1
Dr Agnieszka Wolnicka-Głubisz
Zagadnienia do przygotowania:
Prawo Lamberta-Beera, absorbancja, stany wzbudzone cząsteczek (diagram Jabłońskiego),
stan singletowy, stan tripletowy, zjawisko fosforescencji i fluorescencji, wolne rodniki,
reaktywne formy tlenu, tlen singletowy
Efekt fotodynamiczny
Wprowadzenie
Reakcje fotouczulane to zespół zjawisk fotofizycznych i fotochemicznych, w których
energia promieniowania, pochłonięta prze odpowiedni chromofor (uczulacz,
fotosensybilizator) jest wykorzystana do indukcji przemian chemicznych substratu ,
takich jak utlenienie, redukcja, izomeryzacja, degradacja. Wiele substancji chemicznych
może absorbować energię świetlną (energie promieniowania) i zamieniać ją w energie
chemiczną. Należą do nich zarówno barwniki endogenne występujące w organizmach
roślinnych i zwierzęcych (chlorofil, bilirubina, retinal) jak i egzogenne związki i leki:
ksantyny, akrydyny, antybiotyki, antracykliny, leki psychotropowe (chlorpromazyna) i
moczopędne.
Gdy w reakcjach fotouczulanych bierze udział tlen cząsteczkowy (
3
O
2
) to określany je
mianem reakcji fotouczulanego utleniania. Końcowym efektem działania światła w
obecności tlenu i uczulacza jest nie tylko wynikiem działania reakcji fotoutlenienia, ale
również wielu procesów wtórnych. W przypadku komórek mogą to być np. zmiana płynności
błon, powstanie wiązań krzyżowych pomiędzy cząsteczkami białek, białek i lipidów, białek i
DNA, zatrzymanie proliferacji komórek, utrata zdolności naprawy DNA, mutacje, śmierć
komórki (apoptoza, nekroza).
Zespól zjawisk wzbudzanych światłem w obecności uczulacza (fotosensybilizatora) i
tlenu cząsteczkowego prowadzącego do trwałych uszkodzeń struktury i funkcji układu
biologicznego nazywamy EFEKTEM FOTODYNAMICZNYM.
Substraty reakcji fotouczulanych
Substratem reakcji fotouczulanych, w zależności od natury i mikrotopografii fotouczulacza w
komórce są składniki błon komórkowych, cytoplazmy, organelli komórkowych czy nawet
jądra komórkowego.
Lipidy
Ważną grupę związków podatnych na fotoutlenianie stanowią: nienasycone lipidy
(nienasycone kwasy tłuszczowe, trójglicerydy, fosfolipidy) i związki rozpuszczalne w
nienasyconych lipidach (cholesterol,
β-karoten, sterole, tokoferole, witamina D i
prostaglandyny).
Związki te w wyniku działania reakcji fotouczulanego utlenienia ulegają peroksydacji, co
wpływa na :
• wzrost przepuszczalności błon dla jonów
• zmianę płynności błony
• tworzenie się wiązań krzyżowych między cząsteczkami lipidów i białek
2
• inaktywację receptorów błonowych
Procesy te mogą prowadzić do destrukcji błon biologicznych i śmierci komórki.
Białka
Do najbardziej podatnych na fotouczulane utlenianie należą aminokwasy aromatyczne
(histydyna, tyrozyna, tryptofan) lub zawierające siarkę (metionina, cysteina). Modyfikacje
konformacyjne reszt aminokwasowych wpływają na zmianę własności fizyko-chemicznych
białek:
• rozpraszanie światła,
• ruchliwość elektroforetyczną,
• rozpuszczalność,
• lepkość,
• sedymentację,
• wrażliwość na temperaturę i enzymy proteolityczne,
• liczbę grup tiolowych (SH).
Wykazano, że fotouczulane utlenianie białek powoduje utratę ich biologicznych funkcji,
takich jak:
• utrata własności antygenowych białek, co pozbawia je zdolności do oddziaływania z
przeciwciałem
• inaktywacja enzymów wywołana destrukcją ważnych reszt aminokwasowych w miejscu
aktywnym lub w jego bliskim otoczeniu
Kwasy nukleinowe
Ze
względu na swoja lokalizację kwasy nukleinowe w komórce są mało
prawdopodobnym celem dla promieniowania widzialnego. To prawdopodobieństwo zwiększa
się jedynie w przypadku dodatnio naładowanych barwników, które jonowo wiążą się z
kwasami nukleinowymi, takich jak: akrydyny, bromek etydyny czy furokumary (psoraleny).
Wykazano jednak, że fotouczulane utlenianie kwasów nukleinowych powoduje:
Zmiany w lepkości, temperatury topnienia DNA, zachowania polarfograficznego i
wrażliwości na enzymy proteolityczne, co skutkuje w zmianie ich funkcjonalności:
•
utratę aktywności zakaźnych wirusowego DNA i RNA,
•
utratę aktywności transformującej DNA,
•
hamowanie aktywności translacyjnej
•
oraz zmianę właściwości antygenowych
Utrata aktywności biologicznej kwasów nukleinowych pod wpływem działania
fotodynamicznego jest najczęściej wynikiem destrukcji guaniny. Również reakcje wtórne
zachodzące już po samym fotoutlenieniu mogą prowadzić do kowalencyjnego sprzęgania
cząsteczek kwasów nukleinowych z białkami.
Mechanizmy reakcji fotouczulanych
Proces reakcji fotouczulanych wszystkich typów rozpoczyna się od absorpcji przez
cząsteczki fotosensybilizatora (S) kwantów promieniowania, co powoduje ich przejście ze
stanu podstawowego do stanu wzbudzonego (
1
S*).
3
h
ν
0
S
→
1
S*
Czas życia tego stanu jest bardzo krótki - rzędu 10
–12
-10
-9
s i zależy od efektywności
procesów dezaktywacji :
1
S*
→ S +hν
FL
emisja promieniowania w postaci fluorescencji
1
S*
→ S + ciepło
konwersja wewnętrzna, czyli bezpromienista dyssypacja energii
1
S*
→
3
S*
interkombinacyjna konwersja, przejście ze stanu singletowego
w tripletowy
Jeśli część pochłoniętej energii zostanie wykorzystana na zmianę spinu elektronu
walencyjnego uczulacza to na skutek przejścia interkombinacynego (ISC) wzbudzony
uczulacz
1
S* przejdzie do dłużej żyjącego stanu tripletowego (
3
S*). Czas życia
3
S* jest
dłuższy, rzędu 10
-6
-10
-3
s, co zwiększa szanse na zajście kolejnych reakcji.
ISC
1
S*
→
3
S*
W dalszym ciągu w zależności od rodzaju fotosensybilizatora oraz warunków środowiska
reakcja może przebiegać na trzy różne sposoby, z których tylko dwa pierwsze ze względu na
udział tlenu prowadzą do efektu fotodynamicznego :
A
S
+.
+ A
-.
3
O
2
A
ox
typ 1
S
· -
+ A
+·
3
O
2
A
3
S*
1
O
2
+ S A
ox
typ 2
A
S-A typ 3
Rys. 1 Trzy typy reakcji fotouczulanych
S- sensybilizator (
0
S-stan podstawy,
1
S*- stan wzbudzony, singletowy,
3
S*- stan wzbudzony,
tripletowy)
S
-·
- anionorodnik sensybilizatora, S
+·
- kationorodnik sensybilizatora
A-substrat [np. cząsteczka białka (B), lipidu (LH)]
A
-·
,
A
+·
- rodnikowa forma substratu [np. B
·
, L
·
]
A
ox
- produkt utleniania [np. LOOH]
3
O
2
– tlen cząsteczkowy (stan podstawy, tripletowy),
1
O
2
- tlen singletowy (stan wzbudzony,
sigletowy)
S-A- addukt, produkt reakcji fotouczulanej bez udziału tlenu
W reakcjach typu 1 w wyniku oddziaływania wzbudzonych cząsteczek uczulacza (
3
S*) z
cząsteczkami substratu (A) dochodzi do oderwania lub przyłączenia elektronu i powstania
rodnikowych form substratu (A
.
), które reagując z tlenem cząsteczkowym
3
O
2
ulegają
utlenieniu.
W
reakcjach
typu 2 energia wzbudzonego uczulacza (
3
S*) przekazywana jest
bezpośrednio na tlen cząsteczkowy (
3
O
2
). Taki transfer energii pomiędzy
3
S* a 3O
2
jest
4
możliwy ze względu na taka samą multipletowość cząsteczek. Przekazana energia zużywana
jest na reorientacje spinu w cząsteczce tlenu, w wyniku, czego tworzona jest wysoce
reaktywna forma tlenu- tlen singletowy (
1
O
2
).
W
reakcjach
typu 3 dochodzi do przeniesienia elektronu (lub wodoru) między
wzbudzonymi cząsteczkami uczulacza (
3
S*) a substratem lub przyłączenie uczulacza do
substratu z wytworzeniem adduktów (S-A).
Efektywność reakcji fotouczulanego utleniania
Wiele czynników fizykochemicznych wpływa na przebieg reakcji fotodynamicznych,
należą do nich:
• stężenie i stopień agregacji fotouczulacza ,
• efektywność pochłaniania światła przez fotosensybilizator, której miarą jest molowy
współczynnik absorbcji (
ε)
• wydajność obsadzenia stanu tripletowego fotouczulacza, która zależy od jego struktury
eletronowo-atomowej
• lokalne stężenie i ruchliwość tlenu, donorów i akceptorów, jonów wodoru (pH), metali
ciężkich, niesparowanych elektronów
• temperatura.
• oddziaływanie fotosensybilizatora z substratem
• przestrzennego zbliżenia donora i akceptora energii, co ułatwi jej przekazanie i
transformację
Znaczenie procesów fotodynamicznych
Niepożądane reakcje fototoksyczne i fotouczulane
W pewnych warunkach endogenne barwniki mogą indukować zjawiska fotodynamiczne in
vivo nawet u ludzi. Przykładem są osoby cierpiące na porfirię, u których zaburzenia działania
enzymów w szlaku syntezy hemu prowadzą do nadmiernej akumulacji porfiryn w skórze
czyniąc ją nadwrażliwą na światło słoneczne, a w szczególności pasmo promieniowania UV
(200-400nm).Wiele substancji chemiczne zawartych np. w kosmetykach oraz leki lub zioła,
które same w sobie nie posiadają żadnych właściwości, które by mogły niekorzystnie
oddziaływać na skórę, pod wpływem promieniowania UV powodują reakcje fotouczulające
objawiające się zaczerwienieniem skóry i opuchlizną.
Terapia fotodynamiczna (PDT)
Zjawiska fotodynamiczne znalazły zastosowanie w terapii nowotworów. Niszczenie tkanki
nowotworowej za pośrednictwem reakcji fotodynamicznego utleniania nosi nazwę
terapii fotodynamicznej - PDT (z ang. photodynamic therapy).
Metoda ta polega na lokalnym naświetlaniu miejsca chorego po uprzednim wprowadzeniu do
układu uczulacza. Do najczęściej stosowanych uczulaczy należą pochodne hematoporfiryn
np. kwas 5- aminolewulinowy (5-ALA)
Perspektywa, jaką stwarza metoda terapii fotodynamicznej jest bardzo zachęcająca, daje ona,
bowiem możliwość wybiórczego niszczenia komórek nowotworowych z pełną ochroną
zdrowych komórek organizmu, w przeciwieństwie do obecnie stosowanych w onkologii
metod leczenia, takich jak radioterapia czy chemioterapia, które nie dają możliwości
5
wybiórczego działania na tkankę nowotworową z oszczędzeniem prawidłowych komórek
organizmu.
Wykonanie ćwiczenia
Wykonaj poniższe doświadczenia, sporządź sprawozdanie. Na podstawie uzyskanych
wyników odpowiedz w sprawozdaniu na wszystkie pytania podane na końcu instrukcji.
1. Światło pochłaniane przez róż bengalski jest zdolne do uszkodzenia komórek
pierwotniaków.
Zmierz widmo absorbcji różu bengalskiego (RB) w wodzie. W tym celu przygotuj 3 ml
10 µM RB. Zanotuj w maksimum wartość absorbancji oraz długość fali.
Do 6 szalek nalej po 4ml zawiesiny pierwotniaków tak, by pokryła dno szalki ( do
wszystkich dodaj taką samą objętość).
Przyglądnij się ruchom pierwotniaków pod lupą.
Do 2 szalek dodaj po 50 µl różu bengalskiego o stężeniu 100 µM do kolejnych 2-óch -
po 200 µl różu bengalskiego. Dwie szalki pozostaw bez barwnika.
Okryj folią, pozostawiając w ciemności 2 szalki z RB i jedną bez RB, a pozostałe trzy
naświetlaj równocześnie lampą z rzutnika.
Kontroluj po lupą efekt co 30s i notuj zmiany (szybkość, typ poruszania się, kształt i kolor
pantofelków) lub ich brak.
Naświetlaj tak długo, aż zaobserwujesz brak ruchliwości pantofelków i zmianę ich
wyglądu. Porównaj zachowanie pantofelków w szalce pozostawionej w ciemności z takim
samym stężeniem.
Opisz doświadczenie, wyniki zamieść w tabeli. W dyskusji wyników wskaż czy:
a- róż bengalski absorbuje promieniowanie w zakresie światła widzialnego
b- róż bengalski nie jest toksyczny,
b- samo światło nie uszkadza pierwotniaków
c- światło pochłaniane przez substancje jest zdolne do uszkodzenia komórek
pierwotniaków.
c- jaki efekt zaobserwowałeś/łaś? Jak długo należało naświetlać pierwotniaki i w jakim
stężeniu RB? Stężenie końcowe RB w próbce należy przeliczyć!
d- Czy efekt zależy od stężenia RB?
6
2. Światło pochłaniane przez błękit metylenowy jest zdolne do utlenienia
tryptofanu.
Rozcieńcz wodą destylowaną tryptofan (1,5x10
-4
M) pobierając 400
µl trp i uzupełniając
resztę wodą do 3 ml.
Do drugiej probówki dodaj 30
µl błękitu metylenowego (BM; 0,6 mM) i również resztę
uzupełnij wodą.
Zmierz ich widmo absorpcji Trp i BM względem odnośnika, zapisz dla każdego z nich
charakterystyczne maksyma absorbancji. Wybierz charakterystyczną długość fali dla
tryptofanu i błękitu metylenowego.
Sporządź 30 ml roztworu w naczyńku zawierającego 4 ml tryptofanu i 300
µl błękitu
metylenowego i resztę wody.
Przygotuj statyw z 5 probówkami.
Pobierz 3 ml próbki do 1-szej probówki.
Następnie resztę mieszaniny w naczyńku naświetlaj światłem z rzutnika stale mieszając przez
12 min odbierając co 3 min 3ml roztworu do nowej opisanej probówki. Zmierz absorbancję
dla wybranych maksimów.
Sporządź wykres zależności zmian absorbancji dla tryptofanu i BM od czasu naświetlania.
(równanie prostej i współczynnik korelacji)
Odpowiedz na pytania:
a- w jaki sposób zmierzyć widmo absorpcji wybranych substancji ?
b- jaki jest molowy współczynnik ekstynkcji BM w zakresie światła widzialnego? Od
czego zależy ε ?
c - w którym miejscu widma najlepiej mierzyć efekt utleniania tryptofanu? Odpowiedz
uzasadnij.
d - w którym miejscu widma najlepiej mierzyć zmiany absorbancji dla błękitu
metylenowego? Odpowiedz uzasadnij. Czy związek ten ulega fotoblaknięciu czy jest też
nie? Odpowiedz uzasadnij.
e- czy światło pochłaniane przez substancje BM jest zdolne do utlenienia tryptofanu ? Jak
nazwiesz ten proces? Odpowiedz uzasadnij.
Literatura:
1. S. Paszyc. Podstawy fotochemii. PWN, Warszawa 1992
2. G. Bartosz. Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa 2006