Sprawozdanie A laboratorium Biochemia

Temat: Wyznaczanie stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej

Data zajęć: 24.10.2013

Prowadząca: dr inż Beata Greb-Markiewicz

Wykonawcy: Aleksandra Grodek 193200, Michał Izydorczyk, Grupa IV

1. Wstęp teoretyczny

Kataliza enzymatyczna zajmuje się badaniem zależności szybkości reakcji chemicznej od specyficzności enzymu do substratu, oraz ich stężeniami. Na ten proces składa się parę szeregów reakcji: enzym oddziaływuje z substratem; powstaje kompleks enzym-substrat; substrat jest przekształcany w produkt; końcowym etapem jest odczepienie produktu od enzymu. Uwolniony enzym może zostać wykorzystany do katalizowania kolejnej reakcji chemicznej. Wszystkie te etapy służą do opisania kinetyki enzymatycznej.

Przyjmując, że proces jest nieodwracalny (produkty nie przechodzą w substrat); stężenie początkowe enzymu jest dużo mniejsze niż początkowe stężenie substratu; nie zmienia się w czasie stężenie kompleksu enzym-substrat (przybliżenie stanu stacjonarnego). Wtedy spełnione jest równanie Michaelisa- Menten:

$$V = \frac{V_{\max}*\lbrack S\rbrack}{K_{m} + \ \lbrack S\rbrack}$$

gdzie: [S]- stężenie substratu

V- szybkość reakcji

Vmax- szybkość takiej reakcji, w której cały enzym jest związany z substratem

Km- stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej szybkości

maksymalnej, stała Michaelisa

Celem doświadczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa oraz szybkości maksymalnej reakcji, katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.

2. Materiały

a) Odczynniki:

-0.25 M bufor octanowy o pH 5.0

-0.5 M wodorotlenek sodu

- 5 mM roztwór standardowy p-nitrofenolu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

-5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0,

CE = 0,08 mg/ml

b) Szkło laboratoryjne i aparatura:

• pipety 0,2 ml (2 szt.) 1 ml (2 szt.) oraz tipsy

• zlewki 100ml i 400ml

• kolba 10ml

• probówki chemiczne ( 40 szt.)

• kuwety

• Specol

• termostat nastawiony na 37 stopni

3. Przebieg ćwiczenia

1. Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.

a) Do 21 probówek podpisanych zgodnie z Tabelą 1 dodano poniżej wymienione roztwory

• 0.25 M bufor octanowy o pH = 5.0,

• 5.0 mM p-nitrofenylofosforan – substrat

w ilościach zadanych w Tabeli 1.

b) Roztwory inkubowano przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37 C.

c) Do primowanych probówek dodano roztwór fosfatazy

d) Próby 1-11 inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37 C

e) W tym czasie przystąpino do wykonywania drugiej części ćwiczenia "Krzywa

standardowa”.

f) Po upływie 25 minut inkubacji do wszystkich próbek dodano po 2ml 0,5M roztworu

NaOH, który przerwał reakcję katalizowaną przez enzym.

g) Zmierzyno absorbancję roztworów przy długości fali 410nm względem próby 11

(odnośnika).

2. Krzywa standardowa.

a) Otrzymany roztwór p-nitrofenolu rozcieńczono 50-krotnie w kolbie miarowej o

pojemności 10 ml. Kolbę miarową wypełniono częśćiowo buorem octanowym, dodano do

niej 200 µl p-nitrofenolu i roztwór uzupełniono buforem octanowym do kreski. Dokładnie

wymieszano roztwór przez kilkukrotne odwracanie kolby.

b) Rozcieńczony roztwór p-nitrofenolu przelano do małej probówki chemicznej i podpisano

ją jako P (produkt).

c) Do 8 suchych probówek podpisanych zgodnie z Tabelą 2 dodano następujące roztwory:

• 0.25 M bufor octanowy o pH = 5.0,

• 0.1 mM p-nitrofenol (w buforze octanowym) – standard (produkt),

• 0.5 M NaOH

w ilościach zadanych w Tabeli 2.

d) Zmierzono absorbancję przy długości fali 410nm dla 7 sporządzonych roztworów,

używając roztworu nr 8 jako odnośnika.

TABELA 1.

Nr probówki	V buforu [ml]	Vsubstratu [ml]	V enzymu [ml]	V NaOH [ml]	A 410	∆ A 410 /kor/
1	1.85	0.05	-	2.0	-0.023	0.087
1'	1.85	0.05	0.10	2.0	0.064
2	1.80	0.10	-	2.0	-0.021	0.142
2'	1.80	0.10	0.10	2.0	0.121
3	1.75	0.15	-	2.0	-0.018	0.19
3'	1.75	0.15	0.10	2.0	0.172
4	1.70	0.20	-	2.0	-0.015	0.188
4'	1.70	0.20	0.10	2.0	0.173
5	1.60	0.30	-	2.0	-0.012	0.228
5'	1.60	0.30	0.10	2.0	0.216
6	1.45	0.45	-	2.0	0.003	0.012
6'	1.45	0.45	0.10	2.0	0.015
7	1.30	0.60	-	2.0	0.006	0.269
7'	1.30	0.60	0.10	2.0	0.275
8	1.15	0.75	-	2.0	0.020	0.285
8'	1.15	0.75	0.10	2.0	0.305
9	0.90	1.00	-	2.0	0.040	0.355
9'	0.90	1.00	0.10	2.0	0.395
10	0.60	1.30	-	2.0	0.046	0.229
10'	0.60	1.30	0.10	2.0	0.275
11	1.80	0.00	0.10	2.0	odnośnik	-

TABELA 2.

Nr próbki	V buforu [ml]	V p-nitrofenolu [ml]	N p-nitrofenolu [μmol]	V NaOH [ml]	A 410
1	1.70	0.20	0.020	2.0	0.081
2	1.50	0.40	0.040	2.0	0.161
3	1.30	0.60	0.060	2.0	0.238
4	1.10	0.80	0.080	2.0	0.320
5	0.90	1.00	0.100	2.0	0.396
6	0.70	1.20	0.120	2.0	0.471
7	0.50	1.40	0.140	2.0	0.566
8	1.90	0.00	0.000	2.0	odnośnik

2. Obliczenia i wyniki

• stężenie początkowe p-nitrofenolu wynosi 5 mM, rozcieńczono 200 μl do 10 ml, nowe stężenie wynosi:

C_p^k= (200µmol/10ml) * 5mM = 0.1 mM

Wykres 1.

Obliczenie masy fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej:

$$m_{e} = \frac{C_{e}^{o}*V_{e}}{V_{r}}$$

Gdzie: Vr- objętość mieszaniny reakcyjnej, 1.9 ml

C_e^o- stężenie wyjściowe fosfatazy, 0.08$\frac{\text{mg}}{\text{ml}}$

Ve – objętość dodanego enzymu, 0.1 ml

$$m_{e} = \frac{C_{e}^{o}*V_{e}}{V_{r}} = \frac{0,08*0,1}{1,9} = 0,00421mg$$

Nr probówki	Δ A 410 /kor/	[S] [μmol]	1/[S] [dm^3/umol]	np^t [µmol]	Vc [$\frac{\text{µmol}}{min*ml}$]	1/Vc [$\frac{min*ml}{\text{µmol}}$]
1	0.087	131.6	0.0076	0.3467	0,01387	72,0980
2	0.142	263.2	0.0038	0.5657	0,02263	44,1891
3	0.19	394.7	0.00253	0.7570	0,03028	33,0251
4	0.188	526.3	0.0019	0.7490	0,02996	33,3778
5	0.288	789.5	0.00127	1.1474	0,04589	21,7912
6	0.012	1184.2	0.00084	0.0478	0,00191	523,560
7	0.269	1578.9	0.00063	1.0717	0,04287	23,3263
8	0.285	1973.7	0.00051	1.1355	0,04542	22,0167
9	0.355	2631.6	0.00038	1.4143	0,05657	17,6772
10	0.229	3421.1	0.00029	0.9123	0,03649	27,4048

- Obliczenia stężenia próbki substratu ( p-nitrofenolu) w mieszaninie reakcyjnej (dla probówki 1, reszta analogicznie):

$\left\lbrack S \right\rbrack = \frac{\text{Cp}^{0}*V_{\text{substratu}}}{\text{Vr}} = \frac{0,005*0,00005}{0,0019} = 131,6uM$

- Obliczenie odwrotności stężenia substratu :

[1/S] = $\frac{1}{131,6} = 0,0076$

- Obliczenie wartości absorbancji (zmiana wzoru: do probówek promowanych dodawany był enzym):

ΔA₄₁₀/kor/ = A₄₁₀^′ − A₄₁₀= 0,064 – (-0,023)= 0,087

Obliczanie liczności p-nitrofenolu powstałego w reakcji enzymatycznej w oparciu o krzywą standardową:

$$\Delta A_{410}/kor/ = \ 0,251*n_{p}^{t} = > n_{p}^{t} = \frac{0,087}{0,251} = 0,3467$$

Obliczanie szybkości powstawania p-nitrofenolu w reakcji enzymatycznej Vc oraz po przeliczeniu na 1ml mieszaniny wyznaczenie odwrotności. Czas reakcji t=25min. Objętość mieszaniny reakcyjnej Vr=1,9ml.

$$Vc = \frac{n_{p}^{t}}{V_{t}*t} = \frac{0,3467}{25} = 0,0139$$

Wykres zależności Vc=f([S]) z uwzględnieniem odrzucenia punktu 5 i 10, odbiegającego od linii trendu:

Wykres 2.

Wykres Lineweavera-Burka 1/Vc=F(1/[S])

Wykres 3.

Wyznaczenie stałej Michaelisa oraz szybkości maksymalnej:

$$V = \frac{V_{\max}*\lbrack S\rbrack}{K_{m} + \ \lbrack S\rbrack}$$

$$\frac{1}{V} = \frac{K_{M} + \ \lbrack S\rbrack}{V_{\max}*\lbrack S\rbrack} = \frac{K_{M}}{V_{\max}*\lbrack S\rbrack} + \frac{1}{V_{\max}}$$

y = 7160, 02x + 17, 35

$$\frac{1}{V} = \frac{7160,02}{\lbrack S\rbrack} + 17,35$$

$$V_{\max} = \frac{1}{17,35} = 0,05764\lbrack\frac{\text{µmol}}{min*ml}$$

$$K_{M} = \frac{7160,02}{17,35} = 412,681\ \lbrack umol\rbrack$$

$$K_{2} = \frac{V_{\max}}{\lbrack ET\rbrack} = \frac{0,05764}{0,08} = 0,7205\ \lbrack\frac{1}{\min}\rbrack$$

2. Wnioski

Przeprowadzone doświadczenie pozwoliło na wyznaczenie Vmax i Km dla reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu do p-nitrofenolu katalizowanej przez fosfatazę kwaśną z ziemniaka. Kwaśna fosfataza spełnia założenia kinetyki Michaelisa-Menten, ponieważ szybkość reakcji osiąga maksimum po całkowitym wysyceniu substratem (Wykres 2 i 3.). Wykres 2 pokazuje, że szybkość katalizowanej reakcji zależy nieliniowo od stężenia. Warunki, w jakich zachodziła reakcja, była optymalna dla działania fosfatazy. Cel ćwiczenia został zrealizowany.