W ydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii

Metody oceny sanitarnej wody

Monika Śniadowska

Nr albumu 190621

1.Wstęp teoretyczny 3

2.Materiały i metody 5

2.1 Materiały 5

2.2 Stosowane pożywki 5

2.3 Metody badawcze 6

2.3.1 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego Escherichia coli i bakterii grupy coli 8

2.3.2 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego Escherichia coli i bakterii grupy coli 9

2.3.3 Badania potwierdzające dla bakterii grupy coli 9

2.3.4 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego paciorkowców kałowych 10

2.3.5 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego paciorkowców kałowych 10

2.3.6 Badania potwierdzające dla paciorkowców kałowych 10

2.3.6 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego Pseudomonas aeruginosa 10

2.3.7 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego Pseudomonas aeruginosa 11

2.3. Badania potwierdzające dla paciorkowców Pseudomonas aeruginosa 11

4.Wyniki 11

5.Wnioski 13

6.Bibliografia 14

1.Wstęp teoretyczny

Stan higieniczny wytwarzania ma istotny wpływ na bezpieczeństwo produkowanych wyrobów. Producent ma obowiązek kontrolować nie tylko surowce, dodatki do wyrobów i produktów końcowych, ale także całego cyklu produkcyjnego, a także do wdrożenia zasad Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GHP, ang. good higiene practice)[1].

Kontrola stanu higienicznego warunków produkcji obejmuje m. in. wodę stosowaną w produkcji, która należy do podstawowych czynników wykorzystywanych w przemyśle spożywczym. Zgodnie z rozporządzeniem nr 178/2002 woda mieści się w definicji żywności, w związki z czym musi być bezpieczna dla zdrowia. Oznacza to, że musi spełniać kryteria, które ustalone są Rozporządzeniem Ministra z dnia 13.11.2015 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia. Powyższe rozporządzenie precyzyjnie stanowi, iż: "Woda jest bezpieczna dla zdrowia ludzkiego, jeżeli jest wolna od mikroorganizmów chorobotwórczych i pasożytów w liczbie stanowiącej potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, wszelkich substancji w stężeniach stanowiących potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego oraz nie ma agresywnych właściwości korozyjnych”[2].

Organizmy, które zanieczyszczają wodę pochodzą najczęściej z wydalin ludzkich lub zwierzęcych. Szczególnie niebezpiecznym źródłem zagrożenia epidemiologicznego są wody zanieczyszczone ściekami, gdzie mogą się znajdować właściwe bakterie ściekowe, mikroflora jelitowa ludzi i zwierząt oraz drobnoustroje chorobotwórcze. Bardzo poważnym zagrożeniem dla zdrowia człowieka może być również zanieczyszczenie wody wirusami. Drobnoustroje chorobotwórcze nie namnażają się w wodzie, ulegają nawet częściowej redukcji, z szybkością zależną od warunków środowiska i rodzaju drobnoustroju. Okres inkubacji chorób zakaźnych trwa zwykle od kilku dni do kilku tygodni, a więc w przypadku podejrzenia, że woda jest źródłem zakażenia, niemożliwym jest wykrycie w niej drobnoustrojów patogennych[3]. Niemożliwe jest także badanie wody w kierunku wszystkich organizmów chorobotwórczych, dlatego też wykonuje się je w odniesieniu do uniwersalnych wskaźników stanu sanitarnego wody. Badania mikroflory jelitowej ustaliły stałe występowanie trzech rodzajów bakterii wskaźnikowych świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub ściekami. Są to:

• Pałeczki okrężnicy (Escherichia coli)

• Paciorkowce kałowe (Enterococcus feacalis)

• Beztlenowce przetrwalnikujące (Clostridium perfringens)

Ostatnio badania dotyczące oceny jakości wody (pod kątem mikrobiologicznym) zostały poszerzone o wykrywanie patogenów Pseudomonas aeruginosa.

Dodatkowo jako zagrożenie mikrobiologiczne wody w kontekście ujęć i zbiorników wody ciepłej oraz instalacji wentylacyjnych i klimatyzacji stanowi Legionella.

Bakterie, które pełnią rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące kryteria:

• muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co zawsze pozwala wykrywać zanieczyszczenia wody,

• liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka musi być duża,

• do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć formy nieprzetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody,

• ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod,

• długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż długość życia gatunków chorobotwórczych,

• nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym[5].

Według wymagań Dyrektywy 98/83/WE i Rozporządzenia MZ w próbce wody o objętości 100 cm³ nie mogą być obecne bakterie grupy coli oraz bakterie kałowe. Dyrektywa ta zawiera też wartości parametryczne oceny jakości wody w butelkach i pojemnikach. W próbce o objętości 250 cm³ nie mogą być obecne bakterie Escherichia coli, paciorkowce kałowe, a także pałeczki Pseudomonas aeruginosa.

Liczba bakterii rosnących w temperaturze 22°C i 37°C na agarze spożywczym, w 1 cm³ nie powinna przekraczać, odpowiednio 100 jtk i 20 jtk. Ponadto woda z ujęć powierzchniowych nie powinna zawierać Clostridium perfringens w objętości 100 cm³.

Według nowych przepisów bakterie Legionella nie mogą być obecne w wodzie ciepłej, w ilości nie większej niż 100 kolonii w 100 ml wody. Rozporządzenie to określa dodatkowo częstotliwość, z jaką należy pobierać próbki do badania, a także procedury postępowania w zależności od wyniku badania[6].

Badania mikrobiologiczne wody w kierunku wykrywania większości drobnoustrojów przeprowadza się stosując metodę filtracji membranowej. Wykrywanie bakterii polega na przesączeniu pewnej objętości wody przez jałowy filtr. Bakterie w trakcie sączenia zatrzymują się na filtrze, który następnie inkubuje na określonym podłożu. W efekcie tworzą one na powierzchni filtra kolonie o typowym wyglądzie.

Stosując metodę filtracji membranowej do wykrywania określonych grup użyto następujących pożywej: dla bakterii z grupy coli oraz Escherichia coli stosowano podłoża Endo Les, mFC, z laktozą, TTC i Tergitolem® 7 oraz Chromocult® Coliform Agar, dla paciorkowców kałowych — agar Slanetza-Bartley 'a, dla Pseudomonas aeruginosa — podłoże z cetrymidem i kwasem nalidyksowym.

Wykonano też test Colilert-18®, który od niedawna jest metodą referencyjną.

Stosowano także metody alternatywne: dla bakterii z grupy coli i Escherichia coli- Readycult® Coliforms 100; dla enterokoków: Enterolert®, natomiast dla Pseudomonas aeruginosa- Pseudoalert™.

2.Materiały i metody

2.1 Materiały

Materiał badawczy stanowiła woda odpowiednio zanieczyszczona mikrobiologicznie przez pracowników Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Biotechnologii Politechniki Łódzkiej.

2.2 Stosowane pożywki

• Pożywka Endo Les to pożywka selektywna, która zawiera w swym składzie siarczan sodu oraz fuksynę odpowiedzialne za hamowanie wzrostu bakterii gram(+). Ponadto laktoza zawarta w podłożu ulega fermentacji do aldehydu octowego odpowiedzialnego za uwolnienie fuksyny ze związku fuksyna- siarczan (IV). Dochodzi wtedy do zabarwienia kolonii bakterii grupy coli na czerwono, a szczepów E. coli na intensywniejszy, fuksynowy połysk, który powstaje w wyniku krystalizacji barwnika. Jest to więc podłoże różnicujące.

• Pożywka mFC, oprócz składników odżywczych, zawiera także sole żółci, które odpowiedzialne są za hamowanie wzrostu bakterii gram(+). Termotolerancyjne bakterie fermentują laktozę oraz rosną w postaci niebieskich kolonii. Za nadanie im barwy odpowiedzialny jest kwas rozolowy.

• Na pożywce z laktozą, Tergitolem® 7 i TTC wzrost większości bakterii hamowany jest w wyniku dwóch ostatnich składników pożywki. W jej skład wchodzi błękit bromotmolowy, który jest wskaźnikiem rozkładu laktozy – w wyniku jego zakwaszenia dochodzi do zmiany barwy podłoża na żółtą. Ponadto możliwe jest także różnicowanie bakterii laktozo(-), ponieważ w wyniku redukcji TTC do formazanu, rosną one w postaci czerwonych kolonii.

• Podłoże chromogenne Chromocult® Coliform Agar jest zarówno podłożem selekcyjnym (obecność Tergitolu® 7) jak i różnicującym. Zawiera ono substraty chromo- i fluorogenne, pozwalające na rozróżnienie bakterii grupy coli od E.coli. Wykorzystuje się tu zdolności enzymatycznego rozkładu wybranych substratów przez bakterie. Salmon GAL (6-chloro-3-indolylo- -D-galaktopiranozyd) jest substratem dla -D-galaktozydazy, która uwalnia barwnik chromogenny. Kolonie wytwarzające ten enzym barwią się na czerwono/łososiowo. Z kolei X-glukuronid (5-bromo-4-chloro-3-indolylo - -D-glukuronid), w wyniku działania -D-glukuronidazy, ulega hydrolizie, w wyniku której uwolniony zostaje chromogen. Barwi on kolonie bakterii wytwarzających ten enzym na niebiesko. Bakterie E.coli wytwarzają oba te enzymy, dlatego też w wyniku nakładania się barw, ich kolonie są fioletowe.

• Agar Slanetza-Bartleya stosuje się do oznaczania paciorkowców kałowych. Wymaga on specjalnego przygotowania, ponieważ jeden ze składników zapewniających selektywność podłoża – TTC, jest wrażliwy na działanie temperatury. W przypadku gdyby uległ on degradacji, nie spełniłby swojej funkcji, a wykonany posiew mógłby dać fałszywie dodatnie wyniki. Dlatego też do przygotowania podłoża należy używać sterylnej wody  lub też dodawać TTC już po sterylizacji. Drugim składnikiem, który zapewnia wysoką selektywność, jest azydek sodu. Jednakże, aby potwierdzić pozytywny wynik badania (różowe bądź czerwone kolonie), konieczne jest przeprowadzenie testu potwierdzającego.

• Cetrymid oraz kwas nalidyksowy to składniki hamujące wzrost bakterii gram(+) oraz gram(-), które wykorzystywane są podczas oznaczania w wodzie Pseudomonas aeruginosa. Cechą wykorzystywaną w identyfikacji jest tworzenie barwnika – piocyjaniny. Jej tworzenie wspomagane jest przez składniki podłoża (siarczan IV potasu i chlorek magnezu). Barwnik ten jest niebieski i nie rozpuszcza się w wodzie.

2.3 Metody badawcze

Metody referencyjne

Metoda filtracji membranowej

Metoda ta polega na filtracji określonej objętości płynu przez filtr membranowy. Podłączając kolbę ssawkową do pompki próżniowej, wytwarza się podciśnienie, powodując, że badana ciecz może zostać przesączona. Osad pozostający na filtrze to właśnie drobnoustroje. Następnie przenosi się go na odpowiednią pożywkę i inkubuje. Na powierzchni filtru rosną kolonie, których ilość odpowiada liczbie drobnoustrojów znajdujących się w badanej objętości płynu.

Metoda Colilert®-18

Metoda opiera się na tzw. technologii zdefiniowanych substratów. Wykorzystuje ona uzdolnienia enzymatyczne mikroorganizmów do hydrolizy określonych substratów fluoro- bądź chromogennych, co umożliwia określenie ich obecności oraz ilości. W metodzie Colilert-18® występują dwa substraty: ONPG (orto-nitrofenylo-β-D-glukopiranozyd) oraz MUG (4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronid). Bakterie grupy coli wytwarzają enzym β-D-galaktozydazę, pod jej wpływem dochodzi do hydrolizy ONPG i uwolnienia chromogennego substratu, który powoduje zabarwienie badanej próbki na kolor żółty. Dodatkowo bakterie E. coli produkują β-D-glukuronidazę, która hydrolizuje MUG, powodując uwolnienie substratu fluorogennego, a  próba wykazuje fluorescencję w świetle UV (λ=365 nm).

Metody alternatywne

Metody alternatywne są uzupełnieniem metod referencyjnych.

Reducult® Coliforms

Jest granulowaną pożywką zawierającą substraty fluoro- i chromogenne: MUG oraz X-GAL. Rozpuszcza się ją w 100ml badanej wody, po czym inkubuje w 37°C przez 24 godziny.
Zasada działania jest podobna jak dla podłoża Chromocult® Coliform – dochodzi do hydrolizy substratów, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja bakterii. Bakterie wytwarzające β-D-galaktozydazę powodują zmianę barwy podłoża z żółtej na niebiesko-zieloną, podczas gdy obecność β-D-glukuronidazy wpływa na fluorescencję badanej próby. Jest to test jakościowy.

Reducult® Enterococci

Pożywka analogiczna do Reducult® Coliforms, nie zawiera jednak substratu fluorogennego. Zawartość azydku sodu hamuje wzrost innych bakterii, szczególnie gram(-).

Enterolert®-E i Pseudalert™

Testy analogiczne do testu Colilert®-18. W efekcie hydrolizy substratów za pomocą enzymów, które są produkowane przez odpowiednie bakterie, powstają produkty wykazujące fluorescencję. Testy te służą zarówno do badań ilościowych jak i jakościowych.

Badania potwierdzające

W celu określenia, czy badana woda zawiera określoną grupę bakterii czy też nie, należy wykonać testy potwierdzające.

Bakterie grupy coli i E. coli

W celu potwierdzenia obecności bakterii gr. coli, należy pobrać kolonię z podłoża Endo Les i przeszczepić na skos agarowy. Następnie po inkubacji w temp. 37°C przez 21±2 godziny, wykonuje się test na obecność oksydazy. Jest to enzym, który należy do grupy porfiryn żelazowych i wytwarzany jest przez mikroorganizmy tlenowe, gdyż jego zadaniem jest utlenienie cytochromu c, a w obecności tlenu dochodzi do przenoszenia elektronów. Ponieważ bakterie grupy coli oraz sama E. coli wykazują metabolizm fermentacyjny, to nie wytwarzają one oksydazy, dlatego też wynik testu w postaci żółtej barwy potwierdza obecność bakterii grupy coli. Pojawienie się barwy niebieskiej świadczy o obecności enzymu i negatywnym wyniku na obecność tych bakterii.

W przypadku potwierdzenia obecności bakterii grupy coli należy następnie przeprowadzić test na tworzenie indolu. Wśród bakterii grupy coli, jedynie E. coli daje dodanie wyniki w tej próbie. Wynik ten może być jednak fałszywie dodatni w obecności np. bakterii rodzaju Klebsiella. Dlatego też należy wykonać dodatkowy test na obecność β-D-glukuronidazy. W tym celu wykonuje się test Bactident® E. coli, który łączy w sobie oba wyżej opisane testy. Wykrywanie aktywności β-D-glukuronidazy oraz tryptofanazy ( tworzenie indolu) przeprowadza się w kuwetach zawierających zawiesinę badanych mikroorganizmów, do których wkłada się paski testowe z substratami : MUG oraz tryptofanem. W przypadku testu na tworzenie indolu, dochodzi do deaminacji tryptofanu katalizowanej przez tryptofanazę. Taki test inkubuje się i sprawdza się, czy próba wykazuje fluorescencję, a następnie dodaje odczynnika Kovacsa, który w reakcji z indolem daje czerwone zabarwienie, co potwierdza obecność E.coli.

Paciorkowce kałowe

Jeżeli na podłożu Slanetza-Bartleya pojawiły się kolonie o czerwonym zabarwieniu, należy wykonać test na potwierdzenie obecności enterokoków. Filtr przenosi się na podłoże agarowe z dodatkiem eskuliny. Daje to możliwość odróżnienia ich od innych paciorkowców. Po nałożeniu kolonii na pasek testowy i inkubacji w temperaturze 37°C, dochodzi do wzrostu paciorkowców kałowych w obecności soli żółciowych, a w wyniku hydrolizy eskuliny następuje zmiana barwy kolonii na brązowe/czarne. Inne paciorkowce nie mają takiej zdolności i w przypadku ich obecności nie dochodzi do zmiany barwy.

Pseudomonas aeruginosa

Po przeprowadzonej filtracji membranowej i inkubacji filtra na pożywce z cetrymidem i kwasem nalidyksowym należy zwrócić uwagę na kolor powstałych kolonii. Gdy są one zielone i wykazują fluorescencję przy długości fali λ=365 nm, to nie ma konieczności wykonywania dodatkowych testów potwierdzających obecność tych bakterii

Zdarza się to stosunkowo rzadko, gdyż Pseudomonas aeruginosa często wytwarza dodatkowe barwniki( żółte lub brązowe). W takiej sytuacji należy pozbyć się ich i przeszczepić bakterie na skos agarowy, a następnie wykonać test na obecność aminopeptydazy L-alaniny poprzez pobranie kolonii i wykonanie zawiesiny, w której umieszcza się pasek testowy. Po godzinnej inkubacji odczytuje się wynik - brak zmian barwy oznacza, że badane kolonie są gram(+), z kolei pojawienie się koloru żółtego świadczy o obecności bakterii gram(-).

Wykonuje się także test na wytwarzanie amoniaku z acetamidu, który w obecności odczynnika Nesslera powoduje zmętnienie o żółto-pomarańczowej barwie.

2.3.1 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego Escherichia coli i bakterii grupy coli

Metoda filtracji membranowej

Zestaw do filtracji membranowej zmontowano, opalono pincetę oraz porowatą płytkę w płomieniu palnika i za pomocą pincety umieszczono jałowy filtr membranowy na porowatej płytce aparatu, kratkowaną stroną do góry. Następnie zamocowano lejek, aby nie uszkodzić filtra i nalano 100 ml badanej próby wody (przy zamkniętym kurku). Włączono próżnię, odkręcono kurek i przefiltrowano badaną próbę. Przemyto filtr roztworem przemywającym, po czym zamknięto kurek, ściągnięto lejek i za pomocą wyjałowionej ponownie pincety przeniesiono filtr na pożywkę. W ten sposób wykonano cztery posiewy, które umieszczono na następujących pożywkach:

• Endo Les

• mFC

• pożywka z laktozą, Tergitolem® 7 i TTC

• Chromocult® Coliform Agar

Tak przygotowane płytki inkubowano w temperaturze 37 przez 24 godziny. Po inkubacji zliczono wszystkie domniemane kolonie bakterii grupy coli :

• Endo Les – kolonie czerwone

• mFC – kolonie niebieskie

• pożywka z laktozą, Tergitolem® 7 i TTC – kolonie żółte

• Chromocult® Coliform Agar – wszystkie niebieskie, łososiowe i fioletowe kolonie

Metoda Colilert®-18

Badaną wodę o objętości 100ml wlano do przezroczystej, jałowej buteleczki i wsypano do niej zawartość opakowania Colilert®-18. Buteleczkę zakręcono i delikatnie wymieszano. Po rozpuszczeniu granulatu, zawartość buteleczki przelano to płytki Quanti-Tray®, którą poddano zgrzewaniu. Tak przygotowaną płytkę inkubowano w temperaturze 35 przez 18 godzin, po czym policzono ilość studzienek o żółtej barwie i odczytano wynik testu dla bakterii grupy coli przy pomocy tabeli interpretacji wyników. Policzono również studzienki fluoryzujące w światle UV o długości fali i odczytano wynik testu dla bakterii E. coli przy pomocy tabeli interpretacji wyników.

2.3.2 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego Escherichia coli i bakterii grupy coli

Metoda Readycult® Coliforms 100

100 ml badanej próby wlano do przezroczystej, jałowej buteleczki i wsypano opakowanie Readycult® Coliforms 100, zakręcono, a następnie delikatnie wymieszano. Zakręconą buteleczkę poddano inkubacji w temperaturze 37 przez 24 godziny. Po inkubacji zaobserwowano makroskopowo wzrost bakterii grupy coli poprzez zmianę zabarwienia na niebieski oraz wzrostu E. coli obserwując fluorescencję w świetle UV.

2.3.3 Badania potwierdzające dla bakterii grupy coli

• Test na obecność oksydazy cytochromowej

Ze skosu pobrano materiał biologiczny i naniesiono na część reakcyjną paska testowego, a następnie obserwowano zmianę jej barwy lub jej brak.

• Test na obecność aminopeptydazy L-alaninowej.

Do kuwety wprowadzono 0,2 ml wody destylowanej, następnie pobrano ezą materiał biologiczny ze skosu i utworzono zawiesinę bakterii. Do tak przygotowanej zawiesiny dodano pasek testowy. Próbę inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C i odczytano wynik testu.

• Test na tworzenie indolu i obecność β-D-glukuronidazy Bactident® E.coli

Do kuwety wprowadzono 0,2 ml wody destylowanej, następnie dodano materiał biologiczny przy pomocy ezy i wykonano zawiesinę baterii.
Następnie dodano pasek testowy i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Po tym czasie sprawdzono fluorescencję próby. W przypadku jej wystąpienia dodano następni odczynnika Kovacsa i obserwowano zmianę barwy części reakcyjnej.

2.3.4 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego paciorkowców kałowych

Filtracja membranowa

Filtrację membranową przeprowadzono identycznie jak w przypadku oznaczania bakterii grupy coli. Jedyną różnicą było zastosowanie innego podłoża. W tym przypadku był to agar Slanetza-Bartleya. Po inkubacji zliczono domniemane kolonie paciorkowców kałowych o barwie czerwonej, nie uwzględniając wyników testów potwierdzających.

2.3.5 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego paciorkowców kałowych

Metoda Enterolert® - E

Analizę wykonano w identyczny sposób jak dla testu Colilert®-18. Po inkubacji zliczono studzienki, które wykazywały fluorescencję w świetle UV o długości fali i odczytano wynik przy pomocy tabeli interpretacji wyników.

2.3.6 Badania potwierdzające dla paciorkowców kałowych

• Test na podłożu z eskuliną

Filtr przeniesiono z podłoża Slanetza-Bartleya na podłoże agarowe z eskuliną i obserwowano zmianę barwy kolonii na kolor brązowy/czarny.

2.3.6 Metody referencyjne wykrywania i oznaczania ilościowego Pseudomonas aeruginosa

Metoda filtracji membranowej

Zasada i wykonanie metody jest taka sama jak w przypadku bakterii grupy coli oraz paciorkowców kałowych. Zastosowano jednak pożywkę z cetrymidem i kwasem nalidyksowym. Po inkubacji zliczono niebiesko-zielone kolonie domniemanych bakterii Pseudomonas aeruginosa bez uwzględnienia wyników testów potwierdzających.

2.3.7 Metody alternatywne wykrywania i oznaczania ilościowego Pseudomonas aeruginosa

Metoda Pseudalert™

Wykonanie analizy oraz odczytanie wyników wykonano analogiczne jak w przypadku metody Enterolert® - E.

2.3. Badania potwierdzające dla paciorkowców Pseudomonas aeruginosa

• Test na wytwarzanie amoniaku z acetamidu

• Test na obecność oksydazy cytochromowej

Ten sam test został wykonany dla bakterii grupy coli.

4.Wyniki

Tabela 1. Liczba drobnoustrojów oznaczona metodami referncyjnymi.

Nr próbki	Liczba kolonii bakterii grupy coli [jtk/100cm^3]w podłożu				NPL/100ml
	Endo Les	mFC	Z laktozą, TTC i Tergitolem® 7	Chromocult Coliform Agar		Colilert
						Bakterie gr. coli	E. coli
1	106	0	Niepoliczalne	Niepoliczalne		119,1	0
2	63	0	0	7		9,8	0
3	niepoliczalne	0	0	Niepoliczalne		1	0
4	18	0	0	10		21,1	0
5	174	0	Niepoliczalne	Niepoliczalne		1986,3	29,2
6	140	0	Niepoliczalne	513		1986,3	24,6

Analizując wyniki metod referencyjnych można zaobserwować, że najbardziej zanieczyszczone były próbki z numerami 5 i 6. Również obecność E. coli stwierdzono jedynie w próbkach nr 5 i 6. Brak wzrostu na pożywce mFC może być spowodowany niewłaściwą temperaturą. Brak odczytu w przypadku pożywki z laktozą, TTC i Tergitolem® może być spowodowany przez występowanie mikroflory towarzyszącej.

Tabela 2. Liczba drobnoustrojów oznaczona metodami alternatywnymi.

Nr próbki	Slanetz Bartley Agar [jtk/100cm^3]	Enterolert [NPL/100ml]	Cetrymid Agar [jtk/100cm^3]	Pseudalert [NPL/100ml]
1	0	0	Niepoliczalne	307,6
2	0	0	2	95,9
3	0	0	Niepoliczalne	>2419,6
4	0	0	46	55,6
5	105	6,3	Niepoliczalne	>2419,6
6	89	4,1	Niepoliczalne	>2419,6

Analizując wyniki metod alternatywnych zauważyć można że najbardziej zanieczyszczone były próbki z numerami 5 i 6. Jedynie próbki 5 i 6 zawierały paciorkowce kałowe, na co wskazuje badanie z użyciem pożywki Slanetza- Bartley'a. Metoda Enterolert również stwierdza obecność bakterii kałowych w próbkach 5 i 6. Rozrzut wyników pomiędzy obiema metodami może wynikać, z tego, że nie wszystkie bakterie, które wyrosły na pożywce Slanetza-Bartleya, mogą być bakteriami kałowymi.

Metoda Readycult® Coliforms 100

W wyniku obserwacji makroskopowej zauważono wzrost bakterii z grupy coli, który był widoczny z racji zmiany zabarwienia płynu w buteleczce na niebieski. Dodatkowo w świetle UV wykazywał on fluorescencję co świadczy o obecności E. coli.

Tabela 1. Wyniki potwierdzające dla wykonanych metod.

Test	Szczep bakterii
	E. coli	Enterobacter sp.	Entercoccus sp.	Pseudomonas aeruginosa
Aminopeptydaza	Gram (-)	Gram (-)	Gram (+)	Gram (-)
Oksydaza	ujemny	ujemny	ujemny	dodatni
Bactident E.coli	β-glukuronidaza fluorescencja dodatnia Indol dodatni	β-glukuronidaza fluorescencja ujemna Indol ujemny	N/O	N/O

Analizując powyższe wyniki, można stwierdzić, że zastosowanie metod enzymatycznych dało wyższe wyniki w porównaniu do metody filtracji membranowej. Wynika to z faktu, że stosując filtrację, możemy jedynie stwierdzić wzrost bakterii lub jego brak. W przypadku metod enzymatycznych, wyniki opierają się na metabolizmie bakterii.

5.Wnioski

• Badane wody wykazywały zróżnicowana poziom zanieczyszczenia bakteriami gr. coli i Escherichia coli.

• Próbki wody z numerem 5 i 6 charakteryzował największy poziom zanieczyszczenia bakteriami gr. coli i Escherichia coli.

• Obecność bakterii gr. coli i Escherichia coli odnotowano w próbkach wody z numerem 5 i 6.

• Jedynie w próbkach 5 i 6 wykryto obecność paciorkowców kałowych.

6.Bibliografia

[1,3,6] Libudzisz Z., Kowal K. Żakowska Z. (red): Mikrobiologia techniczna. t. II. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcja żywności. PWN, Warszawa, 2008.

[2] Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 13 listopada 2015r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi.

[4] http://www.kierunekspozywczy.pl/artykul,4433,woda-wodzie-nierowna.html

[5] http://matrix.ur.krakow.pl/~aduda- chodak/dydaktyka/GEWIS1_pliki/0405_teoria.pdf