1040 Medycyna Wet. 2007, 63 (9)
Artyk rz g d y
Zastosowanie cytometrii przepływowej
w medycynie weterynaryjnej
URSZULA LISIECKA, KRZYSZTOF KOSTRO, ŁUKASZ JAROSZ
Zakład EpizootioIogii i KIinika Chorób Zakax
nych Instytutu Chorób Zakax
nych i Inwazyjnych
Wydziału Medycyny Weterynaryjnej AR, uI. Głęboka 30, 20-612 LubIin
Lisiecka U., Kostro K., Jarosz Ł.
Applying flow cytometry in veterinary medicine
Summary
The number of ways in which flow cytometry may be applied in veterinary sciences is continually increasing,
especially in the fields of immunology, oncology, pharmacology and microbiology. White blood cell analysis by
flow cytometry, and in particular, the study of leukocyte antigens, phagocytosis and intracellular killing, is
being applied to an ever growing number of animal species. Moreover, flow cytometry enables red blood cell
analysis, including reticulocyte count and maturity, identification of anti-erythrocyte antibodies and
intraerythrocyte parasites detection. Through flow cytometry it is possible to make a speedy and precise
diagnosis of neoplasms. In diseases of the haematopoietic system, such as leukemia and lymphomas this method
allows the cell line which has become malignant to be precisely established. When appropriate procedures are
used, solid tissues such as tumors can be investigated, and if there is no direct access to tumors, it is possible
to study cells from secondary lesions  e.g. pleural fluid or peritoneal fluid. Flow cytometry can provide
information about sperm parameters, such as sperm cell chromatin structures or differentiations between
X and Y bearing sperm cells. The flow cytometry method enables a wide range of diseases to be diagnosed
by studying apoptosis, i.e. programmed cell death. When adequate, modified procedures are applied, it can
be utilized in diagnosing bacterial and viral infections and it is the only method which makes it possible to
determine cytokines produced by different cell populations, and cytokine sets produced by a single cell.
Keywords: flow cytometry, immunophenotyping, apoptosis, cytokines
Cytometria przepływowa (flow cytometry  FCM) ma kocytów w pełnej krwi jest możliwe dzięki wydzielaniu
obecnie szeroki wachlarz zastosowań w rutynowej grup komórek przy pomocy programu komputerowego
diagnostyce klinicznej człowieka, ale jej wykorzystanie  tak zwane ustalanie okna, bramkowanie. Wcześniej
wzrasta także w naukach weterynaryjnych, zwłaszcza należy z krwi usunąć erytrocyty przez dodanie buforu
w immunologii, onkologii, farmakologii i mikrobiologii. lizującego. Badanie leukocytów polega najczęściej na
Użycie przeciwciał monoklonalnych, specyficznych oznaczaniu ich immunofenotypu, zestawu antygenów
w stosunku do konkretnego epitopu na komórkach krwi różnicowania (CD  Cluster Designation, Cluster Diffe-
zwierząt towarzyszących człowiekowi oraz stanowiących rentiation), który jest charakterystyczny dla danej po-
z
ródło pożywienia, poszerzyło spektrum testów o poten- pulacji komórek (2). Przy zastosowaniu odpowiednich
cjalnym zastosowaniu klinicznym. Zalicza się tu takie przeciwciał można ocenić zarówno ekspresję określonej
testy, jak: określanie liczby niedojrzałych i dojrzałych re- cząsteczki CD na powierzchni różnego typu komórek,
tikulocytów, wykrywanie immunoglobulin wiążących się jak i ekspresję różnych antygenów na komórkach jedne-
z komórkami krwi, immunofenotypowanie białaczek go typu (15, 20).
i chłoniaków, analizowanie komórek różnych populacji Cytometrię przepływową można wykorzystać do oce-
szpiku kostnego oraz pojedynczych komórek różnych po- ny stanu czynnościowego neutrofilów. Jedną z najważ-
pulacji w zawiesinie, niezwiązanych z podłożem w pły- niejszych funkcji tych komórek jest fagocytoza. Do jej
nach tkankowych bądz
komórkach tkanek i narządów oceny używa się cząstek, które są fagocytowane przez
świeżych, zamrożonych lub utrwalonych w parafinie komórki żerne. Są one znakowane barwnikami fluo-
celowo uwolnionych z otaczającej je substancji między- rescencyjnymi (izotiocyjanian fluoresceiny  FITC, oranż
komórkowej (2, 15, 30). akrydyny). Dotychczas w badaniach używano cząstek
lateksu (1,8 mm), nanocząstek (0,3 mm), zymosanu,
Analiza układu białokrwinkowego
liposomów, krwinek czerwonych, mikroorganizmów
Leukocyty można analizować w pełnej krwi lub jako (Staphylococcus aureus, Escherichia coli i wiele innych)
komórki izolowane w gradiencie gęstości. Badanie leu- lub grzybów (Candida albicans, drożdże piekarnicze).
Medycyna Wet. 2007, 63 (9) 1041
Aby określić dokładnie procent fagocytujących mono- Ocena liczby retikulocytów jest oparta na pomiarze
cytów i granulocytów oraz aktywność fagocytarną (śred- intensywności fluorescencji RNA zawartego w retikulo-
nia ilość sfagocytowanych bakterii w przeliczeniu na cycie. Do barwienia RNA retikulocytów stosowane są
jedną komórkę), stosuje się komercyjnie dostępny test fluorochromy, takie jak: oranż tiazolowy, oranż akrydy-
Phagotest (Orpegen, Niemcy). Jest to szybki test, który ny, auramina czy bromek etydyny. Kluczowym paramet-
pozwala określić aktywność fagocytarną w niewielkiej rem jest odsetek retikulocytów o wysokiej zawartości
objętości krwi pełnej lub w płynie stawowym. Jego skład- RNA, których cechą charakterystyczną jest zwiększona
nikiem są bakterie E. coli znakowane FITC, opsonizo- intensywność fluorescencji (21). U zwierząt cytometria
wane przeciwciałami i składowymi dopełniacza pulowa- przepływowa była stosowana do oznaczania liczby reti-
nej surowicy (11, 34). kulocytów u psów i kotów i w obu przypadkach rezulta-
W oparciu o ocenę metabolizmu tlenowego komórki ty były porównywalne z obliczeniami manualnymi (30).
można wykazać, czy materiał pochłonięty przez neutro- Cytometria przepływowa jest stosowana z powodze-
file został zdegradowany. W tym celu wykrywa się pro- niem do wykrywania wewnątrzerytrocytarnych pasoży-
dukty powstałe w czasie aktywacji systemu oksydazy tów. Erytrocyty inkubuje się z hydroetydyną, która jest
NADPH. W cytometrii przepływowej do wykazania pochłaniana przez żywe komórki i przekształcana do ety-
obecności produktów aktywacji oksydazy stosuje się dyny. Etydyna jest fluorochromem, wiążącym się z DNA
dwuoctan 2 7 -dichlorofluorescyny (DCFH-DA). Jest to pasożyta. Ta technika została wykorzystana do prześle-
mała cząstka, nie wykazująca fluorescencji, która po prze- dzenia cyklu rozwojowego Babesia bovis w erytrocytach
niknięciu przez błonę wewnątrz komórki ulega przekształ- bydlęcych, a w erytrocytach psich do identyfikacji ko-
ceniom przez enzymy komórkowe do 2 7 -dichloroflu- mórek zainfekowanych Babesia gibsoni. Cytometria jest
oresceiny (DCF), która emituje sygnał fluorescencyjny także pomocna w ocenie skuteczności leków przeciw-
(530 nm). Inna metoda polega na zastosowaniu utlenia- malarycznych. Zainfekowane zarodz
cem malarii ludzkie
nia wewnątrzkomórkowego hydroetydyny (HE) do brom- erytrocyty barwi się z użyciem barwnika Hoechst 33258.
ku etydyny, który wykazuje czerwoną fluorescencję. Aby Zaletą cytometrii jest to, że pozwala ona na wykrycie
wykazać obecność w komórce tych dwóch metabolitów, pasożyta występującego nawet w bardzo małej ilości (30).
należy zastosować bardzo silne stymulatory wybuchu od- Zastosowanie cytometrii przepływowej w hematolo-
dechowego, na przykład estry forbolu (PMA) (11, 34). gii weterynaryjnej może mieć miejsce przy ocenie iloś-
W laboratoriach stosuje się ponadto wystandaryzowane ciowej niedojrzałych płytek krwi, które były badane we
testy, takie jak Bursttest (Orpegen). Stymulatorem wy- krwi ludzi, psów i koni w sposób podobny do stosowa-
buchu tlenowego jest słaby aktywator N-formylometio- nego przy analizie retikulocytów (21, 31). Wiele testów
nyloleucynofenyloalanina (FMLP) oraz opsonizowane z wykorzystaniem cytometrii przepływowej jest udosko-
E. coli. Substancją, która ulega przekształceniom w ko- nalanych w celu identyfikacji krążących w organizmie
mórce, jest DHR 123. Można określić intensywność fluo- płytek aktywowanych. Do testów tych zalicza się m.in.:
rescencji powstałej rodaminy 123 i dzięki temu zbadać wiązanie fibrynogenu do płytek, stosowanie przeciwciał
aktywność enzymatyczną. przeciwko płytkowym markerom zależnym od aktywa-
Badanie reaktywnych pochodnych tlenu (ROS) może cji, wykrywanie płytkowych mikrocząstek, badanie zmia-
przyczynić się do wykrycia szeregu chorób zakaz
nych ny kształtu oraz detekcja agregatów płytki-leukocyty.
oraz oceny zaburzeń czynności neutrofilów. Podobne Obecność przeciwciał skierowanych przeciwko płytkom,
badania wykorzystano do oceny zmian funkcjonalnych która pozwala wykryć trombocytopenię, ehrlichiozę i ba-
neutrofilów u bydła oraz identyfikacji zwierząt podat- dać procesy nowotworzenia, była badana u ludzi i psów
nych na chroniczne zapalenie wymion wywołane przez (21, 31). Testy te są pomocne w ocenie stanu zdrowia
Staphylococcus aureus (13, 34). Cytometria przepływo- zwierząt.
wa została także z powodzeniem zastosowana do oceny
Diagnostyka nowotworów
fagocytozy oraz zabijania wewnątrzkomórkowego u świń,
Bardzo ważne z punktu widzenia kliniki jest wyko-
psów, kotów, królików, bydła, a nawet u wielorybów (6,
11, 13, 23). rzystanie cytometrii przepływowej w rutynowej diag-
nostyce schorzeń układu krwiotwórczego, takich jak bia-
Analiza układu czerwonokrwinkowego
łaczki i chłoniaki. Cytometria przepływowa umożliwia
Cytometryczna analiza erytrocytów dotyczy przede ocenę dokładnej liczby komórek zmienionych nowotwo-
wszystkim określania liczebności i dojrzałości retikulo- rowo oraz określenie linii komórkowej, z jakiej pocho-
cytów, identyfikowania przeciwciał skierowanych prze- dzi nowotwór oraz jego potencjalnej złośliwości.
ciwko erytrocytom oraz wykrywania ich wewnątrzkomór- Wskaz
nikiem złośliwości nowotworu są klonalność
kowych pasożytów. Erytrocyty można analizować w peł- i zawartość (ploidia) DNA. Klonalność jest dowodem na
nej krwi pobranej na antykoagulant lub izolować z war- to, że linia komórek białaczkowych pochodzi od poje-
stwy erytrocytów powstałej po wirowaniu krwi całko- dynczej komórki. Pojawienie się dodatkowych pików na
witej. Cytometrię stosuje się często do badania konfliktu histogramie obrazującym zawartość DNA świadczy
serologicznego między matką a płodem. Zwykle stosuje o aneuploidalności i jest wskaz
nikiem procesów nowo-
się do tego celu przeciwciała przeciwko płodowej hemo- tworzenia (21, 30). Różne typy białaczek i chłoniaków
globinie F. Jest to precyzyjny i czuły test, pozwalający charakteryzują się często drobnymi różnicami profilów
odróżnić erytrocyty płodowe od dojrzałych erytrocytów antygenowych, dzięki temu można je rozróżnić za po-
zawierających małą ilość hemoglobiny F (2). mocą cytometrii przepływowej (30). Zastosowanie kli-
1042 Medycyna Wet. 2007, 63 (9)
niczne immunofenotypowania w weterynaryjnej onko- ration time) populacji komórek. Prowadząc hodowle ko-
logii wiąże się z diagnozą psich białaczek i chłoniaków mórkowe lub tkankowe można śledzić stan hodowli po
złośliwych (5) oraz kocich ostrych białaczek mieloidal- zabarwieniu DAPI  sulforodaminą i oranżem akrydyny.
nych i limfoidalnych (30). Dodatkowo cytometria w prze- Nagłe pogorszenie się rozdzielczości histogramu DNA
pływającym strumieniu cieczy umożliwia badanie sku- przy prowadzeniu regularnej kontroli hodowli może
teczności chemioterapii, co udowodniono prowadząc tego
świadczyć o zakażeniu mykoplazmą.
typu analizę limfocytów krwi obwodowej u psów z wie-
Proliferację nowotworów można badać analizując fazę
locentrycznym chłoniakiem, przed leczeniem i po poda-
S cyklu komórkowego. Jeżeli odsetek komórek znajdu-
niu cytostatyków (5). Cytometria umożliwia ponadto
jących się w tej fazie przekroczy kilkanaście procent,
wykrycie choroby resztkowej (MRD  minimal residual
oznacza to wzrost proliferacji. W przypadku np. raka
disease) u pacjentów z ostrymi białaczkami. Dokładność
sutka wzrost liczby komórek w fazie S stanowi samo-
i czułość badania pozwala wykryć nawet pojedyncze ko-
dzielny czynnik rokowniczy. Badając cykl komórkowy
mórki białaczkowe (21).
należy także zwrócić uwagę na antygeny towarzyszące
Kolejne zastosowanie cytometrii przepływowej odno-
proliferacji, takie jak Ki-67 czy PCNA. Istnieje zależ-
si się do charakterystyki antygenowej i ilościowej komó-
ność pomiędzy ich ekspresją a postępem choroby nowo-
rek szpiku kostnego (21). Metoda ta umożliwia m.in.
tworowej. Cytometryczna ocena zawartości DNA jest
określanie liczby różnych komórek szpiku poprzez ich
stosowana także w badaniach cytogenetycznych. Ilość
barwienie dwuoctanem 2 7 -dichlorofluoresceiny, wią-
kwasu nukleinowego ocenia się wtedy w poszczególnych
żącym się preferencyjnie z komórkami zawierającymi
chromosomach przy użyciu odpowiednich fluorochro-
peroksydazę, a następnie analizowanie pod kątem zielo-
mów (np. DAPI czy jodku propidyny). Proliferujące lim-
nej fluorescencji i rozpraszania światła FSC. W ten spo-
focyty można wykryć, znakując je przeciwciałami prze-
sób możliwe jest odróżnienie populacji proliferujących
ciwko receptorowi dla interleukiny 2 (CD25) lub recep-
i dojrzałych komórek mieloidalnych, proliferujących
torowi dla transferyny (CD71). Oba te receptory znaj-
i dojrzałych komórek erytroidalnych oraz megakariocy-
dują się na powierzchni zaktywowanych limfocytów.
tów. Możliwe jest także analizowanie nie barwionych
Można także wykorzystać fakt, że proliferujące komórki
próbek szpiku, przy którym, bazując na stopniu rozpra-
wbudowują analog tymidyny  bromodezoksyurydynę
szania światła FSC i SSC, identyfikuje się segmentowa-
(BrdU), którą można wykryć za pomocą przeciwciał anty-
ne neutrofile, metamielocyty, niedojrzałe komórki mie-
-BrdU (2).
loidalne i erytroidalne oraz dojrzałe komórki erytroidal-
ne. Jodek propidyny, jak również bromodeoksyurydyna
Ocena parametrów nasienia
są wykorzystywane dodatkowo do określania aktyw-
Badanie jakości nasienia polega zwykle na wykrywa-
ności proliferacyjnej szpiku (21).
niu nieprawidłowej struktury chromatyny plemników.
Jedną z największych zalet cytometrii przepływowej
DNA znakuje się oranżem akrydyny (AO). Barwnik ten,
jest możliwość przy braku dostępu do guza pobrania
łącząc się z DNA dwuniciowym, daje zieloną fluorescen-
i badania komórek z wtórnego z
ródła zmiany chorobo-
cję, natomiast w połączeniu z jednoniciowym DNA świe-
wej np. płynu opłucnowego czy otrzewnowego (10). Je-
ci na czerwono. Zwiększona liczba komórek o czerwo-
żeli badana jest tkanka lita, komórki muszą zostać rozbi-
nej fluorescencji świadczy o nieprawidłowej strukturze
te mechanicznie lub enzymatycznie. Metodę enzymatycz-
chromatyny plemników. Plemniki można także znako-
ną stosuje się wówczas, jeżeli materiał guza zawiera wiele
wać rodaminą 123 i jodkiem propidyny PI, dzięki czemu
martwych komórek, dużą ilość podścieliska lub zwłók-
wykrywa się zmiany w potencjale błony mitochondrial-
nienia. Świeżo pobrany materiał z guza powinien być
nej, a co za tym idzie  ruchliwości plemników. Czerwo-
transportowany i przechowywany w specjalnym podło-
na fluorescencja pochodząca od PI świadczy o dużej licz-
żu (nie w formalinie) w temperaturze 4�C. Materiał prze-
bie martwych komórek, natomiast intensywna zielona
znaczony do badania powinien zawierać jak najwięcej
fluorescencja jest wskaz
nikiem żywotności i dużej ruch-
interesującej nas tkanki, natomiast jak najmniej tkanki
liwości plemników. Wyniki oceny żywotności plemni-
tłuszczowej, włóknistej, naczyń krwionośnych (warstwy
ków w nasieniu ogierów z zastosowaniem cytomerii prze-
naczyniowej) i komórek nekrotycznych (10).
pływowej oraz innych metod były porównywalne. Za po-
Ocena proliferacji komórek
mocą cytometrii badano żywotność i integralność akro-
somu psich plemników oraz żywotność i integralność
Cytometrię przepływową wykorzystuje się z powodze-
błony komórkowej plemników knura (25). Dzięki tech-
niem do scharakteryzowania cyklu komórkowego róż-
nikom cytometrycznym wykrywa się w ludzkim nasie-
nych rodzajów komórek w hodowlach. Zastosowanie
niu komórki takie, jak leukocyty czy komórki prostaty,
w tej metodzie barwienia z użyciem jodku propidyny
co jest pomocne we wcześniejszym wykryciu raka pro-
umożliwiło obliczenie procentu komórek znajdujących
staty (24). Cytometria umożliwia ponadto określenie nie-
się w fazie G0/G1, S i G2/M. Do badania cyklu często
wielkich różnic w zawartości DNA w plemnikach niosą-
stosuje się oznaczanie zawartości DNA po jego kwaśnej
denaturacji. Po dodaniu do hodowli substancji blokują- cych chromosomy X i Y. Plemniki zawierające chromo-
som X lub Y sortuje się za pomocą specjalnego typu cy-
cej komórki w fazie M, np. winblastyny i określeniu
indeksu mitotycznego (liczby komórek będących w trak- tometrów wyposażonych w sortery komórkowe, dzięki
temu możliwa jest regulacja płci zwierząt hodowlanych
cie podziału mitotycznego) w różnym czasie po dodaniu
tej substancji, możemy obliczyć czas podwojenia (gene- (1, 22).
Medycyna Wet. 2007, 63 (9) 1043
z tych zmian jest tzw.  paraliż immunologiczny , który
Badanie apoptozy
jest spowodowany utratą przez monocyty krwi antygenu
Apoptoza jest czynnym procesem, który przyczynia się
HLA-DR. Zmiany ekspresji tego antygenu możemy śle-
do regulacji liczby komórek w organizmie. Zachwianie
dzić dzięki cytometrii przepływowej (33).
równowagi między proliferacją komórek a ich śmiercią
Za pomocą cytometrii można także badać oddziały-
prowadzi do powstania licznych schorzeń. W komórkach
wanie wirusa z komórką, określając ekspresję wybranych
apoptotycznych następują zmiany składu fosfolipidów
antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych
w błonie zewnętrznej komórki  pojawia się tam, prze-
komórki, z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych.
niesiona z części wewnętrznej błony fosfatydyloseryna.
Analizując fenotypy komórek zakażonych wirusem moż-
Do jej wykrycia stosuje się aneksynę V związaną che-
na monitorować przebieg zakażenia i określać jego ro-
micznie z barwnikiem fluorescencyjnym (najczęściej
kowania (18). Za pomocą tej metody śledzono stan cho-
FITC). Równocześnie wybarwia się komórki jodkiem
rych zakażonych wirusem HIV (20). W diagnostyce we-
propidyny, który pozwala ocenić integralność błony ko-
terynaryjnej cytometrię przepływową stosowano między
mórkowej. Następnie bada się fluorescencję za pomocą
innymi do oceny progresji infekcji kocimi wirusami FIV
cytometru. Komórki żywe nie barwią się żadnym odczyn-
i FeLV (19), wirusami białaczki bydła, wirusem BIV
nikiem, komórki nekrotyczne barwią się jodkiem propi-
i BLAD (wrodzonym zespołem niedoboru leukocytar-
dyny, a komórki apoptotyczne barwią się w różnym stop-
nych cząstek adhezyjnych). Analizowano komórki od-
niu aneksyną V. Komórki barwiące się jednocześnie anek-
pornościowe we krwi owiec w przebiegu doświadczal-
syną V i jodkiem propidyny znajdują się w póz
nym sta-
nego zakażenia wirusem BIV (12) oraz wykrywano
dium apoptozy (28).
zakażenia wirusem zapalenia tętnic koni w nasieniu ogie-
Apoptozę można także badać, wykrywając pęknięcia
rów (4). Badano także zmiany w subpopulacjach limfo-
łańcucha DNA w komórkach apoptotycznych. W tym celu
cytów u kurcząt zakażonych Salmonella enteritidis (32).
stosuje się trifosforan deoksyurydyny (dUTP) lub bro-
Cytometrię przepływową można zaadaptować także do
modeoksyurydyny (Br-dUTP) sprzężony z fluoresceiną
bezpośredniej wieloparametrowej analizy mikroorganiz-
lub digoksygeniną, który przy użyciu enzymów, takich
mów, jednak ze względu na to, że różnią się one od orga-
jak terminalna transferaza czy polimeraza DNA jest
nizmów eukariotycznych, niezbędna jest modyfikacja
wbudowywany w miejscach pęknięć łańcucha DNA.
standardowych procedur wykorzystywanych do charak-
Fluorescencja Br-dUTP połączonego z kwasem nuklei-
teryzowania komórek zwierzęcych. Barwienie barwni-
nowym jest następnie mierzona cytometrycznie. Jest ona
kiem fluorescencyjnym  bromkiem etydyny (BE) po-
proporcjonalna do liczby pęknięć łańcucha DNA. Ten
zwala także na wykrycie bakterii w płynach fizjologicz-
sposób badania apoptozy zwany jest metodą TUNEL (28).
nych, takich jak: żółć, wydzieliny ropne z ran, płyn suro-
Za pomocą cytometrii przepływowej możliwe jest ba-
wiczy oraz wydzieliny oskrzelowe (33).
danie aktywacji kaspaz (proteinaz cysteinowych)  en-
Cytometria znajduje zastosowanie w bezpośrednim
zymów, które są obecne w komórkach apoptotycznych.
badaniu komórek bakteryjnych do zliczania i wykrywa-
Najczęściej wykrywa się kaspazę 3, stosując komercyj-
nia określonych gatunków bakterii w populacjach mie-
ne zestawy odczynników (kity), które zawierają substra-
szanych, np. Legionella pneumophila w wieżach chłod-
ty fluorescencyjne, rozszczepiane przez kaspazę.
niczych (9), Listeria monocytogenes w mleku (3), Esche-
Ocena apoptozy może mieć znaczenie w zrozumieniu
richia coli O157:H7 w zanieczyszczonym mięsie (14)
przebiegu wielu chorób zwierząt i człowieka (choroby
oraz subpopulacji bakterii w produktach probiotycznych
nowotworowe, autoagresja, choroby neurodegeneracyj-
(probiotykach) i produktach mlecznych (3).
ne i infekcyjne). W badaniach klinicznych za pomocą
Cytometrię można także wykorzystać w badaniach
cytometrii oznaczano spontaniczną i indukowaną apop-
serologicznych. Za jej pomocą wykrywano przeciwciała
tozę limfocytów w przebiegu infekcji wirusem HIV
przeciwko Yersinia pestis w surowicach pobranych od
u ludzi (20) oraz apoptozę w przebiegu infekcji wirusem
chorych na dżumę pacjentów. Możliwa jest także detek-
niedoboru odporności u kotów (FIV) (19). Badano także
cja przetrwalników (spor) bakteryjnych np. Bacillus an-
apoptozę leukocytów u bydła (27), trzody chlewnej (29),
thracis (26).
kotów (8, 19) i psów (34). Porównywano proces apopto-
Metoda cytometrii przepływowej znajduje także za-
zy zdrowych i zainfekowanych wirusem Panleukopenia
stosowanie w testowaniu wrażliwości bakterii na anty-
limfocytów kotów (8). U trzody chlewnej oznaczano
biotyki. Do detekcji martwych komórek bakterii stosuje
apoptozę zainfekowanych wirusem choroby Aujesz-
się barwniki wiążące się z DNA, np. jodek propidyny,
ky ego leukocytów krwi obwodowej (29). Ponadto ba-
oraz barwniki wiążące się z DNA i RNA, takie jak SYTO-
dano apoptozę kocich, mysich i szczurzych tymocytów
-13 czy SYTO-17. Barwienie komórek oranżem akrydy-
(34).
ny pozwala ocenić zmiany integralności błony komórko-
wej wskutek działania antybiotyków (33).
Diagnostyka i patogeneza zakażeń bakteryjnych
Cytometria przepływowa została z powodzeniem za-
i wirusowych
stosowana do detekcji wirusów z rodzin Baculoviridae,
Przy użyciu cytometrii przepływowej zakażenia bak- Herpesviridae, Myoviridae, Phycodnaviridae, Picorna-
teryjne i wirusowe można badać bezpośrednio bądz
po- viridae, Podoviridae, Retroviridae i Siphoviridae. Kwa-
średnio, monitorując zmiany, jakie zachodzą w układzie sy nukleinowe wirusów barwiono używając takich barw-
immunologicznym. W wyniku zakażenia bakteryjnego ników, jak: SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen,
następują duże zmiany w komórkach obronnych. Jedną PicoGreen, YO-PRO oraz YOYO-1. Prowadzone są także
1044 Medycyna Wet. 2007, 63 (9)
tlenowego granulocytów krwi obwodowej królików z przewlekłą trichofi-
badania leków antywirusowych przeciwko ludzkiemu
tozą. Medycyna Wet. 2006, 62, 423-426.
wirusowi niedoboru odporności (HIV), wirusowi cyto-
12.Kozaczyńska B., Bicka L., Kuz
mak J., Winnicka A.: Analiza komórek odpor-
megalii oraz wirusom opryszczki (HSV) (17, 18).
nościowych krwi owiec w przebiegu doświadczalnego zakażenia wirusem
(BIV). Medycyna Wet. 2001, 57, 129-134.
Oznaczanie poziomu cytokin
13.Krakowski L., Kostro K., Wrona Z., Krakowska I., Brodzki P., Piech T.,
Kostrzewa A.: Metabolizm tlenowy neutrofilów i monocytów krwi w okresie
Cytokiny są nośnikami informacji między układem
okołoporodowym u krów zdrowych i z zatrzymaniem łożyska. Medycyna
odpornościowym a nerwowym i hormonalnym. Popula-
Wet. 2004, 60, 1080-1083.
cje limfocytów produkują określone, specyficzne tylko
14.Kusunoki H., Bari M. L., Kita T., Sugii S., Uemura T.: Flow cytometry for the
dla nich zestawy cytokin. W trakcie procesów chorobo-
detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with latex beads
wych synteza cytokin może być zaburzona, więc anali-
sensitized with specific antibody. J. Vet. Med. B. 2000, 47, 551-559.
zując ich ekspresję możemy wnioskować o stanie funk- 15.Lisiecka U., Kostro K., Jarosz A
.: Cytometria przepływowa jako nowoczesna
metoda w diagnostyce i prognozowaniu chorób. Medycyna Wet. 2006, 62,
cjonalnym układu odpornościowego.
998-1001.
Cytometria przepływowa umożliwia oznaczanie róż-
16.Maino V. C.: Rapid assessment of antigen induced cytokine expression in
nych cytokin produkowanych przez odrębne populacje
memory T cells by flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1998, 63,
komórek, a także zestawów cytokin produkowanych
199-207.
przez pojedynczą komórkę. Po 4-6-godzinnej inkubacji 17.Marie D., Vaulot D., Partensky F.: Application of the novel nucleic acid dyes
YOYO-1, YO-PRO and PicoGreen for flow cytometric analysis of marine
z czynnikiem stymulującym, wewnątrzkomórkowe cy-
prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, 1649-1655.
tokiny znakuje się przeciwciałami połączonymi z fluoro-
18.McSharry J. J.: Analysis of virus-infected cells by flow cytometry. Methods
chromem (16). Zazwyczaj stosuje się stymulatory poli-
2000, 21, 249-257.
klonalne, takie jak: lektyny, konkanawalina A (ConA),
19.Momoi Y., Mizuno T., Nishimura Y., Endo Y., Ohno K., Watari T., Goitsu-
estry forbolu (PMA), jonomycyna, niektóre przeciwcia- ka R., Tsujimoto H., Hasegawa A.: Detection of apoptosis induced in peri-
ła monoklonalne i superantygeny (7). Aby syntetyzowa- pheral blood lymphocytes from cats infected with feline immunodeficiency
virus. Arch Virol. 1996, 141, 1651-1659.
ne cytokiny nie były wydzielane na zewnątrz komórki,
20.Owens M. A., Loken M. R.: Flow cytometry principles for clinical laboratory
stosuje się inhibitory transportu białek, takie jak brefel-
practice. Quality assurance for quantitative immunophenotyping. Wiley-Liss,
dyna A czy monensyna (7, 16).
Inc. 1995.
Badanie cytokin wewnątrzkomórkowych może stano- 21.Pietruczuk M.: Cytometria przepływowa w diagnostyce laboratoryjnej. Diag-
wić pomoc w diagnostyce zakażeń bakteryjnych, wiru- nosta laboratoryjny 2004, 4, 8-10.
22.Pena A. I., Quintela L. A., Herradon P. G.: Flow cytometric assesment of
sowych, pasożytniczych, chorób nowotworowych, auto-
acrosomal status and viability of dog spermatozooa. Reprod. Dom. Anim.
immunizacyjnych, alergicznych i niedoborów odpornoś-
1999, 34, 495-502.
ci. Stosuje się je obecnie przy różnicowaniu limfocytów.
23.Riber U., Lind P.: Interaction between Salmonella typhimurium and phago-
Na przykład, jedyną różnicą między subpopulacjami Th1
cytic cells in pigs. Phagocytosis, oxidative burst and killing in polymorpho-
i Th2 jest spektrum wydzielanych cytokin (7). W przy- nuclear leukocytes and monocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 67,
259-270.
szłości badanie cytokin może znalez
ć zastosowanie
24.Ricci G., Presani G., Guaschino S., Simeone R., Perticarari S.: Leukocyte
w monitorowaniu działania leków i innych środków te-
detection in human semen using flow cytometry. 2000. Human Reprod. 15,
rapeutycznych in vivo (7, 16).
1329-1337.
25.Siemieniuch M., Bielas W., Dubiel A., Zbyryt I., Chorbiński P.: Ocena
PiS
miennictwo
żywotności i integralności błon komórkowych plemników knura w nasieniu
świeżym i mrożonym. Medycyna Wet. 2005, 61, 184-187.
1.Bochenek M., Smorąg Z.: Regulacja płci u bydła poprzez separację plemni-
26.Stopa P. J.: The flow cytometry of Bacillus anthracis spores revisited. Cyto-
ków X i Y  wstępne wyniki badań. Medycyna Wet. 2005, 61, 50-52.
2.Brown M., Wittwer C.: Flow cytometry: principles and clinical applications metry 2000, 41, 237-244.
in hematology. Clin. Chem. 2000, 46, 1221-1229. 27.Van Oostveldt K., Dosogne H., Burvenich C., Paape M. J., Brochez V., Van
3.Bunthof Ch. J., Abee T.: Development of a flow cytometric method to analyze
den Eeckhout E.: Flow cytometric procedure to detect apoptosis of bovine
subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters App.
polymorphonuclear leukocytes in blood. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999,
Environment. Microbiol. 2002, 68, 2934-2942.
70, 125-133.
4.Cierpisz J., Golnik W., Laskowska A., Ugorski M.: Wykrywanie zakażeń
28.Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C.: A novel
wirusem zapalenia tętnic koni w nasieniu ogierów metodą cytometrii prze-
assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expres-
pływowej. Medycyna Wet. 1998, 54, 626-627.
sion on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J. Immu-
5.Culmsee K, Simon D, Mischke R, Nolte I.: Possibilities of flow cytometric
nol. Methods 1995, 184, 39-51.
analysis for immunophenotypic characterization of canine lymphoma. J. Vet.
29.Wang F. I., Pang V. F., Hahn E. C.: Flow cytometric analysis of porcine
Med. A. 2001, 48, 199-206.
peripheral blood leukocytes infected with pseudorabies virus. J. Leuk. Biol.
6.De Guise S., Flipo D., Boehm J. R., Martineau D., Beland P., Fournier M.:
1988, 43, 256-264.
Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): Evaluation of
30.Weiss D. J.: Application of flow cytometric techniques to veterinary clinical
phagocytosis and respiratory burst with peripheral blood leukocytes using
hematology. Vet. Clin. Pathol. 2002, 31, 72-74.
flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1995, 47, 351-362.
31.Weiss D. J., Townsend E.: Evaluation of reticulated platelets in dogs. Comp.
7.Drela N.: Wykrywanie wewnątrzkomórkowych cytokin metodą cytometrii
Haematol. Int. 1998, 8, 166-170.
przepływowej  zastosowanie i problemy. Post. Biol. Kom. 2001, 28, 129-
32.Wieliczko A., Kuczkowski M., Mazurkiewicz M.: Zachowanie się subpopu-
-146.
lacji limfocytów T CD3+, CD4+ i CD8+ u kurcząt w przebiegu zakażenia
8.Ikeda Y., Shinozuka J., Miyazawa T., Kurosawa K., Izumiya Y., Nishimura Y.,
Salmonella enteritidis. Medycyna Wet. 2002, 58, 527-530.
Nakamura K., Cai J., Fujita K., Doi K., Mikami T.: Apoptosis in feline
panleukopenia virus-infected lymphocytes. J. Virol. 1998, 72, 6932-6936. 33.Woz
niak-Kosek A., Reiss J., Kawiak J.: Cytometria przepływowa w klinicz-
9.Ingram M., Cleary T. J., Price B. J., Castro A.: Rapid detection of Legionella nych analizach bakteriologicznych. Post. Mikrobiol. 2003, 42, 235-254.
pneumophila by flow cytometry. Cytometry 1982, 3, 134-147.
34.Zeman K.: Wykorzystanie cytometrii przepływowej do badań granulocytów
10.Iwaszkiewicz-Pawłowska A., Hołownia A.: Cytometria przepływowa  przy-
obojętnochłonnych. Materiały z I Konferencji szkoleniowej nt. Przeciwciała
datność diagnostyczna, lecznicza i rokownicza w litych guzach. Pol. Mer.
monoklonalne w immunologii i diagnostyce. Puławy 1995, s. 99-117.
Lek. 1999, 6, 104-106.
11.Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Leśniewska K., Madany J., Majer- Adres autora: mgr Urszula Lisiecka, ul. Krasińskiego 12/100, 20-709
-Dziedzic B.: Cytometryczna ocena aktywności fagocytarnej i metabolizmu Lublin; e-mail: [e-mail]