bakterie niewybredne: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus ureus DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - DOSTĘP TLENU: 1)bezwzględne (ścisłe) tlenowce - Bacillus spp. 2)mikroaerofile (O₂ 2-8%) - Helicobacter pylori 3)fakultatywne (względne) beztlenowce - E. coli, S. aureus 4) bezwzględne beztlenowce (O₂<0,5%, E_h <0,2 V) - Bacteroides fragilis, Clostridium spp. a) hodowla - anaerostat, GAsPak, p. z tioglikolanem sodowym 5)kapnofile (~10% CO₂) - Haemophilus influenzae a)hodowla - cieplarki z przepływem CO₂ DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - TEMPERATURA 1) psychrofile np.: Alcaligenes spp. temperatura optymalna 15-20°C, min.10°C, max. 45°C 2)mezofile np.: Escherichia coli temperatura optymalna 37°C 3)termofile np.:Thermus aquaticus temperatura optymalna 60°C 4)ekstremo termofile np.: Thermococcus spp. temperatura optymalna 85-90°C DOBÓR WARUNKÓW HODOWLI - pH 1)Acidofile - pH 2-5, optimum pH 3-4, np.: Candida albicans 2)Neutrofile - pH 6-7,5, optimum pH ~7, np.: E. coli, S. aureus 3)Alkalofile - pH 8-11, optimum pH 9, np.: Vibrio cholerae

Kolonia - „skupisko komórek”, „klon”, zespół komórek tego samego gatunku (pochodzący z jednej komórki) na podłożu stałym Opis kolonii (hodowla na podłożach stałych!) 1)kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, „wyniosłość”, kolor, konsystencja, zawieszalność, zapach, 2)inne: np.: typ hemolizy na podłożach z krwią: a)beta - całkowita liza erytrocytów np.: S. ureus b)alfa - niecałkowita liza erytrocytów np.: S. pneumoniae c)gamma - brak hemolizy np.: Staphylococcus epidermidis Typ wzrostu na podłożach płynnych 1)bezwzględne tlenowce - kożuszek 2)fakultatywne (względne) beztlenowce- wzrost dyfuzyjny 3)bezwzględne beztlenowce - osad METODY IDENTYFIKACJI - identyfikacja do gatunku I. Identyfikacja (z użyciem hodowli drobnoustrojów) 1)testy biochemiczne 2)metody molekularne 3)metody chemiczne a)profile kwasów tłuszczowych / białek 4)metody immunologiczne II. Identyfikacja (bez użycia hodowli drobnoustrojów) w przypadku drobnoustrojów wolnorosnących, trudno hodowlanych lub niehodowlanych 1)metody molekularne 2)metody serologiczne (wykrywanie antygenów /przeciwciał) OCENA LEKOWRAŻLIWOŚCI: 1)Antybiotyk - substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy (bakterie, grzyby) lub uzyskana na drodze półsyntetycznej lub syntetycznej, mająca naturalny wzorzec. 2)Chemioterapeutyk - substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze chemicznej, nie posiadająca naturalnego wzorca

Antybiotyki - podział: a) Naturalne - metabolity pleśni, grzybów, bakterii np.: penicylina b)Półsyntetyczne - chemiczna modyfikacja antybiotyku naturalnego (podstawniki boczne), np.: cefalosporyny, aminopenicyliny c)Syntetyczne - pełna synteza i odtworzenie struktury naturalnej, np.: aztreonam, chloramfenikol Spektrum = zakres aktywności antybiotyku wobec jednego lub większej liczby gatunków bakterii a)Wąskie spektrum *ograniczone do jednej grupy lub rodzaju drobnoustroju -wankomycyna, aztreonam b)Szerokie spektrum *bakterie Gram (+) i Gram (-), czasem także beztlenowce, bakterie atypowe -cefalosporyny III generacji, tetracykliny, aminoglikozydy Sposób działania antybiotyków: Bakteriostatyczny - zahamowanie wzrostu: chloramfenikol, linkozamidy, makrolidy, tetracykliny) Bakteriobójczy - efekt zależny od czasu działania: ၢ-laktamy lub efekt zależny od stężenia: aminoglikozydy, chinolony EFEKT POANTYBIOTYKOWY - Zahamowanie wzrostu bakterii krótkotrwale eksponowanych na antybiotyk, utrzymujące się po jego usunięciu ze środowiska, np.: aminoglikozydy - do 8h u bakterii Gram-ujemnych, do ~ 4h u bakterii Gram-dodatnich; chinolony MECHANIZM DZIAŁANIA ANTYBIOTYKÓW:1 ) zahamowanie syntezy ściany komorkowej a)wiązanie się z grupą D-alanylo-D-alaniny, co uniemożliwia włączanie podjednostek do peptydoglikanu პ glikopeptydy b)inhibicja enzymów - transpeptydaz (PBP - penicillin binding protein) katalizujących sieciowanie podjednostek peptydoglikanu პ ၢ-laktamy 2) zahamowanie syntezy bialka a)wiązanie z podjednostką rybosomu 30S i/lub 50S პ makrolidy, linkozamidy, streptograminy, tetracykliny, aminoglikozydy, chloramfenikol b)hamowanie wiązania mRNA - zablokowanie translokacji tRNAპoksazolidynony 3)zahamowanie syntezy DNA a)blokowanie topoizomerazy lub wyrazy პ chinolony 4)zahamowanie transkrypcji a)wiązanie z podjednostką ၢ polimerazy პ ryfamycyny (ryfampicyna, rifaksymina) 5)zahamowanie syntezy kwasu foliowegoპsulfonamidy (kotrimoksazol) 6)zaburzenia funkcjonowania błon komórkowych პ polimyksyny (kolistyna)

Oznaczanie wrażliwości na leki -jeden z najważniejszych etapów diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych *Zasady doboru testów do oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zawarte w rekomendacjach opracowanych w Krajowym Ośrodku Referencyjnym ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) powołanym decyzją Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 roku. *Podstawą metodyczną rekomendacji w zakresie wykonania, interpretacji i standaryzacji oznaczania lekowrażliwości są zalecenia Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) i zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowraliwości - EUCAST (ang. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing). *Standaryzacja metod: skład podłoża (najczęściej Mueller-Hinton Agar )///inokulum = gęstość zawiesiny bakteryjnej (0, 5 wg skali Mc Farlanda = 1,5 x 10⁸ cfu/ml)///warunki (35ႰC, +O₂/+CO₂)///czas inkubacji(18-20h/24h)///stężenie antybiotyku w krążku, wielkość krążka, liczba krążków na płytce///warunki wykonania antybiogramu (3x15 min.)///warunki odczytu stref zahamowania wzrostu///interpretacja wyników (np.: interpretacja na podstawie wielkości stref zahamowania wzrostu szczepu wokół krążków w mm zgodna z instrukcją dołączoną do krążków)

Wykonanie antybiogramu: Czysta hodowla Ⴎ zawiesina w 0,9% NaCl (densytometr) Ⴎ rozprowadzenie na płytce Ⴎ ułożenie krążków/pasków Ⴎ inkubacja Ⴎ odczyt Ⴎ interpretacja METODY OZNACZANIA LEKOWRAŻLIWOŚCI 1)Jakościowe a)metoda krążkowo-dyfuzyjna b)metody skriningowe (przeglądowe) *ocena wrażliwości na glikopeptydy, na wysokie stężenia aminoglikozydów c)metody specjalne (dla bakterii trudno hodowlanych m. in. Mycobacterium spp., Haemophilus spp., Mycoplasma spp.) *Półilościowe rozcieńczeniowe - 2 lub 3 stężenia krytyczne (break-point) dla stopni wrażliwości W, S, O; np.: metody półautomatyczne (ATB)*Ilościowe MIC (minimal inhibitory concentration)MBC (minimal bactericidal activity concentration)///metoda seryjnych rozcieńczeń w podłożu stałym lub płynnym///metoda dyfuzyjna Ⴎ np.. Etesty///automatyczne Ⴎ Vitek (Bio Mérieux), Phoenix (Becton Dickinson) INTERPRETACJA WYNIKÓW ANTYBIOGRAMUMikrobiologiczna wrażliwość: szczep należy do wrażliwej populacji i nie posiada mechanizmów oporności, a sukces kliniczny w takiej sytuacji jest wysoce prawdopodobny Mikrobiologiczna oporność: szczep posiada mechanizm oporności, (oporność niskiego lub wysokiego stopnia) Mikrobiologiczna średnia wrażliwość: dotyczy grupy szczepów, które znajdują się pomiędzy mikrobiologicznie wrażliwymi i mikrobiologicznie opornymi. Sukces kliniczny jest trudny do przewidzenia, ale może być osiągnięty: *zastosowanie antybiotyku w wyższej dawce *zwiększenie częstotliwości podawania leku *jeśli antybiotyk ulega zagęszczeniu w miejscu zakażenia, osiągając wysokie stężenia ///konieczność potwierdzenia oznaczeniem MIC Oporność naturalna: *stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny drobnoustrojów; również oporność występująca u znacznej części populacji (ၢ-laktamazy u Staphylococcus spp., Moraxella catarrhalis). *może wynikać:z braku w komórce miejsca docelowego/niskiego powinowactwa (np.: Mycoplasma spp. ၢ-laktamy, Enterococcus spp. - cefalosporyny) ///z braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową (np.: pałeczki Gram-ujemne - glikopeptydy) ///z wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk (np.: Stenotrophomonas maltophilia - karbapenemy) Oporność nabyta: *nie stanowi naturalnej cechy szczepów danego gatunku drobnoustroju, wynika z presji selekcyjnej, związanej z powszechnym stosowaniem antybiotyków (nie tylko do celów terapeutycznych). *sytuacje sprzyjające szerzeniu oporności: nadużywanie antybiotyków///zbyt krótkie leczenie///zbyt długie przerwy między kolejnymi dawkami antybiotyków - stężenia subinhibicyjne ///częste stosowanie antybiotyków o znacznej łatwości narastania oporności lub szerzących oporność na inne grupy Oporność krzyżowa: *niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (np.: ၢ-laktamy, aminoglikozydy, makrolidy) lub niespokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np.: makrolidy i linkozamidy, streptograminy).

Typ barwienia	Przykład Zastosowanie	Barwnik Metodyka	Wynik
PROSTE	Metoda Löfflera	Błękit metylenowy - 5' Spłukać wodą	Jednolite niebieskie, (wyjątek Corynebacterium nierównomierne zabarwienie)
PROSTE	-	Safranina j. w.	Jednolite czerwone zabarwienie
PROSTE	-	Fiolet krystaliczny j. w.	Jednolite fioletowe zabarwienie
PROSTE	Negatywne Do obserwacji kształtu drobnoustrojów	Nigrozyna/tusz chiński → na brzegu szkiełka podstawowego zmieszać kolonię bakteryjną z kroplą barwnika, zrobić rozmaz 2-im szkiełkiem, wysuszyć	Tło ciemne, nie zabarwione (jasne) komórki
ZŁOŻONE	Pozytywno-negatywne obserwacja otoczek wg Burri-Ginsa metoda Dornera - barwienie przetrwalników	Nigrozyna + fuksyna fenolowa Ziehla 1-szy etap j. w., utrwalić w płomieniu, dobarwić fuksyną fenolową 1-2' (spłukać wodą) 1-szy etap j. w., dobarwić safraniną na gorąco!	Ciemne tło, jasne otoczki Czerwone komórki bakterii Ciemne tło, czerwone przetrwalniki
ZŁOŻONE	Metoda Grama - Podział bakterii na Gram - dodatnie i Gram - ujemne	Fiolet krystaliczny 2- 3' (spłukać wodą) Płyn Lugola 1-2' (spłukać) „odbarwiacz” 30'' (spłukać wodą) fuksyna zasadowa 30'' (spłukać wodą)	Gram (+) - fioletowe Gram (-) - czerwone Gram chwiejne - pośrednie między czerwonym a fioletowym (np. Corynebacterium)
ZŁOŻONE	Metoda Neissera - wybarwianie ziaren metachromatycznych (Babes-Ernsta) u Corynebacterium	Neisser I (roztwór bł. metylenowego) Neisser II (roztwór fioletu krystalicznego) zmieszać odczynniki 2:1 barwić 10', (spłukać wodą) Chryzoidyną 10-15”	Komórki bakterii - żółto-zielone, ziarna metachromatyczne - granatowe.
ZŁOŻONE	Metoda Waysona Do barwienia preparatów bezpośrednich	Barwnik Waysona - 2' (fiolet kryst.+ bł. metyl.) (spłukać wodą)	Komórki bakterii ciemno granatowe, inne np.: komórki nabłonkowe, leukocyty jasno-fioletowo-granatowe
ZŁOŻONE	Metoda Wirtza-Conklina - Do barwienia przetrwalników	Safranina/fuksyna - 5' (spłukać wodą) zieleń malachitowa na gorąco! (spłukać wodą)	Komórki bakterii czerwone, Przetrwalniki zielone
ZŁOŻONE	Metody dla bakterii kwasooprnych: Ziehl-Neelson (na gorąco!) Tan-Tien-Hok (na zimno) Kinyoun (na zimno)	Fuksyna karbolowa („do tzw. trzech par”) (delikatnie spłukać wodą), spłukać kwaśnym alkoholem błękit metylenowy 20” (spłukać wodą) Kinyoun 3' (spłukać) Gabett 1' (spłukać wodą) Fuksyna karbolowa 5' (spłukać wodą) spłukać kwaśnym alkoholem 3' (spłukać wodą) zieleń brylantowa 4' (spłukać wodą)	Bakterie kwasooporne np.: Mycobacterium - czerwone Tło i bakterie niekwasooporne - niebieskie. Efekt barwienia j. w. Bakterie kwasooporne czerwone Tło i bakterie niekwasooporne zielone

---