Aleksandra Bachanek 13.12.2012

Magda Dylewska

Ilona Niewęgłowska

Justyna Zarzeczna

Zuzanna Sabatowska

Agata Wronkowska

OŚ 1

Sprawozdanie nr 3 z zajęć laboratoryjnych z biochemii

TEMAT: Oznaczanie dehydrogenaz metodą TTC.

Zakres: Oznaczanie białka metodą Lowry’ego

Oznaczanie aktywności dehydrogenaz metodą TTC.

Oznaczanie białka metodą Lowry’ego

Metoda Lowry’ego oznaczania białka wykorzystuje czułą reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i tyrozyna z odczynnikiem Folina-Ciocalteu. Jest kombinacją reakcji biuretowej oraz reakcji między resztami tyrozyny a tym odczynnikiem, w wyniku której powstają barwne (niebieskie) produkty. Absorbancję powstałego zabarwienia odczytuje się przy λ = 750nm.

Z_b =109,05 μg/ml

Oznaczanie aktywności dehydrogenaz.

Do badania aktywności dehydrogenaz stosowany jest test TTC. Aktywność tych enzymów jest wskaźnikiem aktywności mikroorganizmów.

Wykonanie:

Do 7 probówek miarowych należy dodać mieszaniny reagujące ze sobą wg podanego systemu.

Nr. probówki	Rodzaj próby	Ilość dodawana do próbek
		zawiesina bakterii
1	z glukozą	5
2		5
3	z peptonem	5
4		5
5	endogenna	5
6		5
7	odczynnikowa	5

Po dokładnym wymieszaniu próbek na leży je inkubować w ultratermostacie w temp. 37˚C w ciągu 30 min. Do przerwania reakcji enzymatycznej stosujemy po 10ml alkoholu
n-butolowego do każdej próby. Następnie dokładnie wymieszano i wstawiono do łaźni wodnej o temp. 90˚C na 5 min.

Później 5 cm³ ekstraktu butanolowego z każdej próbki należy odwirować przy 6000 obr/min w ciągu 5min. Płyn znad osadu używamy do oznaczenia absorbancji przy długości fali λ = 490 nm.

Wyniki:

Aktywność właściwą dehydrogenaz A_w w μmolach/s kg białka obliczamy wg wzoru:

$$A_{w} = \frac{A}{t \bullet Z_{b}}$$

gdzie:

A - aktywność dehydrogenaz [μmole TF/ml]

t - czas inkubacji próbek [s]

Z_b - zawartość białka w zawiesinie bakteryjnej [kg/ml]

t = 30min=1800s

Z_b = 109,05 μg/ml=1090,5 •10^-9 kg/ml

Rodzaj próbki	μmole TF/ml w 5ml	Aktywność dehydrogenaz [μmole TF/ml]	Aktywność właściwa [µkatale/kg białka]
z glukozą	0,82	0,164	83,55
z peptonem	1,04	0,208	105,97
endogenna	0,66	0,132	67,25

Wnioski:

Największą aktywność dehydrogenaz wykazał pepton co oznacza, że jest on najlepiej przyswajalną odżywką przez mikroorganizmy. Jak widać na wykresie glukoza jest słabiej przyswajalna zaś najmniejszą aktywność wykazała próbka endogenna, gdzie nie dodano żadnej pożywki.