Sprawozdanie F laboratorium Biochemia

Temat: Wpływ pH na aktywność enzymów

Data zajęć: 16.01.2014

Prowadząca: dr inż Beata Greb-Markiewicz

Wykonawcy: Aleksandra Grodek 193200, Michał Izydorczyk, Grupa IV

1. Wstęp teoretyczny

Prawie wszystkie enzymy są wrażliwe na zmian pH środowiska. Ich aktywność jest maksymalna tylko w wąskim przedziale pH, tzw. optimum pH.

Zmiana pH wpływa na aktywność enzymu ponieważ:

• Zmiana pH środowiska zmienia stan zjonizowania grup jonizujących w enzymie;

współdziałanie substratu z enzymem zależy od rozmieszczenia ładunków w cząsteczce

enzymu

• Powinowactwo różnych form jonowych substratu do enzymu będzie różne w

przypadku kiedy substrat obdarzony jest ładunkami

• Przekształcenie kompleksu enzym-substrat może zachodzić tylko przy jego

określonym stanie zjonizowania

• W silnie kwaśnym lub zasadowym środowisku następuje nieodwracalna denaturacja

białka, a więc i enzymu który także jest białkiem

Stabilność enzymu w różnych pH zależy od wielu czynników, tj. temperatura, siła jonowa i natura chemiczna buforu, stężenia różnych ochraniaczy, stężenie enzymu, substratów i kofaktorów oraz stężenie zanieczyszczających jonów metali. Inwertaza, enzym używany w doświadczeniu, katalizuje reakcję przeniesienia reszty fruktozowej na inne niż woda akceptory. Spełnia rolę hydrolazy i transferazy. Inwertaza katalizuje reakcję hydrolizy sacharozy do glukozy i fruktozy. Stężenia powstających cukrów redukujących można oznaczyć metodą Nelsona: w środowisku alkalicznym cukrowce mogą redukować tlenki i wodorotlenki metali ciężkich (Cu, Ag, Bi).

Wodorotlenki takie są nierozpuszczalne w wodzie, ale ich kompleksy można utrzymać w obecności związków organicznych zawierających sąsiadujące ze sobą grupy wodorotlenowe (np. winian sodowo-potasowy). Winian tworzy z wodorotlenkiem miedziowym rozpuszczalny kompleks który w miarę redukcji Cu2+ przez cukrowce rozpada się, dostarczając nowych jonów Cu2+, które są redukowane do Cu1+ tworzących nierozpuszczalny osad Cu2O. Cukier redukujący utlenia się do kwasu. Następnie Cu2O redukuje kwas molibdenowy do tzw. Błękitu molibdenowego. Niebieski kolor reakcji pojawia się szybko i nie ulega zmianom w czasie. Maksimum ekstynkcji występuje przy 660 nm.

1. Cel ćwiczenia

Poznawczy: Zbadanie wpływu pH na aktywność enzymów na przykładzie reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę zawartą w wyciągu drożdżowym.

Metodyczny: Zapoznanie się z jedną z metod oznaczania stężenia cukrów redukujących- metodą Nelsona.

1. Materiały

a. Odczynniki:

• Wyciąg drożdżowy zawierający inwertazę

• 2% roztwór sacharozy

• 0,005% roztwór glukozy

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 4,5

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 5,2

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 5,6

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 6,6

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 7,2

• odczynnik miedziowy A (2,4% NaKC4H4O6, 5% NaHCO3, 4% Na2CO3,

3,6% K2C2O4)

• odczynnik miedziowy B (1,3% CuSO4*5H2O)

• odczynnik arseno-molibdenowy

b. Szkło labolatoryjne:

• probówki chemiczne,

• probówki kalibrowane,

c. Aparatura:

• Specol

• pipety automatyczne

• kuwety

• łaźnie wodne o temperaturach: 37°C, 100°C

1. Przygotowanie ćwiczenia

1. Krzywa standardowa

1. Przygotowano 26 suchych probówek podpisanych zgodnie z Tabelami 1 i 2 oraz łaźnię wodną na 100C

2. Przygotowano odczynnik miedziowy do oznaczania stężenia glukozy: zmieszano 6ml odczynnika A z 6 ml odczynnika B

3. Do 16 ponumerowanych kalibrowanych probówek ponumerowanych zgodnie z Tabelą 1 odmierzono po 0,5 ml odczynnika miedziowego

4. Do probówek 1-6 odmierzono 0,005% standardu glukozy zgodnie z Tabelą 1.

5. Roztwory glukozy uzupełniono wodą destylowaną do 0,5ml zgodnie z Tabelą 1.

1. Badanie wpływu pH na aktywność inwertazy

1. Do 10 probówek ponumerowanych zgodnie z Tabelą 2 dodano po 5ml 2% sacharozy i po 0,5ml 1/15 M buforu fosforanowego o różnych pH.

2. Probówki inkubowano przez 5 minut w temp. 40C

3. Wyjęto probówki z łaźni i przygotowano stoper

4. Do probówek nieprimowanych dodano enzymu i odmierzano czas (10 minut)

5. Do probówek primowanych dodano po 0,5ml wody destylowanej

6. Probówki włożono do łaźni i inkubowano przez 10 minut

7. Pobrano po 0,1ml każdej mieszaniny reakcyjnej i dodano dodano do przygotowanych wcześniej probówek kalibrowanych z odczynnikiem miedziowym

8. Do probówek 7,7’ i 11,11’ dodano 0,4ml wody destylowanej

9. Próby 1-11’ inkubowano 10 minut w 100C w celu stworzenia optymalnych warunków do przebiegu reakcji z odczynnikiem miedziowym

10. Oziębiono w zimnej wodzie

11. Dodano po 0,5ml odczynnika arseno-molibdenowego i zamieszano

12. Roztwory dopełniono wodą destylowaną do objętości do 5ml

13. Odczytano absorbancję prób 1-11’ przy dł. Fali 660nm wobec odnośnika (próbka 1)

1. Wyniki

Tabela 1.

Nr. próbki	V odczynnika miedziowego [ml]	V standardu glukozy [ml]	V H2O destylowanej [ml]	Próby E+S Nr ml	V odczynnika arseno-molibdenowego	A 660	A 660 /kor/
1	0,5	-	0,5	-	-	0,5	odnośnik
2	0,5	0,1	0,4	-	-	0,5	0,117
3	0,5	0,2	0,3	-	-	0,5	0,178
4	0,5	0,3	0,2	-	-	0,5	0,290
5	0,5	0,4	0,1	-	-	0,5	0,640
6	0,5	0,5	-	-	-	0,5	0,764
7	0,5	-	-	12	0,1	0,5	0,712
7’	0,5	-	-	12’	0,1	0,5	0,100
8	0,5	-	-	13	0,1	0,5	0,636
8’	0,5	-	-	13’	0,1	0,5	0,109
9	0,5	-	-	14	0,1	0,5	0,610
9’	0,5	-	-	14’	0,1	0,5	0,097
10	0,5	-	-	15	0,1	0,5	0,451
10’	0,5	-	-	15’	0,1	0,5	0,100
11	0,5	-	-	16	0,1	0,5	0,202
11’	0,5	-	-	16’	0,1	0,5	0,075

Tabela 2.

Nr próbki	V sarachrozy [ml]	V buforu fosforanowego [ml]	pH buforu fosforanowego	V enzymu [ml]	V H2O destylowanej [ml]
12	5	0,5	4,5	0,5	-
12’	5	0,5	4,5	-	0,5
13	5	0,5	5,2	0,5	-
13’	5	0,5	5,2	-	0,5
14	5	0,5	5,6	0,5	-
14’	5	0,5	5,6	-	0,5
15	5	0,5	6,6	0,5	-
15’	5	0,5	6,6	-	0,5
16	5	0,5	7,2	0,5	-
16’	5	0,5	7,2	-	0,5

1. Obliczenia

A₆₆₀/kor/ - absorbancja opisująca ilośc glukozy powstałą w reakcji enzymatycznej

m_G^P - masa glukozy powstała w reakcji eznymatycznej [μg]

m_G^M - masa glukozy zawarta w 6 ml mieszaniny reakcyjnej (próbki 12-16) [μg]

n_G^M – ilość glukozy w mieszaninach reakcyjnych [μmol]

Akt_inwertazy – aktywnośc inwertazy [U\ml]

Stężenie masowe roztworu glukozy (standardu) C_G^stand. [mg/ml]:

C_G^stand=0,005 g/ml=0,05 mg/ml

Masa glukozy m_G^stand [μg] w próbkach 1-6:

m_G^stand.=C_G^stand.•V_G^stand.

1. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0\text{ml} = 0\text{μg}$

2. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0,1\text{ml} = 5\text{μg}$

3. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0,2\text{ml} = 10\text{μg}$

4. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0,3\text{ml} = 15\text{μg}$

5. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0,4\text{ml} = 20\text{μg}$

6. $m_{G}^{\text{stand}.} = 0,05\frac{\text{mg}}{\text{ml}} \bullet 0,5\text{ml} = 25\text{μg}$

Absorbancja opisująca ilość glukozy powstałej w reakcji enzymatycznej A₆₆₀/kor/

A₆₆₀/kor/=A₆₆₀ − A′₆₆₀

A₆₆₀- pomiar absorbancji roztworów „nieprimowanych”

A’₆₆₀-pomiar absorbancji roztworów „primowanych” -absorbancja wynikająca z nieenzymatycznej hydrolizy sacharozy

Przykład:

A₆₆₀/kor/=0, 712 − 0, 100 = 0, 612

Masa glukozy powstała w reakcji enzymatycznej m_G^P[μg] obliczona korzystając z krzywej standardowej

Równanie krzywej standardowej:

y = 0, 0314x

A₆₆₀/kor/=0, 0314 • m_G^P

Przykład:

0, 612 = 0, 0314 • m_G^P

$$m_{G}^{P} = \frac{0,612}{0,0314} = 19,49$$

Masa glukozy zawartej w 6 ml mieszaniny reakcyjnej (próbki 12-16) m_G^M [μg]

Korzystamy z zależności:

$$\frac{m_{G}^{M}}{V_{M}} = \frac{m_{G}^{P}}{V_{M - P}} \rightarrow m_{G}^{M} = \frac{V_{M} \bullet m_{G}^{P}}{V_{M - P}}$$

m_G^M-masa glukozy w mieszaninie reakcyjnej (próbki 12-16) [μg]

m_G^P-masa glukozy w próbkach badanych (próbki 7-11) [μg]

V_M- objętość mieszaniny reakcyjnej [ml] – 6ml

V_M-P -objętość mieszaniny reakcyjnej przeniesionej do próbki badanej [ml] – 0,1ml

Przykład:

$${\ m}_{G}^{M} = \frac{6 \bullet 19,49}{0,1} = 1169,4\ \text{μg}$$

Liczność glukozy w mieszaninach reakcyjnych (próbki 12-16) n_G^M [μmol]

M_G=180 g/mol=180μg/μmol

$$n_{G}^{M} = \frac{m_{G}^{M}}{M_{G}}$$

Przykład:

$$n_{G}^{M} = \frac{1169,4}{180} = 6,50\ \text{μmol}$$

Aktywność inwertazy w próbach badanych (próbki 7-11) Akt_inwertazy$\left\lbrack \frac{U}{\text{ml}} \right\rbrack$

$$\text{Akt}_{\text{inwertazy}} = \frac{n_{G}^{M}}{t_{\text{reakcji}} \bullet V_{E}}$$

n_G^M-liczność glukozy w mieszaninie reakcyjnej (próbki 12-16) [μmol]

t_reakcji-czas reakcji hydrolizy [min] – 10min

V_E-objętość enzymu dodana do mieszaniny reakcyjnej [ml] – 0,5ml

Tabela 3.

pH	A660/kor/	mG^P [μg]	mG^M [μg]	nG^M [μmol]	Aktinwertazy[U/ml]
4,5	0,612	19,49	1169,4	6,50	1,300
5,2	0,527	16,78	1006,8	5,59	1,118
5,6	0,513	16,34	980,4	5,45	1,090
6,6	0,351	11,18	670,8	3,73	0,674
7,2	0,127	4,04	242,4	1,35	0,270

Przykład:

$$\text{Akt}_{\text{inwertazy}} = \frac{6,50}{10 \bullet 0,5} = 1,3\frac{U}{\text{ml}}$$

1. Wnioski

Badany przez nas enzym katalizuje reakcję hydrolizy sacharozy do glukozy i fruktozy. Przeprowadzone ćwiczenie ukazało znaczący wpływ pH na aktywność enzymu inwertazy. Optimum pH dla badanego przez nas enzymu mieści się pomiędzy 5,2 i 5,6. W wyższym pH enzym denaturuje, przez co zmniejsza się jego aktywność. Przy wykresie zależności aktywności inwertazy od pH pominęłyśmy punkt odpowiadający próbie nr 12, ponieważ jego wartość jest zawyżona. Błąd prawdopodobnie wynika z tego, że ćwiczenie zostało wykonane ze zbyt mała dokładnością. Krzywa standardowa dla glukozy została wyznaczona w celu obliczenia ilości glukozy, która powstała w reakcji enzymatycznej.