06.12.2010r.

Sprawozdanie z zajęć „Efekt fotodynamiczny”

Kierunek studiów: Biologia

Grupa: 1 (poniedziałek, godz. 12.00)

Osoby wykonujące: Karolina Olek, Anna Piotrowska, Katarzyna Szaraniec

1. Cele ćwiczenia:

• zapoznanie się z pojęciem „efekt fotodynamiczny”

• zapoznanie się z reakcjami fotouczulanymi

• obserwacja wpływu reakcji fotouczulanych na organizmy żywe

2. Wykonanie ćwiczenia:

1. Wpływ reakcji fotouczulanych różem bengalskim na żywotność pantofelków (Paramecium caudatum)

Przygotowano cztery szalki zawierające po 3 ml zawiesiny pierwotniaków. Pod lupą obserwowano ich żywotność i ruchliwość.

Do dwóch szalek dodano po 20 µl różu bengalskiego (RB) o stężeniu 200 µM. Do pozostałych dwóch szalek nie dodawano barwnika.

Następnie dwie szalki: jedną z RB, drugą bez RB okryto szczelnie folią aluminiową. Pozostałe dwie szalki naświetlano światłem białym. Co 30 sekund obserwowano zmiany zachodzące w szalkach pierwotniakami.

Wyniki obserwacji zestawiono w Tabeli 1:

Tabela 1

Czas naświetlania [sek]	Naświetlana próbka z dodatkiem RB	Naświetlana próbka bez dodatku RB
0	Wszystkie pierwotniaki są ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy.	Wszystkie pierwotniaki są ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy.
30	Wszystkie pierwotniaki są ruchliwe, niektóre przybrały delikatny różowawy kolor, ich kształt jest prawidłowy.	Wszystkie pierwotniaki są ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy.
60	Większość pierwotniaków porusza się wolniej, wszystkie zabarwiły się na kolor różowy, większość pierwotniaków zaczęła pęcznieć	Wszystkie pierwotniaki są ruchliwe i przezroczyste, ich kształt jest prawidłowy.
90	Wszystkie pierwotniaki poruszają się bardzo wolno, część pierwotniaków nie żyje, komórki są różowe, wszystkie pierwotniaki pęcznieją	Większość pierwotniaków porusza się i wygląda tak, jak na początku obserwacji.
120	W szalce znajdują się jedynie martwe, mocno różowe, bardzo napęczniałe pierwotniaki	Większość pierwotniaków porusza się i wygląda tak, jak na początku obserwacji.

Po czasie potrzebnym do zaobserwowania zmian ruchliwości pantofelków w naświetlanej szalce zawierającej RB, porównano pantofelki inkubowane z fotouczulaczem i bez fotouczulacza w ciemności.

W szalce inkubowanej w ciemności z RB pantofelki były zaróżowione, pływały wolniej, ale nie zaobserwowano martwych komórek.

W szalce inkubowanej w ciemności bez RB wszystkie pantofelki miały zachowany prawidłowy kształt, były przezroczyste i bardzo żywotne.

2. Światło pochłaniane przez błękit metylenowy jest zdolne do utlenienia tryptofanu

Celem doświadczenia przeprowadzanego na zajęciach jest zbadanie efektu fotodynamicznego - degradacji tryptofanu wywołanego absorpcją światła przez obecne w roztworze wodnym cząsteczki błękitu metylenowego.

Sporządzono dwie próbki o objętości 3ml, z których jedna zawierała 0,3ml tryptofanu(Trp), a druga 0,03ml błękitu metylenowego (BM). Każdą substancję rozcieńczono wodą destylowaną do zadanej objętości i dokonano pomiaru absorbancji sporządzonych roztworów względem wody destylowanej. Wyniki zestawiono w Tabeli 2.

Tabela 2

Związek chemiczny	λ [nm]	A
Trp	280	0,89
BM	664	0,73

Dla tryptofanu charakterystyczną długością fali jest λ = 280nm.

Dla błękitu metylenowego zaobserwowano trzy widma dla charakterystycznych trzech długości fali.

Kolejnym krokiem było przygotowanie roztworu o objętości 30ml - mieszaniny Trp i BM rozcieńczonych wodą destylowaną, zawierającej takie same rozcieńczenia substancji jak wcześniejsze próbki.

Dla przygotowanej mieszaniny dokonano pomiaru absorbancji, otrzymując 3 widma będące połączeniem widm dla obu substancji z charakterystycznymi maksimami. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3/

Tabela 3

	λ [nm]	A
mieszanina	280	1,03
Trp+BM	664	0,75

Na podstawie otrzymanych wyników wybrano długość fali λ = 280nm - charakterystyczna dla mieszaniny Trp + BM, względem której będzie dokonywany pomiar absorbancji na dalszym etapie doświadczenia. Długość fali λ = 664nm jest charakterystyczna dla samego BM.

Dla przygotowanej mieszaniny i wybranej długości fali, co 3 minuty dokonywano pomiaru zmian absorbancji. Wyniki zgromadzono w Tabeli 4.

Tabela 4

λ = 280 nm
t [min]	A
0	0,463
3	0,461
6	0,409
9	0,402
12	0,399
15	0,369

Dla otrzymanych wyników sporządzono wykres zależności zmiany absorbancji tryptofanu od czasu naświetlania.

3. Dyskusja wyników:

1. Wpływ reakcji fotouczulanych różem bengalskim na żywotność pantofelków (Paramecium caudatum)

• W powyższym doświadczeniu udowodniono, że róż bengalski jest substancją powodującą efekt fotodynamiczny . Po dodaniu jej do roztworu zawierającego pierwotniaki i odpowiednim naświetlaniu, substancja powodowała zmiany w strukturze komórek pierwotniaków (pęcznienie) i ich żywotności (po odpowiednio długim czasie naświetlania pierwotniaki były martwe).

• Na podstawie obserwacji próbki z różem bengalskim umieszczonej w całkowitej ciemności udowodniono, że sam róż bengalski nie jest substancją śmiertelną dla pierwotniaków (w tych warunkach róż powodował jedynie zabarwienie się komórek i spowolnienie ruchu pierwotniaków).

• Na podstawie obserwacji próbki bez dodatku różu bengalskiego udowodniono, że samo światło nie powoduje zmian morfologicznych i obniżenia żywotności pierwotniaków (pierwotniaki nie zmieniły kształtu, w próbce nie zaobserwowano również martwych pantofelków).

2. Wpływ światła pochłanianego przez błękit metylenowy na aminokwas aromatyczny - tryptofan

• Tryptofan jako aminokwas aromatyczny - zgodnie z teorią, absorbuje promieniowanie UV przy λ = 280nm.

• Błękit metylenowy w wyniku absorpcji promieniowania z zakresu UV-VIS daje trzy charakterystyczne pasma. Zmianę absorbancji błękitu metylenowego najlepiej mierzyć w 240nm ponieważ w tej długości fali nie absorbują białka obecne w roztworze, a w 664nm absorbancja nie ulega zmianie - związek pod wpływem światła nie ulega fotoblaknięciu.

• Światło pochłaniane przez błękit metylenowy jest zdolne do utlenienia tryptofanu, co przejawia się spadkiem absorbancji przez aminokwas.

5

---