Laboratorium specjalizacyjne
Sprawozdanie 2
Metody oceny sanitarnej wody
Ewa Świegocka
Biotechnologia
Sem. VI
Nr Indeksu 183884
Wstęp
Woda nie jest dla bakterii chorobotwórczych naturalnym środowiskiem, ponieważ trafiają one przeważnie bezpośrednio do wody z organizmu ludzi lub zwierząt, lub pośrednio przez ścieki, a także z gleby skażonej bakteriami patogennymi. Woda jest wyłącznie przenośnikiem bakterii i to tylko w okresie, w jakim organizmy te mogą przetrwać. Bakteriami patogennymi, które wraz z odchodami i ściekami, a także spływami z pól, mogą się dostać do wody, są głównie mikroorganizmy związane z chorobami przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt, jak również bakterie występujące u nosicieli, szczególnie dotyczy to nosicielstwa stwierdzonego u zwierząt.
Do celów sanitarno - epidemiologicznych stosuje się metody wskazujące pośrednio na obecność drobnoustrojów chorobotwórczych w wodzie, wykrywając tzw. drobnoustroje wskaźnikowe, stanowiące normalną i stałą florę jelitową ludzi i zwierząt. Należą do nich:
-bakterie grupy coli,
-paciorkowce kałowe (Enterokoki),
-laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny
oraz w niektórych przypadkach:
-gronkowce koagulazo-dodatnie
-Pseudomonas aeruginosa
-Legionella sp. [Smyłła A., 2009]
Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia to:
Escherichia coli z najwyższą dopuszczalną wartością 0jtk w 100ml próby wody,
entrokoki z najwyższą wartością 0jtk w 100ml próby wody,
bakterie grupy coli z normą 0jtk w 100ml objętości próbki wody,
Clostridium perfringens (łącznie ze sporami) – 0jtk/100ml wody. [Rozporządzenie ministra zdrowia Dz. U. 2007]
Badania mikrobiologiczne wody w kierunku wykrywania większości drobnoustrojów przeprowadzano stosując metodę filtracji membranowej. Wykrywanie bakterii tą metodą polega na przesączeniu określonej objętości przez jałowy filtr i inkubacji na określonym podłożu. Bakterie w trakcie sączenia zostają zatrzymane na filtrze, który umieszcza się na pożywce wybiórczej, rozwijając się w czasie inkubacji tworzą na powierzchni filtra kolonie o typowym wyglądzie. Do wykrywania: bakterii z grupy coli, oraz Escherichia coli stosowano podłoża Endo Les, mFC oraz z laktozą, TTC i Tergitolem® 7, Chromocult® Coliform Agar, paciorkowców kałowych — agar Slanetz-Bartley 'a, Pseudomonas aeruginosa — podłoże z cetrymidem i kwasem nalidyksowym. Stosowano także metody alternatywne: dla bakterii z grupy oli i Escherichia coli- Readycult® Coliforms 100, Colilert®; dla enterokoków: Enterolert®, natomiast dla Pseudomonas aeruginosa- Pseudoalert™.
Materiały i metody
Materiały
Materiał badawczy stanowiła woda technologiczna odpowiednio zanieczyszczona mikrobiologicznie przez laborantki Instytutu Mikrobiologii Technicznej i Fermentacji na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Biotechnologii Politechniki Łódzkiej.
Stosowane pożywki
W przeprowadzonych analizach zastosowano pożywki Endo Les, mFC, z laktozą, TTC i Tergitolem® 7, Chromocult® Coliform Agar służące do wykrywania bakterii z grupy coli i Escherichia coli, agar Slanetz-Bartley 'a do wykrycia paciorkowców kałowych, natomiast dla Pseudomonas aeruginosa - podłoże z cetrymidem i kwasem nalidyksowym.
2.3 Metody badawcze
2.3.1 Metody referencyjne wykrywania Escherichia coli i bakterii z grupy coli
Metoda filtrów membranowych
Dolną część aparatu filtracyjnego umieszczono w kolbie próżniowej połączonej z pompą próżniową, następnie jałową pincetę krótko opalono w płomieniu i przy zamkniętym kurku aparatu za pomocą opalonej pincety przeniesiono jałowy filtr membranowy (błyszczącą lub kratkowaną stroną do góry) na porowatą płytkę aparatu filtracyjnego. Odłożono pincetę do naczynia z alkoholem. Umocowano lejek na podstawie aparatu filtracyjnego, uważając na to, aby filtr w tym czasie nie uległ pofałdowaniu, po czym badaną objętość wody (100 ml) wlano do lejka i włączono pompę próżniową i otworzono kurek aparatu. Przesączono badaną próbę wody, a następnie spłukano lejek jałowym płynem do rozcieńczeń. Zamknięto kurek, zdjęto lejek i jałową pincetą przeniesiono filtr membranowy z porowatej wkładki aparatu filtracyjnego na płytkę Petriego z pożywką selektywną w taki sposób, aby pęcherzyki powietrza nie były obecne pod filtrem. Płytkę z filtrem umieszczono w cieplarce do góry dnem i inkubowano w 36⁰C lub 44⁰C przez 21-23 godziny. Po inkubacji policzono kolonie, niezależnie od wielkości, które dały kolonie żółte na agarze z laktozą, TTC i Tergitolem®7, na agarze Endo- czerwone kolonie, a na podłożu mFC niebieskie kolonie, oraz na podłożu chromogennym Chromocult® Coliform Agar czerwone lub łososiowe kolonie, a pałeczki Escherichia coli na tym podłożu dają fioletowe kolonie. Na podstawie liczby kolonii określono liczbę domniemanych bakterii grupy coli obecnych w 100 ml próbki.
2.3.2 Metody alternatywne wykrywania Escherichia coli i bakterii z grupy coli
Metoda Readycult® Coliforms 100
Badaną wodę (100 ml) wlano do jałowego, przezroczystego naczynia zamykanego na zakrętkę, następnie jedno opakowanie Readycult® Coliforms 100 otworzono i dodano do badanej wody. Naczynie z wodą szczelnie zamknięto i wstrząsano w celu całkowitego rozpuszczenia granulatu, następnie próbę oznaczono i inkubowano w temperaturze 37°C przez 18-24 godziny. Po inkubacji dokonano makroskopowych obserwacji wzrostu bakterii grupy coli, które zmieniają zabarwienie na niebieski oraz E. coli przy pomocy światła UV (obecna fluorescencja roztworu ).
Metoda Colilert-18®
Badaną wodę (100 ml) wlano do jałowego, przezroczystego naczynia zamykanego na zakrętkę, następnie jedno opakowanie Colilert-18® otworzono i dodano do badanej wody. Naczynie z wodą szczelnie zamknięto i wymieszano delikatnie w celu całkowitego rozpuszczenia granulatu, następnie wlano zawartość do płytki Quanti-Tray®, szczelnie ją zamknięto w zgrzewarce do płytek i inkubowano w cieplarce przy 35⁰C przez 18 godzin. Po inkubacji policzono ilość dodatnich studzienek, które zmieniły zabarwienie na żółte i odczytano wynik testu dla bakterii grupy coli zgodnie z tabelą interpretacji wyników. Następnie policzono ilość studzienek dodatnich, wykazujących fluorescencję w świetle UV i odczytano wynik dla bakterii Escherichia coli zgodnie z tabelą interpretacji wyników.
2.3.3 Badania potwierdzające dla Escherichia coli
test na obecność osydazy cytochromowej (pojawienie się intensywnego niebieskiego zabarwienia po dodaniu odczynnika na oksydazę, świadczy o obecności tego enzymu i jednocześnie wyklucza obecność bakterii grupy coli, które są oksydazoujemne. Gatunki z rodzaju Aeromonas (Pseudomonas aeruginosa) mogą również wytwarzać kwas i gaz z laktozy, jedynie pozytywna reakcja na oksydazę odróżnia je od bakterii grupy coli)
test na tworzenie indolu (sprawdza się po 24-godzinnej inkubacji w wodzie peptonowej z tryptofanem, dodając do hodowli po ściance probówki kilka kropli odczynnika Ehrlicha. Pojawienie się czerwonego zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu, czyli o wyniku dodatnim)
po dodaniu odczynnika Kovacsa do buteleczki, w której wykonywano oznaczanie metodą Readycult® Coliforms, powstaje fioletowa obrączka na powierzchni roztworu, co świadczy o obecności bakterii z grupy coli.
Test na obecność aminopeptydazy L-alaniny (do wykonania testu konieczne jest korzystanie z czystych kultur bakterii, po zwilżeniu paska wodą i inkubacji w 37⁰C przez 2 godziny, pasek zmienia zabarwienie na kolor żółty)
2.3.4 Metody referencyjne wykrywania enterokoków
Metoda filtrów membranowych
Dolną część aparatu filtracyjnego umieszczono w kolbie próżniowej połączonej z pompą próżniową, następnie jałową pincetę krótko opalono w płomieniu i przy zamkniętym kurku aparatu za pomocą opalonej pincety przeniesiono jałowy filtr membranowy (błyszczącą lub kratkowaną stroną do góry) na porowatą płytkę aparatu filtracyjnego. Odłożono pincetę do naczynia z alkoholem. Umocowano lejek na podstawie aparatu filtracyjnego, uważając na to, aby filtr w tym czasie nie uległ pofałdowaniu, po czym badaną objętość wody (100 ml) wlano do lejka i włączono pompę próżniową i otworzono kurek aparatu. Przesączono badaną próbę wody, a następnie spłukano lejek jałowym płynem do rozcieńczeń. Zamknięto kurek, zdjęto lejek i jałową pincetą przeniesiono filtr membranowy z porowatej wkładki aparatu filtracyjnego na płytkę Petriego z pożywką selektywną w taki sposób, aby pęcherzyki powietrza nie były obecne pod filtrem. Płytkę z filtrem umieszczono w cieplarce do góry dnem i inkubowano 36±2⁰C przez 21±3 godzin. Po inkubacji policzono wyrosłe kolonie koloru czerwonego na pożywce Slanetza-Bartleya. Na podstawie liczby kolonii określono liczbę domniemanych bakterii grupy coli obecnych w 100 ml próbki.
2.3.5 Metody alternatywne wykrywania paciorkowców kałowych
Metoda Enterolert®-E
Badaną wodę (100 ml) wlano do jałowego, przezroczystego naczynia zamykanego na zakrętkę, następnie jedno opakowanie Enterolert®-E otworzono i dodano do badanej wody. Naczynie z wodą szczelnie zamknięto i wymieszano delikatnie w celu całkowitego rozpuszczenia granulatu, następnie wlano zawartość do specjalnej płytki, szczelnie ją zamknięto w zgrzewarce do płytek i inkubowano. Po inkubacji policzono ilość studzienek dodatnich, wykazujących fluorescencję w świetle UV i odczytano wynik dla bakterii z rodzaju Enterococcus zgodnie z tabelą interpretacji wyników.
2.3.6 Metody referencyjne wykrywania bakterii Pseudomonas aeruginosa
Metoda filtrów membranowych
Dolną część aparatu filtracyjnego umieszczono w kolbie próżniowej połączonej z pompą próżniową, następnie jałową pincetę krótko opalono w płomieniu i przy zamkniętym kurku aparatu za pomocą opalonej pincety przeniesiono jałowy filtr membranowy (błyszczącą lub kratkowaną stroną do góry) na porowatą płytkę aparatu filtracyjnego. Odłożono pincetę do naczynia z alkoholem. Umocowano lejek na podstawie aparatu filtracyjnego, uważając na to, aby filtr w tym czasie nie uległ pofałdowaniu, po czym badaną objętość wody (100 ml) wlano do lejka i włączono pompę próżniową i otworzono kurek aparatu. Przesączono badaną próbę wody, a następnie spłukano lejek jałowym płynem do rozcieńczeń. Zamknięto kurek, zdjęto lejek i jałową pincetą przeniesiono filtr membranowy z porowatej wkładki aparatu filtracyjnego na płytkę Petriego z pożywką selektywną w taki sposób, aby pęcherzyki powietrza nie były obecne pod filtrem. Płytkę z filtrem umieszczono w cieplarce do góry dnem i inkubowano w 36±2⁰C przez 21±3 godzin. Po inkubacji policzono wyrosłe kolonie koloru niebiesko-zielonego na pożywce z cetrymidem i kwasem nalidyksowym. Na podstawie liczby kolonii określono liczbę domniemanych bakterii grupy coli obecnych w 100 ml próbki.
2.3.7 Metody alternatywne wykrywania bakterii Pseudomonas aeruginosa
Metoda Pseudalert™
Badaną wodę (100 ml) wlano do jałowego, przezroczystego naczynia zamykanego na zakrętkę, następnie jedno opakowanie Pseudalert™ otworzono i dodano do badanej wody. Naczynie z wodą szczelnie zamknięto i wymieszano delikatnie w celu całkowitego rozpuszczenia granulatu, następnie wlano zawartość do specjalnej płytki, szczelnie ją zamknięto w zgrzewarce do płytek i inkubowano. Po inkubacji policzono ilość studzienek dodatnich, wykazujących fluorescencję w świetle UV i odczytano wynik dla bakterii Pseudomonas aeruginosa zgodnie z tabelą interpretacji wyników.
Wyniki
Wyniki badań przedstawiono w tabeli poniżej.
Tabela 1. Liczby drobnoustrojów oznaczane różnymi metodami
| Próba wody | Escherichia coli | Enterokoki | Pseudomonas aeruginosa |
|---|---|---|---|
| Endo | mFC | TTC | |
| 1 | 14 | 0 | 28 |
| 2 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 0 |
| - (nie badano) |
Na podstawie uzyskanych wyników, można zauważyć, że woda oznaczona numerem 2 nie zawiera żadnego z badanych wskaźników sanitarnych. W przypadku wody oznaczonej numerem 1 wykryto obecność bakterii Escherichia coli oraz bakterii z grupy coli, natomiast woda naznaczona numerem 3 zawierała bakterie Pseudomonas aeruginosa. W metodach enzymatycznych uzyskano lepsze wyniki, ponieważ bakterie wyodrębnione poprzez filtrację są w słabej kondycji fizjologicznej, jednakże mają dobrą kondycję aktywności enzymatycznej.
Na podstawie powyższych badań można zauważyć, iż wzrost bakterii zależy od składu i rodzaju pożywki.
Wnioski
W metodach alternatywnych wyniki są wyższe niż w metodach referencyjnych.
Woda oznaczona numerem 2 nie zawierała żadnych bakterii wskaźnikowych.
W żadnej z prób nie wykryto paciorkowców kałowych.
Literatura
Smyłła A., (2009), Zagrożenia bakteryjne wód powierzchniowych
Smyłła A., Analiza sanitarna wody, wyd. WSP, Częstochowa, 2002
Rozporządzenie Ministra Zdrowia Dz. U. 2007/61 poz. 417 (29.03.2007)
Libudzisz Z., K. Kowal (red), Mikrobiologia techniczna, T.1. Politechnika Łódzka, Łódź 2000