Morphometric and biochemical screening of old mulberry trees (Morus alba L.) in the former sericulture region of SloveniaMorphometric and biochemical screening of old mulberry trees (Morus alba L.) in the former sericulture region of Slovenia

Andreja Urbanek Krajnc1*, Tina Ugulin2, Andrej Paušič3, Johannes Rabensteiner2, Vesna Bukovac4, Maja Mikulič Petkovšek5, Franc Janžekovič6, Tamás Bakonyi7,8, Rebeka Lucijana Berčič7,8, Mateja Felicijan

Przez wieki w wielu krajach europejskich morwy białej (Morus alba L.) stały się integralną częścią krajobrazu kulturowego, świadcząc o wcześniejszych działaniach w zakresie sericulture. Zapisy dotyczące rozmieszczenia drzew morwy białej w krajobrazie kulturowym są niekompletne i ogólnie słabo udokumentowane. Celem prezentowanych badań było zebranie danych dotyczących lokalizacji geograficznej drzew morwy oraz zdefiniowanie ich morfologicznej i biochemicznej zmienności w regionie Goriška, jednego z historycznych regionów hodowli serowisk w Słowenii. Analiza głównego składnika wszystkich morfometrycznych cech liści pozwoliła nam scharakteryzować dwie oddzielne grupy morfotypów. Nagrania z zarządzania przycinaniem drzew wykazały, że coroczne wycinanie podstawy jest tradycyjnie stosowane w regionie Goriška. Znaczące korelacje między zarządzaniem przycinaniem a cechami morfologicznymi liści wykazały, że często przycinane drzewa tworzą większe liście. Biochemicznie wykazano, że liście morwy są bogate w białka zawierające treoninę, argininę, asparaginę, serynę i glutaminę jako najbardziej widoczne wolne aminokwasy. Główne związki fenolowe zidentyfikowano jako pochodne kwasu kawoilochinowego, kwercetyno-malonylo-heksozyd, rutyna, kaempferol acetylo-heksozyd, kwercetyno-3-glukozyd i pochodne kwasu p-kumarynowego. Różnica w stężeniach badanych metabolitów jest skorelowana z zarządzaniem przycinaniem lub morfotypem. Przycinanie znacząco wpłynęło na poziomy asparaginy, alaniny i seryny, które były wyższe w drzewach przycinanych corocznie, niezależnie od morfotypu. Co więcej, byliśmy w stanie potwierdzić znaczący wpływ przycinania na całkowitą zawartość fenoli, a także na poziom rutyny, kwercetyny malonylo-heksozydu i kwercetyny-3-glukozydu. Analiza wielowymiarowa pozwoliła nam określić siedem chemotypów o charakterystycznych cechach biochemicznych. Nasze wyniki są podstawą do zdefiniowania genotypów o wysokiej wydajności z optymalnym składem metabolicznym zarówno do karmienia jedwabników, jak i do innowacyjnego zastosowania w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym

Naturalny zasięg morwy białej (Morus alba L.) znajduje się prawdopodobnie w środkowych i zachodnich prowincjach Chin oraz w sąsiednich regionach Azji Środkowej (zachodni obszar Tien Shan, region między rzekami Amu Darya i Syr Darya), gdzie ma był szeroko uprawiany od ponad 4500 lat. Morwa biała została sprowadzona do Europy w XII wieku w celu ustanowienia działającego europejskiego rolnictwa, ponieważ liście są preferowanym pożywieniem wytwarzających jedwab gąsienic Bombyx mori L. [1]. Pierwsze próby promowania uprawy morwy w Słowenii podjęto już w XVI wieku, kiedy po raz pierwszy wprowadzono sericulture w regionie Goriška. Wpływ ten rozprzestrzenił się w byłej monarchii austro-węgierskiej, kiedy cesarzowa Maria Theresia z Austrii rozpoczęła program wsparcia państwa w 1749 r. W celu uzyskania większej niezależności od drogiego importu jedwabiu z Francji i Włoch. Regionalne próby serikultury osiągnęły swój szczyt w połowie XIX wieku, znany jako „złoty wiek goriziańskiej sericulture”. Od tego czasu popadł w ogromny spadek z powodu bakteryjnej infekcji jedwabników, które rozprzestrzeniły się po Europie z Francji, a także z powodu późnych przymrozków oraz epidemii grzybowych i bakteryjnych morwy. Pomimo wszystkich podjętych działań nie udało się osiągnąć trwałych rezultatów, a przemysł produkujący jedwab zakończył się z początkiem XX wieku, do czego przyczyniło się również wprowadzenie włókien syntetycznych [2–5]. Jednak dawne regiony uprawy serów zachowały wiele stuletnich drzew morwy, które stanowią zarówno cenne dziedzictwo naturalne wewnątrzgatunkowej różnorodności genetycznej, jak i wybitne zabytki bardzo wczesnych prób społeczeństwa przemysłowego w Europie. Istnieje pilna potrzeba szerszej świadomości społecznej na temat zachowania historycznych pozostałości sericulture, szczególnie w odniesieniu do historycznych genotypów morwy w kontekście ogólnej tendencji do ogromnej utraty różnorodności roślin uprawnych. Chociaż liście morwy odgrywają nieodzowną rolę w hodowli jedwabników, obecnie są one również częściej wykorzystywane jako pokarm uzupełniający dla zwierząt gospodarskich [6,7]. Ponadto M. alba jest ważna w tradycyjnej medycynie. W medycynie chińskiej jest szeroko stosowany od 659 AD [8]. Wcześniej wielu autorów [8–16] badało liście morwy różnych odmian pod kątem ich potencjału farmakologicznego u ludzi. Wykazano, że liście morwy mają wysoką zawartość białka (18–25 g / 100 g DW). Oprócz białek i ich unikalnego składu aminokwasów, zdominowanych przez kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, fenyloalaninę, lizynę i argininę, głównymi godnymi uwagi składnikami liści są węglowodany, wapń, żelazo, kwas askorbinowy, karotenoidy, tiamina, kwas foliowy, i fenole [17]. W liściach morwy stwierdzono pewną różnorodność związków fenolowych, które miały wiele efektów biologicznych, w tym działanie przeciwutleniające [8–16]. Główne kwasy fenolowe zidentyfikowano jako kwas chlorogenowy, a następnie inne pochodne kwasu kofeinochinowego (CQA) i pochodne kwasu p-kumarynowego (p-CA) [10,17–21]. Frakcja flawonoli zawierała rutynę, kwercetynę, a także glikozydy kaempferolowe [10,12,22–27]. Celem prezentowanych badań było zebranie danych dotyczących położenia geograficznego historycznych drzew morwy w regionie Goriška, zdefiniowanie ich zmienności morfologicznej oraz zbadanie ich wzorców biochemicznych w odniesieniu do ważnych metabolitów pierwotnych (białek i aminokwasów) i fenoli. Ocena statystyczna pozwoliła nam wykazać najodpowiedniejsze cechy różnicujące, bliżej zdefiniować morfotypy i przedstawić korelacje między zmierzonymi parametrami w odniesieniu do potencjalnego zarządzania przycinaniem związanym ze zbiorami liści. Wszystkie genotypy zawarte w tych analizach morfometrycznych i biochemicznych są częścią szerszych badań mających na celu zdefiniowanie wysokowydajnych i bogatszych w składniki odżywcze odmian morwy z lokalnej puli genów, które zostaną wybrane i rozmnożone jako wysoce zalecana pasza dla jedwabników.

Material and methods

Study area

Wybraliśmy obszar badawczy o powierzchni około 140 km2 w zachodniej części Słowenii. Obszar badań obejmuje pagórkowaty obszar Goriška Brda, dolinę rzeki Vipava oraz zachodni kraniec doliny Vipava, wapienną strefę przejściową Podsabotin. Obszar badań jest naturalnie ograniczony na północy przez leśny płaskowyż krasowy Trnovo, na wschodzie przez pasmo Dinaric Nanos (płaskowyż). Na południu obszar badań jest ograniczony wysokim płaskowyżem Kras (Kras). Zachodnia granica naszego badania pokrywa się z gminą Brda (ryc. 1A). Średnia wysokość obszaru badań wynosi 200 m n.p.m. Klimat śródziemnomorski na badanym obszarze charakteryzuje się średnimi rocznymi opadami około 1000 mm i średnią temperaturą 12 ° C [28] (ryc. 1B, C). Podstawę geologiczną regionu reprezentuje równina krasowa, utworzona głównie ze skał wapiennych, wapienia i rzadko dolomitów. Na powierzchni skały te starzeją się w chromowe cambisole i luvisole, które sporadycznie nawet całkowicie je pokrywają. Jakość gleby w całym regionie naszych badań jest praktycznie identyczna, chromianowe (calco) cambisole i głębokie rendziny w dolinach i wąwozach aluwialnych [29]. Potencjalną naturalną roślinnością tego obszaru jest las Quercus-Carpinus [30]. Podczas wycieczek terenowych zarejestrowaliśmy dokładne lokalizacje GPS 85 głównie drzew historycznych, które zostały zidentyfikowane jako Morus alba L. Dziewięć genotypów pobrano w regionie Goriška Brda (Gorizia hills) (B), 13 genotypów w Miren-Kostanjevica ( MK), sześć w gminie Šempeter-Vrtojba (SV), 52 w Ajdovščina (A) i pięć w gminie Nova Gorica (NG) (Tab. 1, ryc. 1). Średnia średnica łodygi na wysokości piersi (DBH) wynosiła ponad 180 cm. Drzewa o dużej średnicy (DBH> 300 cm) stanowiły 11% drzew, 25% drzew miało średnią DBH między 200 cm a 300 cm. Ponieważ kształt i wielkość liści mogą się różnić w zależności od ostatecznego zarządzania przycinaniem [31], drzewa zostały podzielone na trzy kategorie pod względem częstotliwości przycinania: 1 - drzewa nieobcięte, 2 - drzewa przycięte w ciągu ostatnich 3 lat, i 3 - drzewa przycinane co roku. Nagrania z przycinania wykazały, że wycinanie podstawy jest tradycyjnie stosowane w regionie Goriška, ponieważ 51,8% drzew poddawano corocznej procedurze przycinania, 28,2% drzew przycinano raz w ciągu 3 lat, podczas gdy 20% badanych osobników stanowiło drzewa nie przycięte.

Analizy morfometryczne

Z każdego drzewa pobrano od dwudziestu do trzydziestu w pełni rozwiniętych, wystawionych na słońce liści w bieżącym roku na piątej pozycji z wierzchu gałęzi z tegorocznego wzrostu. Osiem parametrów morfometrycznych każdego liścia (powierzchnia liścia, długość szypułki, długość liścia, szerokość liścia, szerokość lewego i prawego liścia, długość lewej i prawej żyły podstawnej) zmierzono i oceniono za pomocą oprogramowania Cell ^ A 2.4 (Olympus BioSystems, Houston, USA, 2006). Ponieważ kształt i wielkość liści mogą się różnić w zależności od ostatecznego zarządzania przycinaniem [31], drzewa zostały podzielone na trzy kategorie pod względem częstotliwości przycinania: 1 - drzewa nieobcięte, 2 - drzewa przycięte w ciągu ostatnich 3 lat, i 3 - drzewa przycinane corocznie (ryc. 2B).

Biochemical analyses

Całkowite białka określono ilościowo za pomocą metody Lowry'ego [32]. Wcześniej białka strącano kwasem trichlorooctowym (TCA) zgodnie z Kumar i in. [33] Dwadzieścia pięć mg suchego proszku z liści homogenizowano w 5 ml 80% etanolu. Supernatant odrzucono i osad zawieszono w 5 ml 10% TCA na 30 minut. Po odwirowaniu supernatant odrzucono. Osad następnie przemyto 5% TCA w celu usunięcia przeszkadzających aminokwasów i fenoli. Następnie osad białka rozpuszczono w 1 M wodorotlenku sodu w gorącej łaźni wodnej przez 30 minut. Ekstrahowane białka w 1 M NaOH rozcieńczono 10 razy wodą destylowaną. Pięćset µl rozcieńczonej próbki białka pobrano do probówki i dodano 700 µl odczynnika Lowry'ego. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej do próbek dodano 100 µl odczynnika fenolowego Folin. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej absorbancję zmierzono spektrofotometrycznie przy 750 nm. Całkowitą zawartość białka w każdej próbce obliczono na podstawie krzywej standardowej, która została przygotowana przy użyciu albuminy z surowicy bydlęcej (BSA, 25–100 µg mL-1) i wyrażona w gramach ekwiwalentu BSA na 100 g próbki suszonego liścia (g BSA / 100 g DW).

….

Results

Morphometrical analyses of mulberry leaves

Wyniki analizy morfometrycznej pokazują, że wszystkie badane parametry mają znaczący wpływ na zmienność liści M. alba. Regresja liniowa cech morfometrycznych pozwoliła scharakteryzować dwie oddzielne grupy morfotypów, charakteryzujące się innym współczynnikiem regresji, natomiast nachylenie między obiema liniami regresji jest równe (0,008). Obie grupy morfotypów charakteryzują się wysokimi wartościami R-kwadrat (ryc. S1). Aby umożliwić kompleksową ocenę cech liści i bliższe zdefiniowanie morfotypów, przeprowadziliśmy analizę głównego składnika. Wyjaśnienie wariancji Podstawowy składnik 1 (PC1) wynosi 85,90%, przy czym wszystkie parametry w mniejszym lub równym stopniu przyczyniają się do ogólnego grupowania (dystrybucji). Trzeci komputer ma wariancję 3,25% i jest związany głównie z powierzchnią liścia, długością szypułki i długością liścia. Zatem PC3 łączy wszystkie genotypy z małymi liśćmi i oddziela je od tych, które mają większe wymiary liści (ryc. 2, tab. S1). Analiza PCA wyraźnie rozdziela obie grupy morfotypów. Morphotype 1 (M1) obejmuje grupę drzew morwy, które znajdują się w Gorišce Brda, Šempeter – Vrtojba, Miren – Kostanjevica, Nova Gorica, a także niektóre drzewa morwy z gminy Ajdovščina. Morphotype 2 (M2) scharakteryzowano za pomocą 11 próbek, trzy pochodzące z Nova Gorica (NG1, NG2, NG4; Tab. 1) i inne z gminy Ajdovščina (A31, A37, A39, A40–43, A45, A47, A51; Tab. 1, ryc. 2). Można zaobserwować rozdzielenie genotypów w obrębie obu odrębnych morfologicznie grup zgodnie z częstością przycinania. Najczęściej przycinane drzewa tworzyły liście o większych wymiarach. Ale ta separacja nie jest tak wyraźna, jak separacja między dwoma morfotypami. Analiza wariancji została zastosowana w celu ustalenia, czy przycinanie ma jakikolwiek wpływ na badane parametry w obu morfotypach. Morphotype 2 tworzył znacznie większe liście w odniesieniu do wszystkich mierzonych cech, gdy drzewa były przycinane corocznie. W przypadku M1 potwierdzono znaczący wpływ zarządzania przycinaniem na długość liścia, lewą szerokość oraz lewą i prawą żyłę podstawną. Nie było jednak statystycznie istotnej różnicy w żadnym z mierzonych parametrów między przycinanymi corocznie drzewami a tymi przycinanymi w ciągu 3 lat (ryc. 3)

…

Discussion

Morphometrical analyses of mulberry leaves

Wyniki analizy morfometrycznej pokazują, że możliwe jest jednoznaczne zidentyfikowanie dwóch morfometrycznie odrębnych grup morwy białej (Morus alba L.) w regionie Goriška. Analiza statystyczna pokazuje, że powierzchnia liścia jest najsilniejszą cechą różnicującą oba morfotypy. M2 ma dłuższe, większe i bardziej eliptyczne liście, podczas gdy M1 ma szersze liście. Podobne badanie morfometryczne przeprowadzili Peris i in. [40] pozwalając autorom na rozróżnienie między pięcioma dostępami morwy za pomocą 12 cech fenotypowych. Sugerujemy, że różne grupy mogą być spowodowane ich odmiennym pochodzeniem. Każdy morfotyp może reprezentować mniej lub bardziej blisko spokrewnione sadzonki pochodzące z różnych szkółek morwy, które zostały ustanowione podczas prób promocji austro-węgierskiej hodowli serowarskiej. Niewiele wiadomo na temat historycznych źródeł nasion do uprawy na dużą skalę drzew morwy białej. Selektywne stosowanie i rozmnażanie wegetatywne poprzez szczepienie określonych klonów o lepszych właściwościach żywieniowych opisano dla regionu w literaturze z połowy XIX wieku [2,3]. Ogólnie rzecz biorąc, oczywiste jest, że na pochodzenie i związek genetyczny morwy ma wpływ przede wszystkim czas sadzenia i historyczne wykorzystanie różnych zasobów materiału do sadzenia w okresie goriziańskiej hodowli. Przycinanie to praktyka kulturowa, o której wiadomo, że znacznie zmienia parametry wzrostu i liści morwy [41,42]. Nagrania z przycinania wykazały, że praktyka przycinania morwy jest nadal tradycyjnie stosowana w regionie Goriška [4,5]. Na podstawie oceny statystycznej potwierdzono wpływ przycinania na morfotycznie odrębne grupy. Jednak efekt przycinania jest bardziej oczywisty dla cech morfometrycznych M2. Wiadomo, że częste przycinanie powoduje większe wymiary liści i wysoką wydajność na jednostkę powierzchni. Z drugiej strony wiadomo, że drzewa, które rok po roku nie są przycinane, nie osiągają wystarczającego wzrostu i rodzą liście o niewielkich rozmiarach i gorszej jakości [41,42]. Głównym czynnikiem decydującym o wydajności, a tym samym rentowności w uprawie serów jest plon liści morwy. Maksymalizacja wydajności liści morwy na jednostkę powierzchni w wyniku przycinania pozwala osiągnąć dwa najważniejsze cele ekonomiczne uprawy serów, a mianowicie zwiększenie produkcji kokonu na hektar i obniżenie kosztów produkcji [43].

Conclusion

Możemy wnioskować, że badane cechy morfometryczne rozróżniają morwy białej na różne grupy morfologiczne, co będzie bardzo przydatne w dalszej selekcji cennych genotypów w ramach lokalnej historycznej puli genów. Szersza analiza genetyczna zapewni dodatkowy wgląd w zmienność i różnorodność badanych genotypów i oczekuje się, że potwierdzi wyniki naszych badań morfometrycznych. Przycinanie, które jest tradycyjnie stosowane w regionie Goriška, ma znaczący wpływ na parametry morfometryczne i niektóre parametry biochemiczne. Z punktu widzenia hodowli serowej wyniki naszych badań wyraźnie potwierdzają, że środki przycinania nie tylko maksymalizują plon liści, ale także przyczyniają się do jakości odżywczej liści. Morphotype 2 został uznany za obiecujący w zastosowaniu do kultury moralnej. Analiza wielowymiarowa pozwoliła nam na dalsze zdefiniowanie odrębnych chemotypów, które zostały ocenione pod kątem lepszego składu niektórych pojedynczych aminokwasów i fenoli. Uzyskane wyniki pomogłyby nam wyselekcjonować i rozmnażać te najlepsze lokalne odmiany o wysokim stężeniu głównych aminokwasów i specyficznym składzie fenoli i zalecić je do hodowli jedwabników, a nawet do celów farmaceutycznych.

.