Laboratorium specjalizacyjne

Sprawozdanie 3

Ilościowe metody określania działania bakteriobójczego i grzybobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych stosowanych w przemyśle

Ewa Świegocka

Biotechnologia

Sem. VI

Nr Indeksu 183884

1. Wstęp

Coraz większe wymagania dotyczące standardów higieny i bezpieczeństwa żywności powodują wzrost zainteresowania różnymi metodami dezynfekcji i ich wykorzystaniem. W zakładach produkujących żywność proces dezynfekcji odbywa się najczęściej z wykorzystaniem chemicznych środków dezynfekcyjnych- tzw. Biocydów. Są to związki pochodzenia syntetycznego lub naturalnego wykorzystywane w rolnictwie, przechowalnictwie, zwalczające niepożądane organizmy i mikroorganizmy. [Kręgiel, 2012]

Aktywność przeciwdrobnoustrojowa jest podstawową cechą środków dezynfekcyjnych oraz antyseptycznych. Zarówno czas działania, stężenie preparatu, jak i deklarowany zakres działania przeciw drobnoustrojom takim jak bakterie, grzyby, spory, zarodniki i wirusy, a także sposób użycia preparatu to niezbędne elementy, które powinny być dokładnie ustalone przez wytwórcę i podane użytkownikowi w materiałach informacyjnych. [Tyski, 2007]

Istotnym problemem występującym podczas procesu dezynfekcji jest oporność drobnoustrojów. Oporność na czynniki chemiczne polega na uruchomieniu przez komórkę mechanizmów odpowiedzialnych za obniżenie aktywności bójczej dezynfektantów czy antybiotyków. W zależności od charakteru mechanizmów obronnych wyróżnia się kilka typów oporności: wrodzoną (naturalną), nabytą (fenotypową lub genotypową) oraz krzyżową. Mikroorganizmy mają różnorodną naturalną wrażliwość na chemiczne środki przeciwdrobnoustrojowe, co sprawia, że najłatwiej zniszczyć wirusy lipofilne i bakterie Gram dodatnie. Do najbardziej opornych należą priony - bialka odpowiedzialne za chorobę BSE (bydlęce gąbczaste zwyrodnienie mózgu) czy chorobę Creutzfelda-lacoba u ludzi.

Oprócz rodzaju drobnoustrojów ważnym czynnikiem decydującym o skuteczności dezynfekcji jest liczebność komórek, ich forma morfologiczna, oraz ich stan fizjologiczny. Należy pamiętać, iż zbyt długie stosowanie preparatów zawierających te same substancje czynne w środowiskach, w których mogą tworzyć się biofilmy sprzyja powstawaniu oporności drobnoustrojów. Ważna jest więc zmiana dezynfektanta, ale koniecznie na taki, który ma inną substancję czynną, np. czwartorzędowych soli amoniowych na aldehyd glutarowy. [Kręgiel, 2012] Dobry preparat dezynfekcyjny powinien:

• cechować się wysoką stabilnością w wodzie twardej,

• działać w małym stężeniu przez krótki okres w temperaturze otoczenia,

• nie być toksyczny,

• być bezpieczny dla zdrowia,

• nie posiadać zapachu,

• wykazywać obojętność wobec dezynfekowanych powierzchni. [ Libudzisz i wsp., 2008].

1. Materiały i metody

2.1 Materiały

Materiał badawczy stanowiły zawiesiny bakterii przygotowane przez laborantki Instytutu Mikrobiologii Technicznej i Fermentacji na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Biotechnologii Politechniki Łódzkiej.

2. Stosowane pożywki

W przeprowadzonych analizach zastosowano pożywki TSA i TSB do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów, oraz pożywkę MEB do oznaczania liczby drożdży i pleśni.

2. Metody badawcze

   1. Wyznaczenie minimalnego stężenia środka dezynfekującego hamującego wzrost drobnoustrojów metodą seryjnych rozcieńczeń

Do probówki zawierającej 1 ml odpowiedniego dla badanego mikroorganizmu podłoża: dla bakterii TSB lub grzybów MEB, dodano 1 ml roztworu dezynfektanta QAC o stężeniu 5%. Do probówek dodano badany środek bakteriobójczy w odpowiednich, malejących stężeniach, czyli pobierano po 1 ml pożywki z dezynfektantem i przenoszono do następnej probówki. Czynność powtarzano, aż do uzyskania rozcieńczenia 1:1024. Do każdej próby wprowadzono 1 ml zawiesiny bakterii lub drożdży w tryptonowym roztworze chlorku sodu. Wykonano próbę kontrolną bez dodatku związków dezynfekcyjnych (1ml pożywki + 1 ml inokulum), oraz próbę kontrolną zawierającą pożywkę i dezynfektant. Hodowle inkubowano przez 24 godziny w temperaturze optymalnej dla wzrostu drobnoustrojów (dla wykonywanej próby Pseudomonas fluorescens 30⁰C). Następnie odczytano zmętnienie prób z zastosowaniem densytometru.

1. Badanie grzybobójczego i bakteriobójczego działania preparatu dezynfekcyjnego metodą rozcieńczania- neutralizowania

Do probówki dodano 1 ml substancji obciążającej (sacharozy) oraz 1 ml zawiesiny testowej drożdży lub bakterii, następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Po inkubacji dodano 8 ml 0,5% roztworu TAAB-2. Próby inkubowano w temperaturze pokojowej w odpowiednim czasie- 5 minut bakterie i 15 minut drożdże. Następnie 1 ml uzyskanej mieszaniny przenieść do probówki zawierającej 8 ml neutralizatora i 1 ml wody, po czym inkubowano 5 minut w temperaturze pokojowej. Po neutralizacji wysiano po 1 ml mieszaniny na 2 płytki Petriego i zalano upłynnioną pożywką MEA dla drożdży i TSA dla bakterii. Inkubowano przez 24- 48 godzin w temperaturze odpowiednio: dla drożdży 30⁰C i dla bakterii 37⁰C. Po zakończeniu inkubacji zapisano liczbę jtk/ml w testowej zawiesinie bakterii i po procedurze badania działania bakteriobójczego produktu, a następnie obliczyć redukcję liczby zdolnych do życia bakterii.

1. Wyniki

Wyniki opisanych powyżej badań przedstawiono w tabelach poniżej.

Tabela 1. Wyznaczanie minimalnego stężenia środka dezynfekcyjnego QAC hamującego wzrost drobnoustrojów.

	Rozcieńczenie
Drobnoustrój	1:2 (1,25%)
Saccharomyces cerevisiae	3,3
	3,3
Pseudomonas fluorescens	7,3
	6,8
Escherichia coli	3,8
	3,6

Rys. 1. Zależność zmętnienia od rozcieńczenia danej próby

Na podstawie powyższego wykresu można stwierdzić, że w próbach oznaczonych numerem 6, czyli posiadających rozcieńczenie 1: 64 wystąpiło najmniejsze zmętnienie badanych prób. Oznacza to, że w tym rozcieńczeniu efektywność dezynfektanta jest najskuteczniejsza.

Tabela 2. Wyznaczanie minimalnego stężenia środka dezynfekcyjnego QAC hamującego wzrost drobnoustrojów- wyniki dla prób kontrolnych oraz MIC.

	K	K1	MIC
Saccharomyces cerevisiae	5,6	0,5	0,039
	6,1	0,5	0,039
Pseudomonas fluorescens	6,8	7,2	0,039
	7,9	6,3	0,039
Escherichia coli	7,8	8,0	0,039
	8,0	7,3	0,19
K, K1- próby kontrolne

Przykładowe obliczenia dla najmniejszego stężenia preparatu hamującego wzrost drobnoustrojów MIC:

$\frac{5\%}{64} = 0,0781$ , $\frac{0,0781}{2} = 0,039$

Z tabeli wynika, że najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii Pseudomonas fluorescens i drożdży Saccharomyces cerevisiae, wynosi 0,039, natomiast w przypadku bakterii Escherichia coli najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii jest równe 0,019

Tabela 3. Ogólna liczba badanych drobnoustrojów przed i po wprowadzeniu 0,5% roztworu TAAB-2

	Liczba drobnoustrojów
	N [jtk/ml]
Saccharomyces cerevisiae	1,07*10^7
	1,2*10^7
Pseudomonas fluorescens	2*10^9
	2*10^9
Escherichia coli	7,5*10^8
	7,6*10^8
nb- nieobecne w badanej próbie N- liczba jtk/ml w testowanej zawiesinie (drożdże z komory Thoma/ bakterie z wysiewów) Na- liczba jtk/ml po działaniu dezynfektanta

Na podstawie powyższej tabeli można zauważyć, iż dezynfektant jest skuteczny, ponieważ nie stwierdzono obecności kolonii drobnoustrojów na płytkach z dezynfektantem.

1. Wnioski

• Najmniejszym stężeniem środka dezynfekcyjnego QAC hamującego wzrost drobnoustrojów było stężenie wynoszące 1:64.

• Zgodnie z normą PN-EN 1650:2000 wynika, że preparat dezynfekcyjny TAAB-2 o stężeniu użytkowym 0,5% zahamował wzrost i spowodował 100- krotną redukcję liczby komórek Saccharomyces cerevisiae w ciągu 15 minut, oraz Pseudomonas fluorescens i Escherichia coli w czasie 5 minut.

1. Literatura

1. Kręgiel D., (2012). Higiena produkcji pod kontrolą, „Agro Przemysł”, 1, 62- 66.

2. Tyski S., (2007). Jakich badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej powinno się wymagać od wytwórców preparatów antyseptycznych i dezynfekcyjnych z obszaru medycznego?, „Zakażenia”, 4, 27-30.

3. Libudzisz Z., Kowal K. Żakowska Z. (red): Mikrobiologia techniczna. t. II. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji żywności. PWN, Warszawa, 2008.