Sprawozdanie G laboratorium Biochemia

Temat: Chromatografia żelowa

Data zajęć: 28.11.2013

Prowadząca: dr inż Beata Greb-Markiewicz

Wykonawcy: Aleksandra Grodek 193200, Michał Izydorczyk, Grupa IV

1. Wstęp

Chromatografia żelowa jest metodą rozdziału próbki na poszczególne składniki. Poprzez

przepuszczenie roztworu próbki przez żel, który przemywa się eluentem. Chromatografia jest

prowadzona w pionowej kolumnie, gdzie u góry umieszcza się próbkę i oddaje eluentu, a u dołu obiera poszczególne frakcje. Chromatografia może służyć zarówno do oznaczania jakościowego jak i ilościowego. Dokładność rozdziału próbki zależy od użytego wypełniania kolumny. Nie powinno ono reagować z rozdzielaną mieszaniną. Wielkość grudek żelu i stopień usieciowana są różne. Wypełnienie kolumny powinno być homogeniczne (jednorodne). Ważne jest utrzymanie stałej temperatury i odpowiedniego pH. Żele wypełniające kolumnę są zbudowane z porowatych grudek, do których swobodnie wnika rozpuszczalnik. Istotą chromatografii żelowej jest rozdział składników mieszaniny względem wielkości cząsteczkowej. Większe cząsteczki nie mogą wniknąć do grudek więc wędrują w dół kolumny najszybciej. Mniejsze cząsteczki częściowo wnikają do grudek, co spowalnia ich wędrówkę w dół kolumny. Najmniejsze cząsteczki są w stanie wnikną i wypełnić praktycznie całą przestrzeń wewnętrzną grudek żelu, one wędrują najwolniej. Są obierane jako ostatnie frakcje. Chcąc stwierdzić zawartość danego składnika w zebranej frakcji bada się absorbancję przy odpowiednio dobranej, charakterystycznej, długości fali stosując metody kolorymetryczne.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia będzie rozdzielenie mieszaniny zawierającej: Blue Dextran oraz mieszaninę białek owoalbuminy, albuminy wołowej i lizozymu. Stosując chromatografię w kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-25 wykreślić profilu elucji. Wykres powinien przedstawiać zależności objętości eluentu od absorbancji frakcji. Wyznaczyć dostępne współczynniki podziału dla danych białek. Współczynnik ten jest wielkością bezwymiarową oznaczającą jaka część wewnętrznej objętości grudki żelu może być wypełniona przez rozdzielaną substancję. Jest różny dla różnych kolumn, żeli, czy też rozdzielanych związków.

1. Materiały

a) Odczynniki:

- mieszanina Blue Dextranu, mieszanina białek: owoalbuminy, albuminy wołowej i lizozymu– próbka,

- Sephadex G-25 – żel,

- Bufor TRIS 0,1 M NaCl o pH 7,5 – eluent.

b) Szkło laboratoryjne:

- probówki chemiczne (30 szt.),

- cylinder miarowy 250 ml (1 szt.),

- zlewka 250 ml (2 szt.),

- pipety 0,2-1ml, 0,02-0,2ml

c) Aparatura:

- fotokolorymetr „Specol” (1 szt.),

- kuwety szklane do „Specola” (2 szt.),

- kolumna chromatograficzna (1 szt.),

- statyw (1 szt.),

4. Przebieg ćwiczenia

1. Ustawiono prędkość przepływu, aby była równa 1ml/min.

2. Pobrano nadmiar eluentu znad krążka pozostawiając ok 1mm nad krążkiem.

3. Dodano 0,5 ml Blue Dextranu na powierzchnię powstałego krążka. Barwa jest niebieska.

4. Dodano ponownie 2ml eluentu.

5. Zamknięto zawór kolumny i odczekano aż Blue Dextran spłynie wzdłuż kolumny. Zebrano do cylinderka 14 ml bezbarwnej frakcji.

6. Zebrano frakcje do eppendorfek po 1ml i następnie zmierzono ich absorbancję przy dł. fali 620A

Nr frakcji	Objętość elucji [ml]	A620
1	14	0,001
2	15	0,005
3	16	0,007
4	17	0,261
5	18	0,385
6	19	0,266
7	20	0,118
8	21	0,053
9	22	0,028

1. Początkowo wykonano te same czynności co wykonano przy wyznaczaniu objętości zerowej kolumny, tylko zamiast Blue Dextranu nałożono mieszaninę białek.

2. Następnie do cylindra zebrano 11ml bezbarwnej frakcji, po czym następne frakcje zbierano po 1ml do małych eppendorfek i mierzono ich absorbancję przy długości fali 280A.

Nr frakcji	Objętość eluncji [ml]	A 280
1	12	0,010
2	13	0,006
3	14	0,007
4	15	0,004
5	16	0,007
6	17	0,016
7	18	0,067
8	19	0,122
9	20	0,137
10	21	0,143
11	22	0,157
12	23	0,164
13	24	0,163
14	25	0,156
15	26	0,146
16	27	0,133
17	28	0,116
18	29	0,101
19	30	0,085
20	31	0,067
21	32	0,054
22	33	0,044
23	34	0,036
24	35	0,029
25	36	0,026
26	37	0,023
27	38	0,020
28	39	0,021
29	40	0,020
30	41	0,022
31	42	0,028
32	43	0,042
33	44	0,065
34	45	0,099
35	46	0,135
36	47	0,177
37	48	0,215
38	49	0,265
39	50	0,293
40	51	0,308
41	52	0,310
42	53	0,301
43	54	0,283
44	55	0,254
45	56	0,228
46	57	0,200
47	58	0,162
48	59	0,134
49	60	0,094
50	61	0,074
51	62	0,054
52	63	0,043
53	64	0,032
54	65	0,024
55	66	0,022
56	67	0,014

Zmierzono objętośc frakcji zerowej V’₀= 14 cm³

Wyznaczono objętośc elucji Blue Dextranu V_e= 14 cm³ +2cm³=16cm³

Objętośc elucji Blue Dextranu jest równa objętości zerowej kolumny V₀=16cm³

Zmierzono całkowitą objętośc kolumny: V_t= 16 + 29=45 cm³

1. Obliczenia

Dostępny współczynnik podziału:

$$K_{\text{av}} = \frac{Ve - Vo}{Vt - Vo}$$

Gdzie: Ve- objętość eluncji, tzn taka objętość rozpuszczalnika, która pozwala na wymycie określonej frakcji zawierającej maksymalne stężenie składnika próbki

Vo- objętość zerowa kolumny, tutaj równa objętości rozpuszczalnika we wnętrzu kolumny, czyli Blue Dextranu

Vt- objętość całkowita kolumny

Dostępny współczynnik podziału dla owoalbuminy i albuminy wołowej

Ve= 23 cm³

$$K_{\text{av}} = \frac{Ve - Vo}{Vt - Vo} = \ \frac{23 - 16}{45 - 16} = 0,2414$$

Dostępny współczynnik podziału dla lizozymu

Ve= 52 cm³

$$K_{\text{av}} = \frac{Ve - Vo}{Vt - Vo} = \ \frac{52 - 16}{45 - 16} = 1,2414$$

1. Wnioski

Doświadczenie miało na celu rozdzielenie mieszaniny trzech białek: owoalbuminy, albuminy wołowej i lizozymu. Odbierano substancje zgodnie z malejącymi masami cząsteczkowymi. Na wykresie profilu eluncji białek nie uzyskano jednak wyraźnych dwóch maksimów absorpcji dla albuminy wołowej i owoalbuminy ze względu na zbliżone masy, dlatego został policzony tylko jeden wspólny współczynnik podziału dla tych białek, który wyniósł 0,2414, natomiast współczynnik podziału dla lizozymu wynosił 1,2414.