ENZYMY

Budowa enzymów

Przemiany biochemiczne przebiegające w organizmie są bardzo skomplikowane i napotykają na ogromne opory fizykochemiczne. Przebieg reakcji umożliwiają bardzo specyficzne biokatalizatory-enzymy, które łącząc się z substratami zmniejszają przeszkody fizykochemiczne uniemożliwiające swobodny przebieg procesu. Obniżenie oporów fizykochemicznych określamy jako obniżenie energii aktywacji. Enzymy zmniejszają barierę energetyczną dla danej reakcji, ale nie wywierają wpływu na zmianę energii swobodnej układu która jest funkcją stanu początkowego i końcowego reagujących związków, a więc nie zmieniają ilości energii która jest pochłaniana w reakcjach endoenergetycznych lub wydzielana w reakcjach egzoenergetycznych. Enzymy zwiększają jedynie szybkość reakcji i przyśpieszają osiągnięcie stanu równowagi chemicznej, do którego dąży dana reakcja

Enzymy są zbudowane z białka. W części białkowej enzymu znajduje się zagłębienie - centrum aktywne. Do centrum aktywnego przyłączają się cząsteczki - substraty, które mają ulec przemianie. Powstaje przejściowy kompleks enzym-substrat (ES), następnie zachodzi odpowiednia reakcja i od cząsteczki enzymu odłącza się produkt (P).

E + S ⇔ ES → E + P

Cechą charakterystyczną enzymów jest ich specyficzność, polegająca na katalizowaniu reakcji określonego typu. Enzymy o dużej specyficzności katalizują tylko jedną reakcję dla ściśle określonych substratów. Enzymy o małej specyficzności mogą katalizować ten sam typ reakcji dla wielu różnych substratów.

Często w centrum aktywnym znajdują się dodatkowe cząsteczki, które są niezbędnymi kofaktorami biorącymi czynny udział w katalizowanej reakcji. Część białkowa enzymu nazwana została apoenzymem. Cząsteczki niebiałkowe luźno związane z częścią białkową enzymu w centrum aktywnym i mogące się od niego odłączyć to koenzymy, cząsteczki trwale połączone z apoenzymem to grupy prostetyczne. Bardzo często w skład budowy koenzymów i grup prostetycznych wchodzą witaminy.

Apoenzym + koenzym = holoenzym ( enzym funkcjonalnie czynny)

W reakcjach katalizowanych przez enzymy często uczestniczą dodatkowo jony wapnia, magnezu, cynku, niklu, żelaza, miedzi, manganu, chlorkowe, selenu.. Kofaktorami uczestniczącymi w reakcji mogą być także nukleotydy, np. ATP, CTP, GTP.

Budowa koenzymów i grup prostetycznych jest różnorodna, bardzo wiele z nich zawiera w swoim składzie witaminę z grupy B. Są to: 1) tiamina (witamina B₁), 2) ryboflawina (witamina B₂), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego, (witamina B₃ nazwana także witaminą PP), 4) kwas pantotenowy (witamina B₅), 5) witamina B₆ (pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina), 6) biotyna - witamina H, 7) witamina B₁₂ (kobalamina) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy). Ponieważ witaminy tej grupy są rozpuszczalne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Z tych też przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone ( z wyjątkiem kobalaminy), co sprawia, że muszą być dostarczane regularnie. Niedobory witamin powodują zahamowanie wielu procesów katalizowanych przez enzymy, które manifestują się szeregiem objawów chorobowych. Wśród objawów spowodowanych niedoborem wyżej wymienionych witamin są: a) choroba beri-beri (niedobór tiaminy), b) zajady, zapalenie języka, łojotok, światłowstręt (niedobór ryboflawiny), c) pelagrę (niedobór niacyny), d) zapalenie nerwów obwodowych (niedobór pirydoksyny), e) niedokrwistość megaloplastyczną, acydurię metylomalonową i niedokrwistość złośliwą (niedobór kobalaminy), f) niedobór kwasu foliowego kwasu foliowego powoduje niedokrwistość metaloplastyczną a w trakcie życia płodowego witamina ta jest niezbędna do prawidłowego rozwoju centralnego układu nerwowego. Niedobory witaminy B₁₂ i kwasu foliowego są czynnikami, które zwiększają zagrożenie miażdżycą.

Występuje także nieliczna grupa enzymów zbudowanych z kwasu rybonukleinowego(RNA), są to rybozymy.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od środowiska

Enzymy są cząsteczkami bardzo wrażliwymi na wpływ środowiska, w którym działają.

Na szybkość reakcji enzymatycznej wpływają:

- wartość pH ,

- temperatura,

- stężenie substratów,

- stężenie enzymu,

- obecność aktywatorów,

- obecność inhibitorów.

Każdy enzym działa najlepiej w środowisku o odpowiednim dla niego odczynie roztworu -pH. Większość enzymów wykazuje największą aktywność w tzw. odczynie bliskim obojętnemu, zbliżonym do pH 7, charakterystycznym dla wody.

Szybkość reakcji katalizowanej przez enzymy zależy od temperatury. Aktywność enzymów rośnie wraz ze wzrostem temperatury, jednak do pewnych granic. Większość enzymów traci zdolność katalizy w temperaturze 60⁰ C, zachodzi wtedy denaturacja (nieodwracalne uszkodzenie) części białkowej enzymu. Wzrost szybkości reakcji biochemicznych można łatwo zaobserwować jako przyśpieszenie tętna u ludzi z podwyższoną temperaturą ciała.

Większość enzymów to enzymy o stałej kinetyce reakcji zwanej hiperboliczną. Szybkość ich działania zależy głównie od stężenia substratów w danych warunkach optymalnych dla działania danego enzymu. Jeśli ilość enzymu w kolejnych próbkach jest stała to szybkość katalizowanej reakcji jest uzależniona od stężenia substratów. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratów przedstawiono na rys.1.

Ponieważ enzym łączy się z substratem tworząc kompleks enzym-substrat, to przy odpowiednim wysokim stężeniu substratu następuje wysycenie substratem enzymu. Dalszy wzrost stężenia substratu już nie powoduje wzrostu szybkości reakcji. Przy maksymalnym wysyceniu enzymu substratem reakcja osiąga szybkość maksymalną (V_max). Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu przedstawia się jako hiperbola. Hiperboliczny przebieg reakcji opisuje równanie wyprowadzone przez Michaelisa -Menten.

Analiza matematyczna powyższego wykresu pozwala na określenie wartości stałej Michaelisa. Stała Michaelisa jest wartością stałą dla danego enzymu i określa jego powinowactwo do substratu, a więc szybkość powstawania kompleksu enzym-substrat.. Mała wartość stałej Michaelisa wskazuje na duże powinowactwo do substratu i dużą szybkość reakcji, duża wartość stałej świadczy o małym powinowactwie do substratu i mniejszej szybkości reakcji. Zmiany wielkości stałej Michaelisa dla danego enzymu wskazują na zmiany struktury białka, a więc na zmiany w obrębie odpowiedniego genu. Zmiana wartości tej stałej może także wskazywać na obecność inhibitorów, związków, które zakłócają przebieg reakcji.

Wartość stałej Michaelisa można stosunkowo łatwo oznaczyć eksperymentalnie, robiąc zależność szybkości reakcji od stężenia substratu w teście standardowym (rys.1). Stałą Michaelisa można przedstawić w jednostkach stężenia substratu (mol/dm³) wtedy, kiedy reakcja osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Niektóre enzymy wymagają do swojego działania aktywatorów, które stabilizują ich właściwą strukturę, są to np. jony magnezu, wapnia, cynku, manganu i inne.

Szybkość przemiany biochemicznej zależy także ilości cząsteczek enzymów w komórce. Ilość enzymu zależy od aktywności genów kodujących dane białka. Ekspresja poszczególnych genów podlega bardzo skomplikowanym i precyzyjnym mechanizmom regulacyjnym. Stężenie enzymów najważniejszych przemian np. glikolizy, cyklu kwasów trikarboksylowych(Krebsa) jest względnie stałe, charakterystyczne dla danej tkanki. Ilość enzymów biorących udział w procesach detoksykacji ustroju, enzymów cyklu mocznikowego może wzrastać wielokrotnie.

Prawidłowe działanie enzymów może być zmienione za pomocą różnych związków chemicznych. Substancje, które hamują reakcje enzymatyczne można podzielić na inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.

Mechanizm działania inhibitorów kompetycyjnych polega na współzawodnictwie między substratem a inhibitorem o centrum aktywne.enzymu i jest odwracalne. Inhibitor kompetycyjny jest bardzo podobny strukturalnie do właściwego substratu, łączy się enzymem tworząc nieaktywny kompleks enzym-inhibitor. Stopień zahamowania reakcji zależy od stosunku stężeń inhibitora i substratu. Zwiększenie stężenia substratu może cofnąć tworzenie kompleksu enzym-inhibitor i znieść działanie inhibitora. Mechanizm hamowania kompetycyjnego wykorzystany został do hamowania kluczowego enzymu w syntezie cholesterolu, co pozwala na skuteczne obniżenie tego związku we krwi. Niektóre leki stosowane w terapii nowotworów również działaja na tej zasadzie.

Hamowanie niekompetycyjne polega na przyłączaniu się inhibitora w sposób odwracalny do części białkowej poza centrum aktywnym.. Zwiększenie stężenia substratu nie cofa działania inhibitora.

Jeśli inhibitor wiąże się w sposób trwały z białkiem, uszkadza nieodwracalnie strukturę enzymu i zmniejsza szybkość katalizowanej reakcji. Często tego typu inhibitory łączą się aminokwasami występującymi w centrum aktywnym i całkowicie inaktywują enzym. Na przykład diizopropylofluorofosforan (DIPF), składnik gazów bojowych działających na układ nerwowy, reaguje z resztą aminokwasu seryny w centrum aktywnym enzymu - esterazy acetocholiny . Następuje nieodwracalnie zahamowanie aktywności enzymu, co uniemożliwia przekazywanie impulsów nerwowych.

Regulacja aktywności enzymów

Szybkość przemian biochemicznych jest regulowana przez enzymy. Aktywność większości zależy od dostępności substratów, odpowiedniego pH środowiska, ewentualnych aktywatorów i ich ilości w komórce

W organizmie występują szczególne enzymy, których szybkość katalizy zmienia się w zależności od stanu fizjologicznego organizmu. Charakteryzują się zmienną kinetyką działania. Enzymy takie nazywamy enzymami regulatorowymi. Jeśli dany proces biochemiczny składa się z kilku etapów, to zazwyczaj pierwszy etap przemiany jest katalizowany przez enzym regulatorowy, decydujący o tempie całego procesu. Typowymi enzymami regulatorowymi są enzymy allosteryczne. Zbudowane są one z kilku podjednostek białkowych. Enzymy te posiadają podjednostki katalityczne z centrami aktywnymi, odpowiedzialnymi za katalizę i podjednostki regulatorowe z centrami allosterycznymi, które są odpowiedzialne za odbiór informacji ze strony komórki. Do centrów allosterycznych przyłączają się ligandy allosteryczne. Ligandy allosteryczne to związki chemiczne, które pojawiaja się w danym stanie fizjologicznym komórki i są substancjami sygnałowymi. Przyłączenie ligandu allosterycznego do centrum allosterycznego powoduje zmianę kształtu części białkowej enzymu. Zmiana struktury podjednostek katalitycznych wywołuje zmianę szybkości reakcji, adekwatną do informacji docierającej ze strony komórki. Efektory (ligandy) allosteryczne mogą zwiększać lub zmniejszać szybkość katalizowanej reakcji. Enzymy allosteryczne ragują również na obecność wystarczającej ilości substratów. Przy niskich stężeniach substratów aktywność tych enzymów jest bardzo mała. Enzymy allosteryczne charakteryzuja się zmienną kinetyką dostosowując szybkość reakcji do stanu fizjologicznego panującego we wnętrzu komórki.

Aktywność enzymów może także zależeć od zmian struktury części białkowej enzymu. Wiele enzymów zmienia szybkość reakcji pod wpływem fosforylacji polegającej na przyłączeniu do części białkowej fosforanu pochodzącego z ATP. Odpowiednie enzymy- kinazy białkowe przenoszą jedną resztę fosforanową z ATP na resztę aminokwasową seryny, rzadziej treoniny i tyrozyny. Powstaje ufosforylowana postać enzymu, w zależności od typu enzymu enzym staje się bardziej lub mniej aktywny. Procesy fosforylacji i defosforylacji enzymów są najczęściej wywołane działaniem hormonów. Od fosforylacji i defosforylacji enzymów zależy na przykład synteza i rozpad glikogenu, wielocukru znajdującego się w mięśniach i wątrobie, będącego rezerwuarem glukozy.

Innym sposobem regulacji aktywności enzymów jest ograniczona proteoliza. Polega ona na odłączeniu od białka fragmentu peptydu, który blokuje centrum aktywne. Po odłączeniu peptydu enzym staje się aktywny. Enzymy trawienne są wydzielane w formie proenzymów, (zymogenów) i ulegają aktywacji na skutek ograniczonej proteolizy w świetle przewodu pokarmowego (np. pepsynogen w pepsynę w świetle żołądka po wpływem kwasu solnego).

Klasy enzymów

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów. Zgodnie z tą zasadą Międzynarodowa Unia Biochemiczna dokonała podziału enzymów na sześć głównych klas jako podstawę klasyfikacji przyjęto typ katalizowanej reakcji przez dany enzym.. Każdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny.

Pierwszą klasą enzymów są oksydoreduktazy. Enzymy należące do tej klasy katalizują reakcje utleniania i redukcji, a więc reakcje związanych ze zmianą stopni utlenienia cząsteczek.

A^- + B ↔ A + B ^-

Do tej klasy należą takie grupy enzymów między innymi: dehydrogenazy odrywające atomy wodoru od substratów, reduktazy przyłączające do cząsteczek atomy wodoru, peroksydazy i katalazy rozkładające nadtlenki, oksydazy przenoszące elektony na tlen.. Większość oksydoreduktaz wymagaja do swojego działania koenzymów takich jak :a) dinukleotyd nikotynamidoadeninowy - NAD⁺ oraz fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego - NADP⁺, które są aktywnymi postaciami niacyny (witaminy B₃ = PP) lub dinukleotyd flawinoadeninowy - FAD (aktywne postacie ryboflawiny witaminy B₂).

Drugą klasą są transferazy, enzymy katalizujące reakcje, w których dochodzi do przeniesienia fragmentu czasteczki z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu - witaminy B₆, pirofosforanu tiaminy - witaminyB₁). Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: aminotransferazy przenoszące grupy aminowe, kinazy (fosfotransferazy, torzące estry fosforanowe przy użyciu ATP).

Ogólna reakcja katalizowana przez transferazy:

A + B -X → A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy, nie wymagają do swojego działania koenzymów, natomiast często współdziałają enzymów jonami wapnia bądź magnezu. Do tej klasy należą np.: glikozydazy rozkładające wiazania glikozydowe wielocukrów, esterazy rozkładające wiazania estrowe, peptydazy wiązania peptydowe występujące w białkach. Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy:

A-B + H₂O → A-OH + BH.

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje rozpadu wiązań lub ich syntezy, która przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. Należą tu takie grupy enzymów jak: syntazy, dekarboksylazy. Ogólna reakcja katalizowana przez liazy:

A-B ↔ A + B.

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje wewnętrznej przebudowy cząsteczek - izomeryzacji

A-B-C ↔ A-C-B.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii dostarczanej najczęściej z rozkładu wiązań wysokoenergetycznych ATP:

A + B + ATP → A-B + ADP + P

Oznaczanie aktywności enzymów odrywa ogromną rolę w badaniach podstawowych, w poszukiwaniu nowych leków zwalniających bądź przyśpieszających dany proces biochemiczny, w analizach toksylogicznych. Oznaczanie aktywności enzymów pomaga w diagnozowaniu bardzo wielu chorób.

Oznaczanie aktywności enzymów w materiale biologicznym polega na pomiarze szybkości reakcji katalizowanej przez enzymy, tzn. na określeniu zmiany stężenia (ilości) substratu lub produktu w jednostce czasu (przy użyciu enzymu pochodzącego z określonej masy materiału biologicznego np.

z 1 g tkanki lub 1 cm³ osocza). Jednostka enzymatyczna (U) jest to ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w odpowiednim pH roztworu dla danego enzymu, w 30⁰ C. W oznaczeniach diagnostycznych często stosuje się jednostki umowne, w których wyskalowano aktywność danego enzymu.

Często wykonywanymi badaniami o znaczeniu diagnostycznym jest oznaczanie na przykład poziomu aktywności w osoczu aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowej, kinazy kreatynowej, dehydrogenazy mleczanowej, których aktywność rośnie przy schorzeniach serca, mięśni czy wątroby. Natomiast obniżenie aktywności acylotransferazy lecytyna - cholesterol (LCAT) wiąże się z rozwojem procesów miażdżycowych.

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności wybranych enzymów z klasy oksydoreduktaz, transferaz i hydrolaz, w optymalnych dla nich warunkach środowiska.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

A. Zadanie indywidualne polega na określeniu substratu dla odpowiedniego enzymu. Student otrzymuje roztwór zawierający jeden z niżej podanych substratów:

1) Mleczan

2) Sacharoza.

3) Mocznik.

B. Przykłady działania enzymów z różnych klas

Oksydoreduktazy - pierwsza klasa enzymów

1. Wykrywanie aktywności katalazy

Katalaza katalizuje reakcję rozkładu toksycznego nadtlenku wodoru - H₂O₂:

H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂

Katalaza jest hemoproteiną o bardzo dużej aktywności katalitycznej. Występuje we wszystkich tkankach u zwierząt, głównie w krwinkach czerwonych, wątrobie i nerce. Katalaza jest jednym z enzymów chroniących komórki przed toksycznym działaniem reaktywnych form tlenu, które niszczą lipidy tworzące błony komórkowe, białka a nawet kwasy nukleinowe.

Zasada metody

W obecności katalazy następuje rozpad H₂O₂ do wody i tlenu; wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności enzymu.

Materiał i odczynniki

1. 3% roztwór H₂O₂.

2. Krew.

3. Krew zagotowana

Wykonanie doświadczenia

1. Do pierwszej probówki odmierzyć 1 cm³ wody i dodać jedną kroplę krwi.

2. Do drugiej probówki odmierzyć 1 cm³ wody i dodać dwie krople krwi zagotowanej.

3. Do obu probówek dodawać kroplami roztwór 3% roztwór wody utlenionej.

4. O obecności katalazy świadczyć będzie tworzenie się obfitej piany.

2. Wykrywanie aktywności peroksydazy

Reakcja katalizowana przez peroksydazę:

Substrat-H_{2 zred.} + H₂O₂ → Substrat_utl. + 2H₂O

Peroksydaza jest enzymem występującym powszechnie w roślinach, szczególnie dużo tego enzymu zawiera chrzan. Katalizuje reakcję utleniania substratów w obecności nadtlenku wodoru.

U zwierząt komórkach różnych tkanek występuje peroksydaza glutationowa. Peroksydaza glutationowa jest bardzo ważnym enzymem usuwającym nadtlenki kwasów tłuszczowych, nadtlenek wodoru, chroni grupy -SH w białkach przed niepożądanym utlenieniem. Jest najważniejszym enzymem chroniącym strukturę błon komórkowych, które na skutek rozpadu kwasów tłuszczowych mogłyby ulegać zniszczeniu. W reakcji katalizowanej przez peroksydazę bierze udział glutation

(G-SH), który zbudowany jest z trzech aminokwasów i jest dawcą atomów wodoru niezbędnych do przebiegu reakcji.

2 G-SH + H₂O₂ → GS-SG + 2 H₂O

W organizmie tworzy się także niezwykle toksyczna, reaktywna forma tlenu-anionorodnik ponadtlenkowy, który jest usuwany przez dysmutazę ponadtlekową . W usuwaniu toksycznych form tlenu biorą udział także związki drobnocząsteczkowe jak na przykład witamina C, E, A, kwas moczowy. Atak tlenu na struktury komórkowe jest jednym z najważniejszych czynników wywołujących starzenie. Długotrwałe podawanie tlenu pacjentowi potęguje procesy degradacyjne i może być niebezpieczne.

Zasada metody

W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy .

Benzydyna H₂ (bezbarwna) + H₂O₂ → benzydyna ( niebieska) + 2 H₂O

Materiał i odczynniki

1. 1% roztwór benzydyny w lodowatym kwasie octowym.

2. 3% roztwór H₂O₂.

4. Ziemniak surowy.

5. Ziemniak gotowany.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować odczynnik benzydynowy: zmieszać równe objętości roztworu benzydyny w lodowatym kwasie octowym i roztworu H₂O₂.

2. Na plasterek surowego ziemniaka nanieść kilka kropli odczynnika benzydynowego.

3. Tę samą czynność wykonać z plasterkiem ziemniaka gotowanego

4. Porównać obie próby.

3. Wykrywanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

Dehydrogenaza mleczanowa występuje w cytoplazmie komórkowej. Jej koenzymem jest NAD⁺.

Katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu do pirogronianu (Rys. 3), reakcja katalizowana przez ten enzym umożliwia przebieg glikolizy w warunkach beztlenowych(patrz - ćw. Glikogen). Enzym składa się z czterech podjednostek. Dehydrogenaza mleczanowa występuje w cytoplazmie wszystkich komórek. Największą aktywność LDH odnotowano w mięśniach, nerce, wątrobie i krwinkach czerwonych W organizmie ludzkim występują dwie formy podjednostek: H (przeważająca w mięśniu sercowym) i M (przeważająca w wątrobie i mięśniach szkieletowych). Podjednostki różnią się między sobą budową i własnościami immunologicznymi, tworzą jednak łatwo hybrydy. W tkankach i surowicy krwi LDH występuje w postaci pięciu izoenzymów. Izoenzymy to różne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale różnią się między sobą właściwościami fizykochemicznymi.. Izoenzymy LDH mają następującą budowę: LDH₁ - H₄, LDH₂ - H₃M₁, LDH₃ - H₂M₂, LDH₄ - H₁M₃, LDH₅ - M₄.

Podczas uszkodzenia komórek zawartość cytoplazmy przenika do krwi powodując wzrost aktywności szeregu enzymów. Oznaczanie aktywności izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy krwi ma znaczenie diagnostyczne w zawałach mięśnia sercowego (wzrasta stężenie LDH₁) i uszkodzeniach komórek wątrobowych (wzrasta stężenie LDH₅).

Zasada metody

Wskaźnikiem przebiegu reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową jest barwny związek-(DCPI) który przyłącza atomy wodoru z utworzonego w trakcie reakcji NADH + H^+. Po przyłączeniu atomów wodoru następuje odbarwienie DCPI.

DCPI(zabarwiony) + NADH+H⁺ → DCPIH₂ (bezbarwny) + NAD⁺

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,008% roztwór DCPI.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór mleczanu sodu..

4. 5% homogenat wątroby.

Wykonanie doświadczenia

1. Odmierzyć 2cm³ homogenatu wątroby do probówki i umieścić na 10 minut we wrzącej

łaźni wodnej

2. Do trzech probówek dodać odczynniki według tabeli 1.

3. Zawartość probówek wymieszać.

• Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C

5. Obserwować zmiany zachodzące w czasie. Odbarwienie roztworu świadczy o obecności dehydrogenazy mleczanowej.

Tabela 1.

Nr probówki	1	2	3
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1	1	1
0,007% DCPI	1	1	1
0,5 mol/dm^3 mleczan sodu	0,4	0,4	-
5% homogenat wątroby	0,5	-	0,5
5% homogenat wątroby zagotowany	-	0,5	-
Zadanie	-	-	0,4

4. Wykrywanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej (SDH - ang. succinate dehydrogenase)

Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) występuje w mitochondriach. Jest enzymem cyklu Krebsa i stanowi odgałęzienie łańcucha oddechowego. Katalizuje ona odwracalną reakcję utleniania bursztynianu z wytworzeniem fumaranu, grupą prostetyczną enzymu jest FAD, zawierający w swojej strukturze witaminę B₂ (Rys. 5). Inhibitorem kompetycyjnym tego enzymu jest m.in. malonian. Inhibitor kompetycyjny to związek, którego budowa przestrzenna jest bardzo podobna do właściwego substratu. Hamuje on reakcję enzymatyczną, gdyż przyłącza się, zamiast substratu, do centrum aktywnego enzymu.

Zasada metody

Powstający w reakcji FADH₂ redukuje DCPI, odbarwienie roztworu świadczy o przebiegu reakcji.

DCPI(zabarwiony) + FADH₂ → DCPIH₂ (bezbarwny) + FAD

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,01% roztwór DCPI.

3. 1 mol/dm³ roztwór bursztynianu sodu.

4. 5% homogenat wątroby.

Wykonanie doświadczenia

1. Do trzech probówek dodać odczynniki według tabeli 2.

2. Zawartość probówek wymieszać.

3. Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C

4. Obserwować zmianę zabarwienia, (odbarwienie roztworu świadczy o obecności SDH).

Tabela 2.

Nr probówki	1	2
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1cm^3	1cm^3
0,01% DCPI	0,6cm^3	0,6cm^3
1 mol/dm^3 bursztynian	0,2cm^3	0,2cm^3
5% homogenat wątroby	-	0,5cm^3
H2O	0,5cm^3	-

5. Wykrywanie aktywności oksydazy difenolowej

Oksydaza fenolowa (enzym roślinny) jest miedzioproteiną. Katalizuje utlenianie difenoli do chinonów, które są związkami barwnymi. Akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy (Rys. 6).

Zasada metody

Pod wpływem oksydazy difenolowej znajdującej się w ziemniaku difenole zawarte w żywicy

gwajakowej utleniają się do produktów, które mają niebieskie zabarwienia.

Materiał i odczynniki

1. 6% roztwór żywicy gwajakowej w 96% etanolu.

2. Ziemniak surowy.

3. Ziemniak gotowany.

Wykonanie doświadczenia

Kawałek ziemniaka świeżego i ugotowanego zwilżyć kilkoma kroplami nalewki gwajakowej.

Zaobserwować zmiany.

Transferazy - druga klasa enzymów

6. Wykrywanie aktywności aminotransferazy alaninowej (AlAT) z zastosowaniem chromatografii bibułowej.

Aminotransferazy katalizują odwracalne reakcje przeniesienia grup aminowych z aminokwasów na α-ketokwasy w obecności fosforanu pirydoksalu (grupy prostetycznej enzymu zawierającej witaminę B₆). Reakcje te zachodzą praktycznie we wszystkich komórkach organizmów zwierzęcych. Największą aktywność aminotransferaz stwierdzono w cytoplazmie komórek wątroby, nerki, mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego.

Aminotransferaza alaninowa katalizuje odwracalną reakcję przeniesienia grupy aminowej z L-alaniny na α-ketoglutaran z utworzeniem glutaminianu i pirogronianu (Rys.7). Oznaczanie aktywności tego enzymu w surowicy krwi wykorzystuje się w diagnostyce laboratoryjnej. Przy uszkodzeniu komórek różnych narządów, na przykład w zapaleniu wątroby, w zawale mięśnia sercowego, wzrasta wielokrotnie aktywność AlAT w surowicy krwi. Szczególnie wysoka aktywność aminotransferazy alaninowej towarzyszy schorzeniom wątroby.

Zasada metody

Po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej mieszaninę poddaje się rozdziałowi metodą chromatografii bibułowej. Chromatografia bibułowa jest metodą rozdziału cząsteczek różniących się rozpuszczalnością (polarnością). Po przeprowadzonej chromatografii, bibułę należy wysuszyć i spryskać roztworem ninhydryny. Ninhydryna reaguje z grupami aminowymi wolnych aminokwasów, powstały produkt jest barwny. Obecność glutaminianu (produktu) reagującego z ninhydryną świadczy o obecności enzymu

Materiał i odczynniki

1. 2% roztwór L-alaniny w 0,01 mol/dm³ buforze Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,6% roztwór α-ketoglutaranu sodu w 0,01 mol/dm³ buforze Tris-HCl pH 7,4.

3. 3% roztwór L-glutaminianu sodu w 0,01 mol/dm³ buforze Tris-HCl pH 7,4.

4. 0,01 mol/dm³ buforu Tris-HCl pH 7,4.

5. 25% roztwór NH₃.

6. 1-butanol.

7. 96% etanol.

8. 1% roztwór ninhydryny w acetonie.

9. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować dwie probówki.: 1- Próba właściwa: 2,5 cm³ substratów (L-alanina i α-ketoglutaran) w 0,01 mol/dm³ buforze Tris-HCl pH 7,4 i 2,5 cm³ surowic, 2- .Próba ślepa: 2,5 cm³ mieszaniny substratów i 2,5 cm³ 0,01 mol/dm³ buforu Tris-HCl pH 7,4.

2. Probówki wstawić do inkubacji na 45 minut w temperaturze 37^o C.

3. Po inkubacji i nanieść (kapilarami) na arkusz bibuły Whatman 1 w oznaczonych ołówkiem punktach.

1. 6 kropli z probówki 1 (próba właściwa),

2. 3 krople z probówki 2 (próba ślepa),

3. 3 krople wzorca L-alaniny,

4. 3 krople wzorca L-glutaminianu,

5. 3 krople L-alaniny i 3 krople L-glutaminianu.

4. Po naniesieniu każdej kropli należy suszyć miejsce naniesienia suszarką.

5. Chromatogram rozwijać przez 2 godziny w mieszaninie zawierającej NH₃, butanol i etanol (1:1:8 v/v) w komorze chromatograficznej (chromatografia wstępująca).

6. Następnie chromatogramy wyjąć, wysuszyć i wybarwić rozpylając ninhydrynę na całą powierzchnię bibuły.

7. Chromatogram powtórnie wysuszyć gorącym powietrzem.

8. Zinterpretować uzyskane wyniki.

Hydrolazy - trzecia klasa enzymów

7. Wykrywanie aktywności inwertazy (hydrolazy sacharozy - sacharazy, β-fruktofuranozydazy)

Inwertaza katalizuje hydrolityczny rozkład sacharozy (dwucukru o właściwościach nieredukujących) (Rys. 8). Hydrolizuje wiązanie glikozydowe sacharozy uwalniając glukozę i fruktozę. Uwolniona glukoza posiada zdolności redukujące, co pozwala na jej wykrycie. Sacharoza takich właściwości nie posiada.

Zasada metody

Glukoza w środowisku zasadowym redukuje Cu²⁺ do Cu⁺. Powstaje wtedy trudno rozpuszczalny, czerwony osad Cu₂O. (W środowisku zasadowym fruktoza również może dawać pozytywną próbę, gdyż ulega przekształceniu w glukozę).

Materiał i odczynniki

1. 0,2 mol/dm³ roztwór sacharozy.

2. 1 mol/dm³ roztwór NaOH.

3. Odczynnik Fehlinga I (11% roztwór CuSO₄).

4. Odczynnik Fehlinga II (5% NaOH, 1,65% winian sodowo-potasowy).

5. Roztwór inwertazy, otrzymanej z drożdży.

6. Zagotowany roztwór inwertazy.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy ponumerowane probówki.

2. Do pierwszej i drugiej probówki odmierzyć po 2 cm³ 0,2 mol/dm³ roztworu sacharozy, a do trzeciej 2 cm³ zadania.

3. Do pierwszej i trzeciej dodać 1cm³ roztworu enzymu, a do drugiej 1cm³ enzymu zagotowanego.

4. Wstawić na 15 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C.

5. Po inkubacji do wszystkich probówek dodać po 5 kropli 1 mol/dm³ roztworu NaOH, następnie po 1 cm³ odczynnika Fehlinga II, wymieszać i dodać po 1 cm³ odczynnika Fehlinga I (zawierającego Cu²⁺).

6. Zagotować.

7. Pojawienie się czerwonego zabarwienia roztworu (lub czerwonego osadu) świadczy o aktywności enzymu.

8. Zaobserwować, czy w zadaniu roztwór staje się czerwony.

8.Wykrywanie aktywności ureazy

Ureaza (hydrolaza mocznika) katalizuje reakcję hydrolitycznego rozpadu mocznika (Rys. 9). Enzym ten nie występuje w tkankach ssaków, znajduje się w nasionach niektórych roślin, np. w soi. Występuje też w bakteriach. Stąd obecność tego enzymu w płytce nazębnej i ślinie.

Zasada metody

Utworzony podczas rozkładu mocznika amoniak reaguje z wodą, a powstające w tej reakcji jony OH^- powodują alkalizację środowiska:

NH₃ + H₂O ↔ NH₄⁺ + OH^-

Materiał i odczynniki

1. 2% roztwór mocznika.

2. 1% roztwór fenoloftaleiny w 96% etanolu.

3. Roztwór ureazy z ziarna soi w buforze Tris/HCl pH7,4.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować dwie probówki.

2. Do pierwszej dodać 1 cm³ 2% roztworu mocznika, a do drugiej 1 cm³ zadania.

3. Do obu odmierzyć 0,5 cm³ roztworu ureazy.

4. Następnie do obu dodać jedną kroplę roztworu fenoloftaleiny..

5. Dla przyspieszenia reakcji probówki umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C.

6. Pojawienie się malinowego zabarwienia roztworu świadczy o aktywności enzymu. (Fenoloftaleina w środowisku zasadowym barwi się na malinowo, a w środowisku kwaśnym i obojętnym jest bezbarwna).

7. Zaobserwować, czy w zadaniu bezbarwny początkowo roztwór staje się malinowy.

PRODUKTY PRZEMIANY AZOTOWEJ ORAZ LIPIDY OSOCZA

Procesy metaboliczne zachodzące w organizmie można podzielić na dwie główne grupy procesów biochemicznych. Katabolizm, którego rolą jest wyzwalanie energii i anabolizm prowadzący syntezy różnych związków przebiegający dzięki wykorzystaniu energii uwolnionej w procesach katabolicznych.

Węglowodany i tłuszcze są głównymi związkami dostarczającymi energii. Energia do podtrzymania procesów życiowych może także pochodzić z aminokwasów, składników białek.

Katabolizm obejmuje procesy, w wyniku których glukoza i kwasy tłuszczowe oraz większość aminokwasów w komórce ulega rozpadowi do acetylo-CoA, który jest wspólnym metabolitem rozkładu wszystkich tych związków. Do tego etapu katabolizmu należą procesy β-oksydacji kwasów tłuszczowych, glikolizy i dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu.

Następny etap katabolizmu to przekształcenie reszty acetylowej acetylo-CoA do CO₂ i H₂O, związków które są końcowymi produktami katabolizmu. Dwutlenek węgla powstaje w cyklu Krebsa i dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu, a woda w łańcuchu oddechowym.

Rys.1 Schemat przemian katabolicznych zachodzących w komórkach wątroby

Szkielety węglowe aminokwasów mogą przekształcać się w acetylo-CoA bądź bezpośrednio wchodzić do cyklu Krebsa. Odłączony od aminokwasów amoniak (NH₃) jest bardzo toksycznym związkiem i jest zamieniany w mocznik w cyklu mocznikowym przebiegającym w wątrobie, a następnie jest wydalany z moczem

W procesach katabolicznych zachodzących w organizmie zasadniczą rolę odgrywają dehydrogenazy, enzymy które odłączają atomy wodoru od utlenianych substratów. Dehydrogenazy cytoplazmatyczne pośrednio, a dehydrogenazy mitochondrialne bezpośrednio, przekazują atomy wodoru na łańcuch oddechowy. Łańcuch oddechowy jest układem białek enzymatycznych prowadzących etapowo biosyntezę wody i jest zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej Protony i elektrony z NADH+H⁺ i FADH₂ przejmowane są przez ogniwa łańcucha oddechowego i za ich pośrednictwem przekazywane na tlen cząsteczkowy z utworzeniem wody. Biosynteza wody zachodząca dzięki działaniu łańcucha oddechowego dostarcza znacznej ilości energii (220kJ/mol) , która jest uwalniana stopniowo. Część (poniżej 40%) energii uwalnianej podczas reakcji utleniająco-redukujących zachodzących w łańcuchu oddechowym jest wykorzystana do syntezy ATP, pozostała wydzielana jest jako ciepło.

ATP jest nośnikiem energii. Podczas rozkładu ATP do ADP i fosforanu wydziela się energia niezbędna do prowadzenia szeregu syntez, do działania pomp jonowych, skurczu mięśni. Proces syntezy ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego zachodzący podczas przepływu elektronów przez łańcuch oddechowy w obecności tlenu nazywany jest fosforylacją oksydacyjną. Łańcuch oddechowy wymaga stałego dopływu tlenu. Bez dopływu tlenu główne procesy kataboliczne; oksydacyjna dekarboksylacja pirogronianu, β-oksydacja kwasów tłuszczowych, cykl Krebsa i łańcuch oddechowy zostają zatrzymane i nie może powstawać ATP. Po zaledwie kilku minutach neurony mózgu obumierają na skutek braku ATP. Jedynie bardzo niewielka ilość ATP może powstawać na drodze beztlenowej, jest to fosforylacja substratowa. Część energii uwalnianej podczas procesu glikolizy i cyklu Krebsa jest wykorzystana w ten sposób. Tworzenie ATP na drodze fosforylacji substratowej jest szczególnie istotne wtedy, kiedy z różnych przyczyn synteza ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej jest niemożliwa, np.w intensywnie pracujących mięśniach szkieletowych, w niedotlenionym mięśniu sercowym a także w erytrocytach.

Mocznik

Mocznik powstaje w organizmie w tzw. cyklu mocznikowym. Związek ten pochodzi głównie z przemiany azotowej białek. Białka składają się z aminokwasów.

Aminokwasy są cząsteczkami posiadającymi jedną lub dwie grupy karboksylowe (-COOH) i aminowe (-NH₂ ), w niektórych aminokwasach występują dodatkowe grupy funkcyjne, jak np. -OH, -SH.

COOH Plan budowy aminokwasu

│

H₂N ─ C ─ H R- reszta aminokwasowa o zmiennej strukturze.

│

R

W skład białek wchodzą następujące aminokwasy: glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, tryptofan, metionina, tyrozyna, seryna, cysteina, treonina, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, asparagina, glutamina, arginina, lizyna, histydyna. W cyklu mocznikowym występują aminokwasy niewystępujące w białkach - cytrulina i ornityna. Większość aminokwasów może być wytworzona w organizmie człowieka, osiem z wymienionych aminokwasów musi być stale dostarczana z pokarmem. Do niezbędnych aminokwasów w diecie należą: walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, tryptofan, metionina, treonina, lizyna, u niemowląt histydyna. Białka znajdujące się w pożywieniu powinny być białkami zawierającymi niezbędne aminokwasy. Pełny skład aminokwasów posiadają białka żółtka jajek. Wiele białek pochodzenia roślinnego nie posiada w swoim składzie wszystkich niezbędnych aminokwasów, są to białka niepełnowartościowe. Osoby stosujące dietę wegetariańską powinny zwracać uwagę na rodzaje spożywanych produktów białkowych.

Białka powinny stanowić około 30% składników diety. Podczas procesów trawienia białka są rozkładane do aminokwasów i następnie wchłaniane do organizmu. Zazwyczaj większość aminokwasów służy do biosyntezy nowych białek komórek, ale pewna część ulega katabolizmowi.

W ciągu dnia dorosły człowiek wymienia 1-2% białek, głównie białek mięśni. Do utrzymania zdrowia osoba dorosła potrzebuje od 30 do 60 gramów pełnowartościowego białka dziennie.

Organizm nie ma możliwości gromadzenia nadmiaru aminokwasów. W przypadku spożycia znacznych ilości białka nadmiar wchłoniętych aminokwasów ulega katabolizmowi i powoduje zwiększenie aktywności cyklu mocznikowego celem usunięcia toksycznego amoniaku..

Podczas katabolizmu zachodzi deaminacja aminokwasów i uwalnia się amoniak. Szkielety węglowe aminokwasów stopniowo przekształcają się do acetyloCoA lub bezpośrednio wchodzą do cyklu Krebsa. (rys.1). Stanowią one materiał energetyczny szczególnie w diecie bogatej w białka i w głodzie.

Niewielkie ilości amoniaku powstają również w przemianach nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz amin biogennych. Pewne ilości amoniaku są wchłaniane z przewodu pokarmowego, w którym tworzony jest przez bakterie.

Wiązanie amoniaku jest bardzo szybkie i stężenie tego związku w osoczu jest bardzo niskie, najczęściej utrzymuje się w granicach 0,1-0,2 miligrama w jednym dm³ osocza, w pewnych stanach fizjologicznych (dieta bardzo bogata w białka, głód) może nieco wzrosnąć, ale nie powinno przekraczać 0,8mg/dm³.

Amoniak stanowi ogromne zagrożenie dla całego organizmu a szczególnie dla przemian toczących się centralnym układzie nerwowym.

Wzrost stężenia amoniaku powoduje zahamowanie cyklu Krebsa i dramatyczny spadek stężenia ATP. Spadek stężenia ATP w mózgu powoduje szybkie obumieranie neuronów i grozi zgonem. Wygaszenie cyklu Krebsa jest spowodowane odwróceniem kierunku reakcji usuwania amoniaku z glutaminianu za pomocą dehydrogenazy glutaminianowej. Zjawisko to powoduje zanik

α-ketoglutaranu, niezbędnego metabolitu do przebiegu cyklu (patrz ćw. Glikogen). Dehydrogenaza glutaminianowa występuje w wielu tkankach i w warunkach prawidłowych pełni podstawową rolę w uwalnianu amoniaku w trakcie katabolizmu aminokwasów.

α-ketoglutaran + NH₃↑ + NADH+H⁺ ←-→ glutaminian + H₂O + NAD⁺

( reakcja katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową ,w przypadku prawidłowych

stężeń amoniaku przebiegająca kierunku odwrotnym)

Ponieważ wiązanie amoniaku w nietoksyczny mocznik odbywa się tylko w wątrobie to w pozostałych komórkach jest usuwany za pomocą reakcji przekształcania aminokwasu - glutaminianu w glutaminę.

glutaminian + NH₃ + ATP → glutamina+ ADP + P

Glutamina obok alaniny jest główną formą transportową amoniaku do wątroby. Jeśli stężenie amoniaku rośnie niebezpiecznie w neuronach to następuje przekształcenie całej ilości glutaminianu w glutaminę. Brak glutaminianu w mózgu powoduje utratę świadomości, ponieważ glutaminian i produkt jego dekarboksylacji (GABA) są niezbędnymi neurotransmiterami.

Proces syntezy mocznika pełni ważną biologiczną rolę w przekształcaniu amoniaku w łatwo rozpuszczalny, nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych związek, który następnie jest wydalany z moczem. Synteza mocznika zachodzi w wątrobie przy udziale odpowiednich enzymów. Większość amoniaku w mitochondriach wątroby jest uwalniana z formy transportowej amoniaku - glutaminy w procesie dwuetapowym.

glutamina+ H₂O → glutaminian + NH₃

glutaminaza

glutaminian + H₂O + NAD⁺ ←-→ α-ketoglutaran + NH₃ + NADH+H⁺

dehydrogenaza glutaminianowa

Amoniak łączy się z CO₂ tworząc karbamoilofosforan, reakcja ta wymaga udziału dwóch cząsteczek ATP, jako źródła energii. Karbamoilofosforan następnie reaguje z ornityną, tworząc cytrulinę. Cytrulina przy udziale energii pochodzącej z hydrolizy ATP kondensuje z asparaginianem, który jest dawcą drugiego atomu azotu. Powstały argininobursztynian ulega rozszczepieniu na argininę i fumaran. Arginina hydrolizuje dając mocznik i ornitynę, zamykając w ten sposób jeden obrót cyklu. Dwie pierwsze reakcje zachodzą w mitochondriach komórek wątroby, pozostałe trzy przebiegają w cytoplazmie.

Syntetaza karbamoilofosforanowa

NH₃ + CO₂ + 2ATP -----------------------------→ karbamoilofosforan + 2ADP + fosforan

Karbamoilotransferaza ornitynowa

karbamoilofosforan + ornityna ----------------------→ cytrulina

Syntetaza argininobursztynianowa

cytrulina + asparaginian + ATP -----------------------→ argininobursztynian + AMP + pirofosforan

Liaza argininobursztynianowa

argininobursztynian --------------------------→ arginina + fumaran

Argininaza

arginina + H2O -----------------→ ornityna + mocznik

Rys. 2 Schemat przebiegu cyklu mocznikowego

Zdrowy, dorosły człowiek, na prawidłowej diecie jest w stanie tzw. równowagi azotowej. Dobowa ilość azotu wydalana z organizmu jest równa ilości azotu przyjmowanego z pożywieniem. Przy spożyciu białka w ilości około 100 gramów na dobę wydalane jest 16 gramów azotu. 80 - 90% całkowitej puli wydalanego azotu stanowi mocznik. Ilość wytworzonego w organizmie dorosłego człowieka mocznika zależy głównie od zawartości białka w pożywieniu i przeciętnie wynosi od 20 do 40 g na dobę. Stężenie tego związku we krwi w warunkach prawidłowych waha się w szerokich granicach, od 20 do 40 mg/100 cm³, a nawet może osiągać 50 mg/100 cm³.

Kreatynina

Kreatynina jest produktem pwstającym z przekształcenia kreatyny. Kreatyna występuje głównie w mięśniach. Fosforan kreatyny jest magazynem energii zużywanym podczas intensywnej pracy.

Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy tego ważnego metabolitu. Arginina, metabolit cyklu mocznikowego, ulega w komórkach nerki kondensacji z glicyną. Powstaje guanidynooctan, który jest metylowany przez S-adenozylometioninę (SAM) do kreatyny. Kreatyna jest następnie fosforylowana za pomocą ATP przy udziale kinazy kreatynowej i przechodzi w fosforan kreatyny, stanowiący zapas łatwo uruchamianej energii w mięśniu. Fosfokreatyna powstaje podczas spoczynku a rozkłada się podczas pracy mięśnia.

W ciągu doby około 1,6% fosfokreatyny przekształca się w bezwodnik - kreatyninę, bez udziału enzymu.

Arginina + glicyna → guanidynooctan + ornityna

Guanidynooctan + 3 S-adenozylometionina → kreatyna + 3 S-adenozylohomocysteina

Kreatyna + ATP ← → fosfokreatyna + ADP

Fosfokreatyna → kreatynina + fosforan ( bez udziału enzymu, ~1,6%)

Rys.3 Schemat przekształceń kreatyny

Kreatynina jest wydalana z moczem, przeciętnie od 1 do 1,8 gramów na dobę. Prawidłowe stężenie kreatyniny w surowicy wynosi u dorosłych kobiet od 0,5 do 1 mg/100 cm³, a u mężczyzn 0,6 - 1,2 mg/100 cm³. Znacznie niższe stężenie kreatyniny występuje u małych dzieci do trzech lat (0,2-0,4 mg/100 cm³). W miarę dorastania stężenie to stopniowo wzrasta, aby osiągnąć w wieku 17 lat wartości charakterystyczne dla ludzi dorosłych.

Podwyższone stężenie kreatyniny we krwi może wystąpić w chorobach nerek, mięśni i zatruciach witaminą D.

Kwas moczowy

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych w organizmie człowieka. Zasady purynowe nie przekształcają się do acetylo-CoA . Ulegają jedynie niewielkim zmianom, których celem jest zwiększenie rozpuszczalności tych związków. Utworzony z zasad purynowych kwas moczowy następnie wydalany jest z moczem. Katabolizm zasad purynowych nie dostarcza energii.

Zasady purynowe - adenina i guanina wchodzą w skład nukleotydów. Nukleotyd AMP składa się z adeniny, pięciowęglowego cukru - rybozy i fosforanu. GMP z guaniny, rybozy i fosforanu. Nukleotydy w komórkach ulegają stałym przemianom. Związki te są rozkładane za pomocą enzymów, a także ulegają samorzutnemu rozpadowi na skutek wpływu środowiska.

Nukleotydazy rozkładają hydrolitycznie nukleotydy do nukleozydów. Z nukleozydów fosforylazy nukleozydowe uwalniają wolne zasady i rybozo-1-fosforan. Większość uwolnionych zasad purynowych zostaje ponownie użyta do tworzenia nukleotydów na drodze rezerwowych szlaków metabolicznych.

Niewielka część uwolnionych zasad - guaniny i adeniny ulega przekształceniu do kwasu moczowego i jest wydalana z moczem.

Guanina pod wpływem hydrolazy - guanazy (deaminazy guaninowej) przekształcana jest do ksantyny.

guanina + H₂O → ksantyna + NH₃

Uwolniona adenina pod wpływem adenazy (hydrolazy adeniny ) przekształca się w hipoksantynę;

adenina + H₂O → hipoksantyna + NH₃

Hipoksantyna i ksantyna są stopniowo przekształcane w kwas moczowy przy udziale oksydazy ksantynowej.

hipoksantyna → ksantyna → kwas moczowy

Mechanizm tej reakcji jest złożony, enzym do swojego działania wymaga udziału O₂, FAD, jonów molibdenu i żelaza. Jeden atom tlenu cząsteczkowego, utleniacza w obu reakcjach, zostaje dołączony do pierścienia puryny, drugi zaś zostaje zredukowany do H₂O_2. Nadtlenek wodoru następnie jest rozkładany przez katalazę do H₂O i O₂.

Przyłączenie tlenu do pierścienia puryny zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Jednak kwas moczowy jest nadal związkiem trudno rozpuszczalnym. Lepiej rozpuszczalne są jego sole - moczany, które tworzą się w pH obojętnym i zasadowym. Kryształy moczanów wytrącają się w roztworach przekraczających stężenie 7 miligramów tego związku na 100 cm³ wody. Dlatego też znaczna część moczanów w osoczu zaadsorbowana jest na albuminach, co przeciwdziała ich wytrącaniu.

Prawidłowe stężenie kwasu moczowego (głównie w postaci moczanów) we krwi dorosłych kobiet wynosi od 2 do 6 mg/100 cm³, u mężczyzn od 3 do 7,5 mg/100 cm³. Stężenie kwasu moczowego w osoczu zależy także od diety, niższe stężenia tego związku występują u ludzi stosujących dietę wegetariańską.

W ciągu doby organizm zdrowego, dorosłego człowieka wytwarza przeciętnie od 400 do 800 miligramów kwasu moczowego, który następnie jest wydalany z moczem.

Nadmierne jego wytwarzanie powoduje podwyższenie jego stężenia we krwi (hiperurykemia) i jest przyczyną zmian chorobowych, wywołanych przez wytrącanie się kryształów moczanu sodu szczególnie w stawach i nerkach (dna moczanowa). Większość ssaków przekształca dalej kwas moczowy do łatwo rozpuszczalnej substancji - alantoiny. Brak możliwości przekształcania kwasu moczowego do alantoiny jest jednak korzystnym czynnikiem selekcyjnym. Moczany bardzo łatwo się utleniają i są bardzo wydajną substancją usuwającą wysoce reaktywne, szkodliwe formy tlenu (rodniki hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe). Obecność moczanów w osoczu może wydatnie przyczyniać się do wydłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia zapadalności na choroby nowotworowe. Moczany jak również bilirubina są przykładami reguły, że niektóre produkty końcowe pochodzące ze szlaków metabolicznych odgrywają ważną rolę jako czynniki ochronne.

LIPIDY OSOCZA

Tłuszcze, czyli lipidy to duża grupa związków o różnorodnej budowie. Wspólną cechą lipidów jest ich charakter hydrofobowy, czyli nierozpuszczalność w wodzie. Ze względu na budowę tłuszcze można podzielić na ;

- tłuszcze proste - triacyloglicerole,

- tłuszcze złożone, do których należą fosfolipidy i glikolipidy,

- cholesterol ,

- woski.

Tłuszcze proste

Tłuszcze proste gromadzą się w tkance tłuszczowej i stanowią cenny materiał energetyczny. Tłuszcze złożone i cholesterol są składnikami błon biologicznych. W skład tłuszczów prostych wchodzi glicerol i powiązane z nim wiązaniami estrowymi reszty kwasów tłuszczowych. Typowymi kwasami tłuszczowymi jest kwas palmitynowy C₁₅H₃₁COOH, kwas stearynowy C₁₇H₃₅COOH, oraz kwasy mające wiązania podwójne jak kwas oleinowy C₁₇H₃₃COOH. Do budowy lipidów złożonych i powstawania hormonów tkankowych - prostaglandyn, leukotrienów potrzebne są wielonienasycone kwasy tłuszczowe. Wielonienasyconych kwasów tłuszczowych organizm nie potrafi wytworzyć i stanowią one rodzaj witaminy niezbędnej w codziennej diecie. Do niezbędnych kwasów tłuszczowych zaliczany jest kwas linolowy ( C₁₇H₃₁COOH , ω6 ) i kwas linolenowy (C₁₇H₂₉COOH, ω3 ). Kwas linolowy posiada dwa wiązania podwójne w konfiguracji cis przy węglach dziewiątym i dwunastym licząc od grupy karboksylowej, oznaczenie ω6 pokazuje położenie wiązania podwójnego od drugiego końca cząsteczki. Kwas linolenowy posiada dodatkowo wiązanie podwójne przy węglu 15 - ω3 . Źródłami wielonienasyconych kwasów tłuszczowych są oleje roślinne i tłuszcz ryb morskich.

H₂ COCOC₁₇H₃₅

│

H C OCOC₁₇H₃₁

│

H₂COCOC₁₇H₃₅

Tłuszcz prosty składający się z dwóch reszt kwasu stearynowego,

i reszty kwasu oleinowego przyłączonego do drugiego węgla glicerolu.

Tłuszcze proste pod wpływem enzymów hydrolitycznych - lipaz rozkładają się do wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Glicerol ulega dalszym przemianom w wątrobie, może być zamieniany w acetylo-CoA (rys.1) i być źródłem energii lub może z niego powstać glukoza na drodze glukoneogenezy.

Kwasy tłuszczowe są wykorzystywane do produkcji energii w wielu tkankach. Stanowią one główne paliwo energetyczne mięśnia sercowego i mięśni poprzecznie prążkowanych. Neurony i erytrocyty nie katabolizują kwasów tłuszczowych.

Wolny kwas tłuszczowy w komórce jest przekształcany przy udziale syntetazy acylo-CoA w wysokoenergetyczną formę acylo-CoA, np. kwas palmitynowy w palmitoilo-CoA. Koenzym A (CoA) jest nośnikiem reszt kwasów karboksylowych, w swojej strukturze zawiera witaminę - kwas pantotenowy.

C₁₅H₃₁COOH + ATP + CoA → C₁₅H₃₁CO~SCoA + AMP + PP

Następnie acylo-CoA transportowany jest do mitochondriów przy udziale karnityny. W mitochondriach reszta kwasu tłuszczowego przekształcana jest w dwuwęglowe reszty kwasu octowego - CH₃CO~SCoA (acetylo-CoA). Proces degradacji kwasu tłuszczowego do odpowiedniej ilości cząsteczek acetylo-CoA nazywa się β-oksydacją. β-oksydacja składa się z czterech powtarzających się etapów.

1. W pierszym etapie na acyloCoA działa dehydrogenaza acylo-CoA. Zawiera FAD i odrywa dwa atomy wodoru od węgla drugiego (β) i trzeciego acylo-CoA.

acylo-CoA + FAD → β-nienasycony acylo-CoA + FADH₂

2. W kolejnym etapie działa hydrataza, która przyłącza wodę do wiązania podwójnego.

β-nienasycony acylo-CoA + H2O → β-hydroksyacylo-CoA

3. Następna reakcja jest katalizowana przez dehydrogenazę β-hydroksyacylo-CoA, której koenzymem jest NAD⁺ i odrywa następne dwa atomy wodoru.

β-hydroksyacylo-CoA + NAD⁺ → β-ketoacylo-CoA + NADH+H⁺

4. β-ketoacylo-CoA następnie przy udziale tiolazy i CoA rozpada się na cząsteczkę

acetylo- CoA i acylo-CoA, krótszy o dwa atomy węgla.

β-ketoacylo-CoA + CoA → acetylo-CoA + acylo_n-2CoA

Proces ten powtarza się wielokrotnie, aż cała cząsteczka acylo-CoA zamieni się w dwuwęglowe fragmenty acetylo-CoA.

Sumaryczna reakcja β-oksydacji palmitoilo-CoA przedstawia się następująco:

C₁₅H₃₁CO~SCoA + 7 FAD + 7 H₂O + 7 NAD⁺ + 7 CoA →

8 CH₃CO~SCoA + 7 FADH₂ + 7 NADH+H⁺

Atomy wodoru z FADH₂ i NADH+H⁺ przekazywane są na łańcuch oddechowy, do biosyntezy wody. W trakcie biosyntezy wody w łańcuchu oddechowym wydziela się stopniowo energia, która służy do powstawania ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego, oraz do utrzymania stałej ciepłoty ciała. Reszta acetylowa z acetylo-CoA przekształcana jest do CO₂ i H₂O przy udziale cyklu Krebsa współdziałającego z łańcuchem oddechowym (rys.1). Dzięki temu procesowi powstają następne cząsteczki ATP. Całkowity katabolizm cząsteczki kwasu palmitynowego dostarcza 129 cząsteczek ATP.

β-oksydacja kwasów tłuszczowych przebiega tylko w warunkach dostępu tlenu. Bez dostatecznej ilości tlenu łańcuch oddechowy, cykl Krebsa i β-oksydacja nie może przebiegać.

Tłuszcze złożone

W organizmach występują tłuszcze złożone - glicerofosfolipidy, sfingomieliny i glikolipidy. Tłuszcze złożone są elementami składowymi różnych błon biologicznych, zarówno błony komórkowej, jak i błon wewnątrzkomórkowych. Nie stanowią one zapasowego materiału energetycznego. Pełnią one wiele innych funkcji. Zakotwiczają pewne białka w błonach, uczestniczą w przekazywaniu sygnałów transbłonowych, są składnikami surfaktantu płucnego, uczestniczą w budowie lipoprotein osocza, zwiększają rozpuszczalność cholesterolu w żółci.

Cholesterol

Cholesterol występuje we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej i narządach miąższowych. Jest jednym z najważniejszych składników błon komórkowych i lipoprotein krwi. Występuje często w połączeniu z kwasami tłuszczowymi jako estry cholesterolu. Cholesterol jest także prekursorem hormonów steroidowych (np. kortyzolu, estrogenów, testosteronu), witaminy D₃ oraz kwasów żółciowych, które są naturalnymi detergentami niezbędnymi przy trawieniu tłuszczów.

Jest on dobrze przyswajanym składnikiem pożywienia, znajduje się w pokarmach pochodzenia zwierzęcego. Związek ten jest także syntetyzowany z acetylo-CoA w cytoplazmie wielu tkanek, przede wszystkim w wątrobie. W ciągu dnia organizm człowieka traci około 1 grama cholesterolu, głównie w postaci kwasów żółciowych wydalanych z kałem oraz ze złuszczającymi się nabłonkami. Zwykle około połowy dziennego zapotrzebowania pochodzi z syntezy własnej, pozostała część cholesterolu jest dostarczana z pokarmem.

Cholesterol jest także czynnikiem patogennym. Jest on głównym składnikiem kamieni żółciowych i złogów miażdżycowych powodujących arteriosklerozę.

Cholesterol jako związek trudno rozpuszczalny jest transportowany we krwi za pomocą lipoprotein. Najwięcej cholesterolu i jego estrów z kwasami tłuszczowymi znajduje się we frakcji LDL, która stanowi przekształconą formę lipoproteiny typu VLDL. Obie te lipoproteiny pośredniczą w przenoszeniu tego związku do wielu tkanek.

Nadmiar cholesterolu jest ponownie odprowadzany do wątroby przez cząstki HDL i tam może być przekształcony w kwasy żółciowe. Lipoproteina HDL spełnia ważną rolę w tzw. odwróconym transporcie cholesterolu.

Nadmierne stężenie cholesterolu we krwi odgrywa decydującą rolę w procesach patologicznych towarzyszących powstawaniu miażdżycy. Wraz z rosnącym stosunkiem stężenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL nasilają się procesy miażdżycy. Stężenie HDL jest odwrotnie proporcjonalne do częstości występowania miażdżycy naczyń wieńcowych. Całkowite stężenie cholesterolu we krwi zwiększa się wraz z wiekiem i wynosi dla populacji ludzkiej średnio 3,9-7,2 mmola/dm³ (150 - 280 mg/100 cm³).

Stężenie cholesterolu we frakcji LDL uzależnione jest również od wieku. Górne granice zawartości cholesterolu frakcji LDL wynoszą 170 mg/100 cm³ (do 29 roku życia) i dochodzą do 210 mg/100 cm³ powyżej 50 lat. Stężenia cholesterolu HDL wahają się średnio w granicach 45 - 60 mg/100 cm³.

Optymalne, całkowite stężenie cholesterolu w osoczu nie powinno przekraczać 200 mg/100 cm³, stężenie cholesterolu LDL powinno wynosić poniżej 135 mg/100 cm³, a stężenie cholesterolu HDL powinno być wyższe od 45 mg/100 cm³.

Obecnie uznaje się, że całkowite stężenie cholesterolu osocza przewyższające 240 mg/100 cm³ stanowi już poważne zagrożenie dla zdrowia człowieka.

Lipoproteiny osocza krwi

Lipidy nie rozpuszczają się w wodzie i w osoczu tworzą złożone cząstki zwane lipoproteinami. Frakcjami lipoprotein są: chylomikrony, lipoproteiny typu VLDL, LDL, IDL i HDL. Cząstki lipoprotein utworzone są z rozpuszczalnych w osoczu kompleksów białkowo-lipidowych. Na powierzchni lipoprotein znajdują się polarne grupy białek, fosfolipidów i cholesterolu, a we wnętrzu znajdują się apolarne rdzenie, złożone z estrów cholesterolu i triacylogliceroli.

Chylomikrony powstają w komórkach jelita i transportują głównie tłuszcze proste pochodzące z diety. Stanowią one średnio około 88% masy tej lipoproteiny. Chylomikrony także transportują wchłonięty z pożywienia cholesterol w postaci wolnej lub zestryfikowany kwasem tłuszczowym oraz witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Cząstki te posiadają białko apoB-48, integrujące całą cząstkę, białko apoE oddziałujące z receptorami znajdującymi się na powierzchni komórek oraz niewielkie domieszki innych białek.

Tłuszcze proste znajdujące się w lipoproteinach krwi są rozkładane do wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu przez lipazę lipoproteinową znajdującą się na powierzchni naczyń włosowatych.

Chylomikrony na skutek działania tego enzymu tracą tłuszcze proste i przekształcają się w tzw. ciałka resztkowe (remnanty) bogate w cholesterol, które są wychwytywane przez wątrobę za pomocą receptorów apoE lub LDL. Oczyszczanie krwi z chylomikronów jest szybkie, biologiczny czas półtrwania tych cząstek we krwi wynosi poniżej jednej godziny.

Frakcja lipoprotein typu VLDL powstaje głównie w wątrobie. Transportuje wytworzone w tym organie tłuszcze proste, fosfolipidy oraz cholesterol. Białkiem integrującym całość tej lipoproteiny jest apoB-100, występuje też białko receptorowe apoE i inne białka. Lipoproteiny tego typu są wychwytywane przez komórki za pomocą receptorów LDL i wprowadzane do ich wnętrza w wyniku endocytozy.

Lipoproteiny VLDL, również na skutek działania lipazy lipoproteinowej, stopniowo tracą tłuszcze proste przekształcając się w lipoproteiny o pośredniej gęstości - IDL. Lipoproteiny IDL następnie na skutek działania tego samego enzymu stają się lipoproteinami o małej gęstości - LDL.

Podstawowymi składnikami LDL są estry cholesterolu (około 48% masy lipoproteiny) i wolny cholesterol (10%). Lipoproteiny typu LDL na skutek utraty białka receptorowego apoE są bardzo źle wychwytywane przez komórki za pomocą receptorów LDL. Półokres trwania lipoproteiny LDL w osoczu w porównaniu z innymi lipoproteinami jest bardzo długi i wynosi nawet dwa dni. W tym czasie wiązania podwójne występujące w kwasach tłuszczowych lipidów LDL są atakowane przez tlen, co powoduje powstanie toksycznych, utlenionych pochodnych. Utlenione formy LDL mają tendencję do odkładania się w ścianach naczyń, tworząc złogi miażdżycowe.

Lipoproteiny o dużej gęstości - HDL powstają w wątrobie i w mniejszym stopniu w komórkach jelita. Są one odpowiedzialne za tzw. odwrócony transport cholesterolu z tkanek, złogów i innych lipoprotein do wątroby. Nadmiar cholesterolu z wątroby jest wydalany z żółcią w postaci wolnej lub po przekształceniu w sole kwasów żółciowych. Sole kwasów żółciowych i cholesterol są w dużej mierze wchłaniane przez komórki jelita i powracają ponownie do wątroby w krążeniu jelitowo-wątrobowym. Część kwasów żółciowych jest jednak wydalana z kałem, przeciętnie około jednego grama na dobę. Oznaczanie ilości poszczególnych frakcji lipoprotein, a także zawartości w nich cholesterolu, jest obecnie szeroko stosowane w diagnostyce laboratoryjnej. Wielu chorobom towarzyszą zmiany w składzie lipoprotein.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie mocznika w surowicy krwi metodą ureazową

Zasada metody

Mocznik ulega hydrolizie w reakcji katalizowanej przez ureazę (enzym pochodzenia roślinnego lub bakteryjnego). Powstałe jony amonowe reagują z odczynnikiem Nesslera i tworzy się barwny produkt. Natężenie barwy należy zmierzyć kolorymetrycznie po odbiałczaniu surowicy poprzez denaturację białek za pomocą soli metali ciężkich (10% roztwór ZnSO₄.i 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.), a nastepnie obliczyć zawartość mocznika w surowicy

Na podstawie proporcji uwzględniającej fakt, że absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia.

Odczynniki

1. Roztwór ureazy z ziaren soi w buforze Tris-HCl o pH 7,4.

2. 10% roztwór ZnSO₄.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. Wzorzec do oznaczania mocznika (roztwór NH₄Cl o stężeniu 1 mg N/100 cm³).

5. Odczynnik Nesslera (zasadowy roztwór K₂[HgJ₄]).

a) Odbiałczanie surowicy

Wykonanie doświadczenia

1. Do probówki wirówkowej odmierzyć 1 cm³ wody i 0,2 cm³ surowicy.

2. Następnie dodać 2 cm³ roztworu ureazy w buforze Tris-HCl, pH 7,4.

3. Probówkę zakryć parafilmem, wstawić do łaźni wodnej o temp. 37⁰ C i inkubować 20 minut.

4. Po inkubacji dodać 0,5 cm³ 10% roztworu ZnSO₄ i 0,3 cm³ 0,5 mol/dm³ roztworu NaOH w celu wytrącenia białek.

5. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i odwirować (5 min, 3000 obr./min). Płyn znad osadu zdenaturowanych białek zlać do suchej probówki.

b) Oznaczenie ilościowe mocznika

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy ponumerowane probówki.

1. próba badana - odmierzyć 2 cm³ płynu nadosadowego i 5 cm³ wody,

2. próba wzorcowa - dodać 1 cm³ roztworu wzorcowego i 6 cm³ wody

3. próba ślepa - 7 cm³ wody

2. Zawartość probówek wymieszać.

3. Do wszystkich trzech probówek dodać po 1 cm³ odczynnika Nesslera, wymie szać.

4. Absorbancję odczytać po 5 minutach, przy długości fali 470 nm, wobec próby ślepej.

Obliczenia

1 mg azotu odpowiada 2,14 mg mocznika (60:28, 60 - względna masa cząsteczkowa mocznika, 28 - względna masa cząsteczkowa azotu), współczynnik 10 wynika z rozcieńczenia surowicy - w końcowej objętości znajduje się 0,1 cm³ surowicy, a 1 cm³ wzorca.

2. Oznaczanie kreatyniny w surowicy krwi i w zadaniu

Zasada metody

Kreatynina z kwasem pikrynowym tworzy kompleks o zabarwieniu czerwonym. Natężenie powstałej barwy należy zmierzyć kolorymetrycznie po odbiałczaniu surowicy poprzez denaturację białek za pomocą soli metali ciężkich ( w tym przypadku jonów wolframu), i w zadaniu ilościowym indywidualnym dla każdego studenta (bez odbiałczania), a nastepnie obliczyć stężenie kreatyniny w surowicy i zadaniu.

Reakcja jest mało swoista i w zależności od warunków (temperatura, czas inkubacji, pH środowiska) intensywność zabarwienia może zmieniać się nieproporcjonalnie. Rzeczywista zawartość kreatyniny w osoczu stanowi zwykle około 80% wartości oznaczanej tą metodą.

Odczynniki

1. 10% roztwór Na₂WO₄.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO_4,

3. 1 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego.

5. Wzorcowy roztwór kreatyniny o stężeniu 4 mg/ 100 cm³.

Wykonanie doświadczenia

a) Odbiałczanie surowicy

1. Do probówki wirówkowej pobrać 3 cm³ surowicy.

2. Dodać 1,5 cm³ 10% roztworu Na₂WO₄ i następnie dodawać kroplami, ciągle mieszając

1,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ celem zdenaturowania białek.

3. Dokładnie wymieszać.

4. Odstawić na 30 minut.

5. Odwirować (15 min, 4000 obr./min).

6. Płyn znad osadu zlać do suchej probówki.

b) Wykonanie oznaczenia ilościowego