7.12.2014r.

Sprawozdanie nr 3

Efekt fotodynamiczny

Autorzy: Jagoda Michalska, Kinga Nowak, Maciej Pawluś, Hanna Różycka

1. Wstęp

Reakcje fotouczulane to zespół zjawisk fotofizycznych i fotochemicznych, w których

energia promieniowania, pochłonięta prze odpowiedni chromofor (uczulacz,

fotosensybilizator) jest wykorzystana do indukcji przemian chemicznych substratu.

Efekt fotodynamiczny to zespól zjawisk wzbudzanych światłem w obecności uczulacza (fotosensybilizatora) itlenu cząsteczkowego prowadzący do trwałych uszkodzeń struktury i funkcji układu biologicznego.

1. Światło pochłaniane przez róż bengalski – uszkodzenie komórek pierwotniaków

Zmierzono widmo absorbcji różu bengalskiego(RB) w wodzie. W tym celu przygotowano 3 ml 5 µM roztworu, a następnie używając spektrofotometru zanotowano maksimum absorbancji i długość fali.

Do 4 szalek nalano po 4 ml zawiesiny pierwotniaków(pantofelków- Paramecium sp). Oglądano pantofelki pod lupą i zanotowano obserwacje. Następnie do 2 szalek dodano 50 µl RB o stężeniu 100µM, a 2 szalki pozostawiono bez barwnika. Jedna szalkę z RB i jedna bez RB pozostawiono w ciemności( okryto folią aluminiową). Pozostałe 2 szalki naświetlano lampą rzutnika. Co 30 s kontrolowano efekt pod lupa, notowano zmiany takie jak szybkość, typ poruszania, kształt i kolor pantofelków. Naświetlano do momentu zaobserwowania braku ruchu. Następnie porównano zachowanie i wygląd pantofelków z tymi pozostawionymi w ciemności. Próbami kontrolnymi były naświetlana szalka bez RB oraz pozostawiona w ciemności szalka bez RB.

2. Światło pochłaniane przez błękit metylenowy – utlenienie tryptofanu

Sporządzono 30 ml roztworu. W naczynku umieszczono 4 ml tryptofanu i 300 mikrolitrów błękitu metylenowego, dopełniono wodą. Przygotowano statyw z pięcioma próbówkami. Pobrano 3 ml próbki z naczynka do próbówki nr 1. Następnie resztę mieszaniny naświetlano, stale mieszając, przez 12 minut. Co 3 minuty pobierano 3 ml roztworu do nowej (kolejnej) próbówki. Zmierzono absorbancję dla wybranych maksimów (długość fali pierwszej: 220, drugiej: 664, trzeciej: 820). Otrzymane absorbancje umieszczono w tabeli.

Nr próbówki	Absorbancja przy dł. fali 220	Absorbancja przy dł. fali 664	Absorbancja przy dł. fali 820
1	0.7250	0.3810	0.0040
2	0.6120	0.3970	0.0002
3	0.5120	0.3990	0.0018
4	0.4680	0.3810	0.0035
5	0.4280	0.3970	0.0008

2. Wyniki

1. Światło pochłaniane przez róż bengalski – uszkodzenie komórek pierwotniaków

1. Widmo różu bengalskiego : Absorbancja: 0,713

Długość fali(λ): 549 nm

2. Wyniki dla naświetlanych próbek

Czas naświetlania [s]	Naświetlane pantofelki z RB	Naświetlane pantofelki bez RB
0	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy
30	ruchliwe, niektóre przybrały delikatny różowawy kolor, ich kształt jest prawidłowy	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy
60	Większość porusza się wolniej, wszystkie zabarwiły się na kolor różowy, większość pierwotniaków zaczęła pęcznieć	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy
90	poruszają się bardzo wolno, część pierwotniaków nie żyje, komórki są różowe, wszystkie pęcznieją	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy
120	W szalce znajdują się jedynie martwe, mocno różowe, bardzo napęczniałe pierwotniaki	ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy

Tabela 1: Zaobserwowane zmiany w naświetlanych próbkach pantofelków wraz z czasem.

3. Wyniki dla próbek pozostawionych w ciemności

W szalce inkubowanej w ciemności z RB pantofelki były zaróżowione, pływały wolniej, ale nie zaobserwowano martwych komórek.

W szalce inkubowanej w ciemności bez RB wszystkie pantofelki miały zachowany prawidłowy kształt, były przezroczyste i bardzo żywotne.

2. Światło pochłaniane przez błękit metylenowy – utlenienie tryptofanu

wykres kinga

3. Wnioski

1. Światło pochłaniane przez róż bengalski – uszkodzenie komórek pierwotniaków

• Można wnioskować , że róż bengalski jest substancją powodującą efekt fotodynamiczny . Po dodaniu fotouczulacza (RB) do szalki zawierającej pantofelki i naświetlaniu, substancja powodowała zmiany w strukturze komórek pierwotniaków (pęcznienie) i ich żywotności (po odpowiednio długim czasie naświetlania pierwotniaki były martwe).

• Na podstawie obserwacji próbki z RB umieszczonej w całkowitej ciemności udowodniono, że sam róż bengalski nie jest substancją śmiertelną dla pantofelków (obserwowano jedynie zabarwienie się komórek i spowolnienie ruchu pierwotniaków).

• Po obserwacji próbki bez dodatku RB udowodniono, że samo światło nie powoduje zmian morfologicznych i obniżenia żywotności pantofelków (nie zmieniły one kształtu, w próbce nie zaobserwowano również osobników martwych).

2. Światło pochłaniane przez błękit metylenowy – utlenienie tryptofanu

Bibliografia

• Skrypt do ćwiczeń z biofizyki, autor: Dr Agnieszka Wolnicka-Głubisz