Miętkiewski,  Kurs fizjologii doświadczalnej , rozdział 5   Krew (fragmenty)
3 A Oznaczanie liczby krwinek czerwonych i białych za pomocą komory B�rkera
Mieszalniki Potaina słu\
ą do rozcieńczania krwi odpowiednim płynem, aby przez to ułatwić liczenie
krwinek, które nie rozcieńczone le\
ałyby za gęsto w polu widzenia.
Mieszalnik do krwinek czerwonych jest to grubościenna rurką włosowata z podziałkami 0,5 i 1, rozdęta
w banieczkę, zakończona krótszą rurką, na którą nakłada się wę\
yk z ustnikiem. Na tej rurce jest podziałka 101.
W banieczce znajduje się ruchoma szklana perełka. Objętość banieczki jest 100 razy większa od pojemności
kapilary do podziałki 1, a 200 razy większa od objętości kapilary do podziałki 0,5. Mieszalnik Potaina do
białych ciałek jest zbudowany analogicznie, tylko objętość banieczki jest 10-krotną objętością kapilary do
podziałki 1 i 20-krotną tej\
e do podziałki 0,5.
Płyn Hayema składa się z 0,25 g HgCl2 + 0,5 g NaCl + 2,5 g Na2SO4 + H2O od 100 ml słu\
y do
rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek czerwonych. Mo\
e go zastąpić wodny roztwór 2  3 % NaCl (342,2
 523,2 mmol/l); chodzi o to, \
eby taki płyn nie wywoływał ubytku czerwonych krwinek przez hemolizę, nie
pozwalał na układanie się krwinek w ruloniki i nadawał im wyraz
ne zarysy.
Płyn T�rka składa się z lodowatego kwasu octowego 3,0 ml + 1 % (10 g/l) roztworu filetu goryczki
1,0 ml + wody destylowanej do 100 ml. Słu\
y on do rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek białych. Kwas
octowy hemolizuje erytrocyty, które by przeszkadzały w liczeniu leukocytów oraz powoduje pęcznienie jąder
krwinek białych, przez co komórki te staja się bardziej widoczne. Fiolet goryczki barwi jądra leukocytów na
niebiesko i czyni je wyraz
niejszymi w polu widzenia.
Stolik B�rkera jest to prostokątna płytka szklana tak wyszlifowana, \
e w środku długości przebiega
przez nią w poprzek wąska płytka, która znów w środku swojej długości bywa przepołowiona rowkiem,
biegnącym równolegle do długiego boku stolika. Bo obu stronach bloczka biegną analogiczne do niego, ale nie
przepołowione i o 0,1 mm wy\
sze płytki. Po nasunięciu szkiełka nakrywkowego na płytki stolik zamienia się w
komorę o wysokości 0,1 mm. Na ka\
dej połówce bloczka, po obu stronach rowka, znajduje się siatka Thoma lub
B�rkera.
Siatka B�rkera składa się z podwójnych linii oddalonych od siebie o 1/20 mm i przecinających się pod
kątem prostym. W miejsc tego przecięcia powstają najmniejsze kwadraty x, o boku 1/20 mm i powierzchni
1/400 mm2. Ka\
da para linii jest oddzielona od drugiej pary o 1/5 mm. Między liniami podwójnymi są zawarte
du\
e kwadraty y, o boku 1/5 mm i powierzchni 1/25 mm2. Wreszcie ci pięć du\
ych kwadratów podwójne linie są
rozdzielone trzecią. W ten sposób powstają największe kwadraty, ograniczone liniami potrójnymi, a zawierające
po 16 średnich kwadratów y do liczenia krwinek białych i po 9 kwadratów najmniejszych x do liczenia krwinek
czerwonych.
(...)
Do jednego szkiełka zegarkowego nalewa się około 3 ml płynu Hayema lub 2  3 % roztworu NaCl, do
drugiego taką samą ilość płynu T�rka.
Przed nakłuciem badany powinien umyć ręce w ciepłej wodzie, co przyczyni się nie tylko do ich
odka\
enia, ale spowoduje czynne przekrwienie, a to z kolei ułatwi obfitszy wypływ krwi z miejsca nakłucia bez
niepo\
ądanego wyciskania czy masowania palca. Pierwszą kroplę krwi ścieramy suchą i jałową watą, gdy\
mo\
e
jeszcze zawierać resztki środka u\
ytego do odka\
enia skóry. Do następnej kropli przystawiamy wylot kapilary
mieszalnika, trzymanego poziomo w prawej ręce. Aspirując bardzo ostro\
nie wciągamy krew do podziałki 0,5.
Gdy przewidujemy bardzo małą ilość krwinek czerwonych, wciągamy krew do podziałki 1. Koniec mieszalnika
wyciera się od zewnątrz i sprawdza, czy słupek krwi w kapilarze jest ciągły, czy nie zawiera pęcherzyków
powietrza oraz czy dokładnie sięga podziałki 0,5 lub 1. Gdy nieznacznie przewy\
sza podziałkę, odciągamy
nadmiar krwi przez lekkie dotykanie wylotu kapilary kawałkiem suchej ligniny lub waty. Bardzo ostro\
nie
aspirując przez ustnik, zanurzamy wylot kapilary w płynie Hayema i aspirujemy nieco silniej, aby uzupełnić
wnętrze mieszalnika do podziałki 101, zmieniając powoli jego poło\
enie z ukośnego na pionowe. Mieszalnik
chwytamy następnie tak, \
eby kciuk zaciskał przez gumę załamanego wę\
yka górny, a palec środowy  dolny
jego wylot. Przez kilka minut nale\
y ostro\
nie potrząsać mieszalnikiem, \
eby za pomocą ruchomej perełki
jednolicie wymieszać krew z płynem Hayema. Mieszalnik powinno się trzymać w palcach poziomo, a ruchy
wstrząsające wykonywać w kierunku pionowym.
Podobnie pobieramy krew do liczenia krwinek białych, z tą tylko ró\
nicą, \
e u\
ywamy mieszalnika z
podziałkami 0,5, 1 i 11 i po nabraniu krwi do podziałki 1 dopełniamy go płynem T�rka.
Na bardzo czysty stolik B�rkera nasuwamy szkiełko nakrywkowe w ten sposób, aby między nim a
bloczkiem powstał srebrzysty połysk lub pojedynczy barwny pierścień Newtona. Komorę kładziemy na stolik
mikroskopu i w małym powiększeniu oraz wąskiej przesłonie nastawiamy ostry obraz siatki. Po ponownym
wstrząśnięciu mieszalnika wypuszczamy 2 pierwsze krople, nie nadające się do liczenia, a następnie mała kroplę
umieszczamy na bloczku, tu\
obok krawędzi szkiełka nakrywkowego. Krew wnika do komory siłą
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Created by Neevia Document Converter trial version
włosowatości. Krwinki czerwone rozmieszczają się na siatce przewa\
nie równomiernie. Nale\
y chwilę
zaczekać, a\
krwinki opadną na no komory i ruch ich ustanie.
Krwinki czerwone liczymy w 80 małych kwadratach. Je\
eli liczba krwinek w poszczególnych
kwadratach jest bardzo ró\
na, dalsze obliczanie jest bezcelowe, gdy\
świadczy o niedokładnym wymieszaniu i
rozmieszczeniu krwi, co mo\
e być przyczyną bardzo du\
ego błędu. W tym wypadku trzeba doświadczenie
powtórzyć z większą dokładnością. Otrzymaną sumę dzielimy przez liczbę kwadratów, aby znalez
ć średnią na
jeden kwadrat. Znalez
liśmy np. 480 krwinek w 80 kwadratach, wówczas w jednym kwadracie mamy średnio 6, a
w 1 ul krwi 4800000 krwinek czerwonych, gdy\
6 (średnia na 1 kwadrat) x 4000 (objętość) x 200
(rozcieńczenie) = 4800000 (4,8 T/l).
Aby unikać podwójnego liczenia niektórych krwinek, liczymy tylko te które le\
ą wewnątrz kwadratu,
nie dotykając \
adnego boku i wszystkie, które dotykają lewego i górnego boku, choćby le\
ały poza tym
kwadratem. Nie liczmy natomiast krwinek, które dotykają prawego i dolnego boku, choćby le\
ały wewnątrz
kwadratu.
Krwinki białe liczymy tak samo, tylko we właściwych kwadratach, którym odpowiada objętość
1/250 mm3. Nale\
y przeliczyć jak największą liczbę kwadratów, np. 125, a średnią pomno\
yć 250, gdy\

objętość graniastosłupa o podstawie du\
ego kwadratu = 1/250 mm3 oraz przez 10 lub 20, jak rozcieńczona była
krew w mieszalniku. Znalez
liśmy np. 375 białych krwinek w 125 du\
ych kwadratach, wtedy średnia na jeden
kwadrat wynosi 3. W 1 ul krwi mamy 7500 krwinek białych, gdy\
3 (średnia na kwadrat) x 250(objętość) x 10
(rozcieńczenie) = 7500 (7,5 G/l).
(...)
4 Oglądanie i liczenie krwinek płytkowych
Krwinki płytkowe, trombocyty albo płytki krwi Bizzozera, stanowią twory z większością cech \
ywej
komórki, które jednak nie mają jądra, bardzo łatwo zlepiają się i rozpadają. Są one przeciętnie 2  3 razy
mniejsze od krwinek czerwonych, płaskie, ró\
nokształtne z wypustkami i silnie załamują światło. W krą\
ącej
krwi mają zwykle kształt wrzecionowaty. Według niektórych autorów liczba płytek waha się od 700 do 800
tysięcy w 1 ul krwi. Najczęściej w klinikach stosowana metoda pośrednia obliczania płytek według Fonio daje
jednak wyniki daleko ni\
sze (średnio 250 tys.), dopuszczając wahania od 130 do 350 tys. w 1 ul (130  350 G/l).
Płytki Bizzozera mo\
na oglądać w zabarwionym preparacie krwi oaz nie zabarwione we krwi
wynaczynionej albo w krą\
ącej. Płytki krwi licz się bezpośrednio, podobnie jak krwinki białe lub czerwone albo
pośrednio  w zabarwionym preparacie odpowiednio przygotowanego rozmazu krwi.
Do oglądania płytek w nie zabarwionym preparacie krwi wynaczynionej potrzebne są: ostrza do
nakłuwania skory, bardzo dokładnie oczyszczone szkiełko podstawowe i nakrywkowe, bloczek parafinowy,
jałowy roztwór 14 % siarczanu magnezowego (567,9 mmol/l), klosz szklany lub zlewka, środek odka\
ający i
mikroskop.
Po zupełnym wyparowaniu lotnego środka odka\
ającego umieszcza się na opuszce palca kroplę
jałowego roztworu siarczan magnezu i poprzez nią nakłuwa się skorę. Wypływającą ze skaleczeni krew miesza
się z roztworem siarczanu magnezu, który w du\
ym stopniu przyczynia się do utrwalenia płytek krwi, chroni je
przed rozpadem i układaniem się w większe skupiska, a osocze przed skrzepnięciem. Nie mając pewności, czy
roztwór siarczanu magnezowego jest jałowy, nie wolno poprzez taką kroplę nakłuwać palca. Kroplę siarczanu
mo\
na te\
w tym wypadku od raz umieścić na bloczku parafinowym, a małą ilość krwi wypływającą z nakłucia
przenieść do tego roztworu i natychmiast dokładnie wymieszać pałeczką szklaną, powleczoną cienką warstewka
parafiny lub silikonu.
Kroplę krwi zmieszanej z siarczanem magnezowym puszczamy na czystą i gładka powierzchnię
bloczka parafinowego. Nakrywamy go odwróconą zlewką, pod którą kładziemy trochę waty moczonej w wodzie
w celu nawilgotnienia komory. Komorę chronioną przed parowaniem pozostawiamy przez 20 min, \
eby na
górnej powierzchni zebrało się rozcieńczone osocze, zawierające większą liczbę płytek; cię\
sze bowiem
pozostałe elementy postaciowe krwi szybko opadają ku podstawie.
Wtedy ostro\
nie dotyka się środkiem powierzchni szkiełka podstawowego górnej warstwy kropli.
Zebrany ślad osocz nakrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda przez mikroskop, nastawiając ostrość na
nieliczne erytrocyty, ułatwiające orientacje w polu widzenia. Większa liczba krwinek czerwonych jest w tym
preparacie niepo\
ądana, gdy\
zaciemnia pole widzenia utrudnia wyszukanie płytek krwi.
Aby policzyć krwinki płytkowe w sposób pośredni, nale\
y najpierw przygotować rozmaz krwi
spływającej do kropli siarczanu magnezowego i dobrze wysuszyć go w powietrzu. Rozmaz barwi się nastepnie
według Pappenheima barwnikiem May-Gr�nwalda i Giemsy. Barwienie roztworem Giemsy trzeba jednak
prawie dwukrotnie przedłu\
yć, gdy\
barwnik ten słabiej działa wobec siarczanu magnezowego.
Po ustaleniu liczby erytrocytów w sposób opisany w poprzednim rozdziale liczy się w zabarwionym
preparacie krwinki czerwone i płytki krwi przypadające na ka\
de pole widzenia, u\
ywając okularu z przesłoną o
bardzo małym otworze. Wyniki zapisuje się w oddzielnych kolumnach, az liczba napotkanych erytrocytów
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
będzie wynosiła 1000, a zauwa\
onych równocześnie krwinek płytkowych x. Znając stosunek liczby płytek do
erytrocytów oraz liczbę krwinek czerwonych w 1 ul łatwo ju\
mo\
na obliczyć ile krwinek płytkowych przypada
na 1 ul krwi wziętej do badania.
Jeden ze sposobów bezpośredniego liczenia płytek krwi polega na tym, \
e w mieszalniku Potaina do
krwinek białych naciąga asie krew do podziałki 0,5 i do podziałki 11 uzupełnia płynem, który barwi płytki krwi,
rozpuszcza znaczną część krwinek czerwonych i zapobiega krzepnięciu, przez co umo\
liwia dalsze
postępowanie, opisane w rozdziale o liczeniu krwinek białych. Mo\
e to być np. płyn wersenianowy o składzie:
wersenianu sodowego 1,0, NaCl 0,7 i wody destylowanej  podbarwionej 1 kroplą alkoholowego roztworu
eozyny  do 100 ml.
5 Pomiar względnej objętości krwinek czerwonych hematokrytem Hedina i w heparynowanych rurkach nie
kalibrowanych
Odsetkową objętość zajmowaną we krwi przez erytrocyty mo\
na ustalić wirując nie krzepnącą krew w
kalibrowanych rurkach szklanych. Cię\
sze krwinki zgromadzą się w dalszym końcu rurki, a l\
ejsze osocze
pozostanie bli\
ej osi obrotu. Gdy cała rurka podzielona jest na równe 100 części, wystarczy po ukończonym
wirowaniu odczytać podziałkę na granicy między osoczem i krwinkami czerwonymi, aby mieć gotowy wynik
badania. Urządzenia do tego celu są ró\
ne, a nazywają się hematokrytami.
Hematokryt Hedina składa się z dwu grubościennych włosowatych rurek szklanych, podzielonych na
całej przestrzeni na 100 równych odcinków, które po napełnieniu krwią umieszcza się w oprawie pasującej o
wirówki i uniemo\
liwiającej wyciekanie krwi z rurek.
Na oczyszczonej opuszce palca umieszcza się odrobinę sproszkowanego szczawianu amonowego i
potasowego lub pozwala wyschnąć 1 kropli 4 % roztworu wersenianu sodowego (40 g / l) bądz
1 kropli 10-
krotnie rozcieńczonej heparyny, z którymi miesza się du\
ą kroplę krwi wydobywającą się po nakłuciu. Mo\
na
u\
ywać heparynowanej krwi \
ylnej lub krew z miejsca nakłucia wciągać do heparynowanych rurek
hematokrytowych.
Krew nabiera się siłą włosowatości do obu rurek pod podziałkę 100. Rurki osusza się od zewnątrz i
szczelnie umieszcza w oprawie kierując je zerowymi podziałkami na zewnątrz w stosunku do osi obrotu.
Mo\
na u\
yć heparynowanych rurek nie kalibrowanych, np. o wymiarach: długość 90 mm, średnica
zewnętrzna 5 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm. Wtedy z miejsca nakłucia krew wnika do pochylonej rurki na
przestrzeni około 70 mm. Nie napełniony krwią przeciwległy koniec rurki zakleja się szczelnie roztopionym
lakiem. Rurki takie po zabezpieczeniu przed stłuczeniem wiruje się w zwykłym naczyniu wirówkowym, np. w
ciągu 30 min z szybkością 4000 obr. / min. Wynik odczytuje się za pomocą specjalnego wykresu bądz
te\

zwykła podziałką milimetrową mierzy się długość słupków erytrocytów i osocza, obliczając, jaki procent całej
długości stanowią same erytrocyty.
Wyniki w du\
ej mierze zale\
ą od warunków badania i w zasadzie mo\
na jest porównywać dokładnie
tylko wówczas, gdy zyskano je jednakową metodą przy równym czasie i szybkości wirowania. Zazwyczaj
wiruje się w ciągu 30 min, z szybkością 4000 obr. / min, z siła 2250 g. Wtedy wskaz
nik hematokrytu waha się
od 40 do 48 % (0,4  0,48 l / l).
6 Hemoliza i określenie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych
W prawidłowych warunkach hemoglobina zawarta jest w krwinkach czerwonych. Ich zawiesina w
odpowiednim roztworze jest nieprzezroczysta, a po opadnięciu lub odwirowaniu krwinek roztwór pozostaje
bezbarwny. Czynniki niszczące budowę krwinek czerwonych lub uszkadzające ich półprzepuszczalną błonę,
powodują częściowe lub całkowite przemieszczenie hemoglobiny do roztworu, czyli hemolizę. Czynniki
hemolityczne mo\
na podzielić na fizyczne, chemiczne oraz biologiczne.
Krwinki czerwone mo\
na porównać z małym osmometrem, gdy\
najbardziej zewnętrzna ich warstewka
jako błona półprzepuszczalna pozwala na przenikanie wody z otoczenia do krwinek i na odwrót, ale poza
wyjątkami nie przepuszcza ciał rozpuszczonych. Dlatego te\
jedynie w roztworach izotonicznych krwinki
czerwone nie zmieniają kształtów; w roztworach hipertonicznych natomiast kurczą się i przybierają wygląd
owocu morwy; w roztworach hipotonicznych pęcznieją, wydają się kuliste, większe, a\
wreszcie pękają,
uwalniając hemoglobinę do roztworu, czyli ulęgają hemolizie.
Izotoniczny z krwią ludzką jest taki roztwór, który wywiera ciśnienie osmotyczne około 6,7 atmosfer i
powoduje obni\
enie punktu zamarzania do  0,56oC (272, 59 K). Jednak\
e bywają roztwory izotoniczne, w
których krwinki czerwone pękają podobnie jak w wodzie destylowanej, gdy\
ciało rozpuszczone mo\
e przenikać
do wnętrza krwinki: tu nale\
y przede wszystkim roztwór mocznika, a tak\
e, choć w znacznie mniejszym
stopniu, roztwór glukozy.
Wreszcie rozcieranie krwi z piaskiem, podgrzewanie jej do temperatury powodującej topnienie lipidów
otoczki, naprzemienne zamra\
anie i odmra\
ania, działanie promieni UV i innych o bardzo krótkiej fali oraz
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
elektryczność  nale\
ą do fizycznych czynników hemolitycznych. Krwinki czerwone w roztworze
fizjologicznym o wiele łatwiej podlegają hemolizie ni\
w osoczu lub surowicy. Niewątpliwie działają tu
ochronne koloidy osocza.
Z czynników chemicznych wymienić trzeba rozpuszczalniki ciał tłuszczowych, jak eter, chloroform,
benzyna, które rozpuszczają lipidowe składniki otoczki krwinek i przez to powodują hemolizę. Równie\
kwasy i
zasady w odpowiednich stę\
eniach i temperaturze oraz kwasy \
ółciowe, lecytyna, mydła i saponiny wywołują
hemolizę, gdy\
tak uszkadzają otoczkę, \
e hemoglobina mo\
e wydostawać się poza jej obręb.
Do czynników biologicznych nale\
ą ciała odpornościowe  hemolizyny, które występują we krwi
obcych gatunków jako heterohemolizyny lub nawet jako izohemolizyny we krwi tego samego gatunku.
Podobnie działają toksyny niektórych drobnoustrojów.
Podatność erytrocytów na działanie czynników hemolitycznych zale\
y od weku krwinek, młode są
bardziej wytrzymałe ni\
starsze. Dlatego te\
po znacznych krwotokach, kiedy du\
a liczba młodych krwinek
przenika z narządów krwiotwórczych do obiegu krwi, oporność jest większa. W innych stanach patologicznych,
np. w \
ółtaczce hemolitycznej, krwinki czerwone są bardzo mało oporne.
(...)
A Działanie ró\
nych czynników hemolizujących
W statywie umieszcza się 7 suchych probówek, oznaczonych kolejnymi numerami. Za pomocą czystej i
suchej pipety nalewa się do ka\
dej probówki odpowiednie ilości czynników hemolizujących. Po napełnieniu
wstrząsa się ka\
dą próbówką kilkakrotnie, aby dokładnie wymieszać umieszczone w niej czynniki. Najwcześniej
po 15 min od napełnienia probówek nale\
y ponownie zamieszać ich zawartość i zapoznać się z wynikiem,
oceniając go na oko i za pomocą mikroskopu.
Nie zhemolizowana rozcieńczona krew jest roztworem nieprzezroczystym, gdy\
zawiesina krwinek
czerwonych, wypełnionych hemoglobiną rozprasza światło, nie przepuszczając promieni w przedłu\
eni linii ich
padania. Krew zhemolizowana jest czerwonym roztworem przezroczystym, gdy\
uwolniona hemoglobina po
rozpadzie lub uszkodzeniu erytrocytów przechodzi do roztworu, a cienie krwinek nie zmieniają kierunku
promieni padających.
Aby stwierdzić zmiany mikroskopowe krwinek w powy\
szym doświadczeniu, przygotowuje się
preparaty zawiesiny erytrocytów w płynie hiper-, izo- i hipotonicznym, tzn. 5, 0, 0,9 i 0,6 % roztworze NaCl
(855,5, 154 i 102,6 mmol/l).
W pierwszym preparacie erytrocyty są mocno skurczone i maja kształt owocu morwy, gdy\
dla
wyrównania ró\
nicy stę\
eń tylko woda mo\
e przenikać przez półprzepuszczalną otoczkę z krwinek do roztworu.
Cząsteczki rozpuszczone nie mogą wnikać do wnętrza krwinki.
W drugim preparacie erytrocyty nie zmieniają kształtu ani wielkości, gdy\
stę\
enie cząsteczek
rozpuszczonych w roztworze i wewnątrz krwinki jest jednakowe.
W trzecim preparacie erytrocyty są napęczniałe, powiększone i kuliste, a nawet częściowo ju\

zhemolizowane, gdy\
dla wyrównania stę\
eń woda wnika do wnętrza krwinki, powodując zwiększenie jej
objętości i rozdęcie do formy kulistej. Cząsteczki znajdujące się w większym stę\
eniu w krwince nie mogą
przenikać przez półprzepuszczalną otoczką do roztworu hipotonicznego.
Nr Zawartość probówki Zmiany makro- i mikroskopowe Objaśnienia przyczyn i skutków
1 5 ml 5 % NaCl (855,5 roztwór nieprzezroczysty, krwinki w roztworze hipertonicznym krwinki oddają
mmol/l), 3 krople krwi mają kształt owocu morwy wodę i kurczą się
2 5 ml 0,9 % NaCl (154 roztwór nieprzezroczysty, krwinki w roztworze izotonicznym krwinki nie
mmol/l), 3 krople krwi zachowują kształt prawidłowy ulegają zmianom
3 5 ml 0,6 % NaCl (102,6 roztwór nieprzezroczysty, krwinki w roztworze lekko hipotonicznym krwinki
mmol/l), 3 krople krwi są napęczniałe, kuliste pobierają wodę z otoczenia i pęcznieją, ale
jeszcze nie pękają
4 5 ml wody roztwór przezroczysty, widać w roztworze mocno hipotonicznym krwinki
destylowanej, najwy\
ej cienie krwinek nabrały tyle wody, \
e ich otoczka zupełnie
3 krople krwi pękła i uległy zupełnej hemolizie
5 5 ml 0,9 % NaCl (154 roztwór przezroczysty, krwinki dodany do izotonicznego roztworu
mmol/l), 1 ml eteru lub zhemolizowane rozpuszczalnik rozpuścił lipidową cześć
chloroformu, 3 krople otoczki krwinek i spowodował hemolizę
krwi
6 5 ml 0,9 % NaCl (154 roztwór przezroczysty, krwinki digitonina (saponina) mimo izotoniczności
mmol/l), 3 ml digitoniny zhemolizowane roztworu tworzy z cholesterolem otoczki
2 % (20 g/l), 3 krople digitonid i powoduje hemolizę
krwi
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
7 5 ml 1,5 % roztworu roztwór przezroczysty, krwinki mocznik łatwo przenika do wnętrza krwinek
mocznika (249 mmol/l) zhemolizowane i, mimo \
e jego roztwór jest izotoniczny,
 izotoniczny, 3 krople wywołuje hemolizę jak woda destylowana
krwi
B Oznaczanie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych
W statywie umieszcza się 21 suchych, zaopatrzonych kolejnymi numerami sto\
kowatych probówek
wirówkowych. Do pipety z podziałkami co 0,01 ml nabiera się 1 ml 1 % roztworu soli kuchennej (171, 1
mmol/l). Do pierwszej probówki nalewa się 0,7 ml, a do 21. resztę, tj. 0,3 ml. Następny mililitr tego roztworu
dzieli się tak, \
e do probówki 2. wlewa się 0,68 ml, a do probówki 20. resztę, tj. 0,32. Postępując w analogiczny
sposób, nalewa się do ka\
dej kolejnej probówki od początku szeregu o 0,02 ml mniej, a do ka\
dej kolejnej
probówki od końca szeregu o 0,02 ml więcej ni\
do poprzedniej, a\
do napełnienia wszystkich probówek. Z
kolei ka\
dą probówkę z odmierzoną ilością roztworu NaCl dopełnia się wodą destylowana do objętości 1 ml,
postępując jak poprzednio, tylko w odwrotnej kolejności. W ten sposób przygotowuje się szereg rozcieńczeń soli
kuchennej od 0,7 % do 0,3 % (119  5 mmol/l) z przeskokami od próbówki poprzedniej do następnej o 0,02 %
NaCl (3,42 mmol/l).
Do ka\
dej z tak przygotowanych probówek dodaje się 2  3 krople świe\
o z \
yły pobranej krwi albo
zawiesiny przemytach krwinek czerwonych, zmieszanych stosunku 1 : 5 z fizjologicznym roztworem NaCl.
Ju\
po 15 min od chwili zmieszania krwi z roztworem mo\
na odczytać wynik, ale poleca się równie\

drugie odczytywanie po 2 godzinach. Przed odczytaniem wyniku powinno się poddać wszystkie próbówki
kilkunastominutowemu wirowaniu.
Odczytanie wyniku polega na znalezieni stę\
enia soli kuchennej w probówce, w której roztwór nad
opadłymi  nie zhemolizowanymi  krwinkami jest jeszcze bezbarwny. To najmniejsze stę\
enie roztworu, w
którym jeszcze nie wystąpiła hemoliza, stanowi minimalna granicę oporności, w warunkach prawidłowych
0,46 % NaCl (78,7 mmol/l), gdy\
ju\
w roztworze następnej próbówki o 0,02 % mniejszym stę\
eniu zaczyna się
właśnie hemoliza najmniej opornych krwinek.
Wreszcie odszukanie probówki, w której na dnie znajduje się najmniejszy osad krwinek czerwonych nie
zhemolizowanych oznacza granicę maksymalnej oporności, gdy\
ju\
w następnej probówce o stę\
eniu 0,02 %
mniejszym wszystkie krwinki uległy hemolizie i na dnie probówki nie dostrzega się \
adnego osadu. Dokładniej
badanie to wykonuje się za pomocą zbuforowanych roztworów NaCl, gdy stopień hemolizy ocenia się
fotoelektryczne w płynie po odwirowaniu ka\
dej probówki i wyra\
a się w procentach.
(...)
11 Ilościowe oznaczanie hemoglobiny
Ilość hemoglobiny mo\
na oznaczyć jedną z następujących metod: chemiczną, kolorymetryczną,
spektrofotometryczną, gazometryczną i refraktometryczną.
Metoda chemiczna polega na tym, \
e w odmierzonej objętości krwi określa się zawartość \
elaza.
Uwzględniając znany fakt, \
e na 100 g Hb przypada 0,336 g Fe, ławo ju\
obliczy się ilość Hb w badanej próbce,
a ostateczny wynik poda w g Hb / 100 ml badanej krwi. Metody tej nie stosuje się praktycznie w celach
klinicznych. Ma ona jednak wa\
ne znaczenie jako dokładna metoda sporządzania wzorców do łatwiejszych
metod stosowanych praktyce.
Metody kolorymetryczne polegają na porównywaniu intensywności zabarwienia roztworu po
zhemolizowaniu badanej krwi z roztworem wzorcowym o znacznym stę\
eniu hemoglobiny. W tym celu mo\
na
porównywać niezmieniony chemicznie barwnik krwi w postaci hemoglobiny, oksyhemoglobiny lub
karboksyhemoglobiny badanej próbki z wzorcowymi roztworami odpowiednich postaci hemoglobiny.
Intensywność i właściwości zabarwienia są jednak wtedy w znacznej mierze zale\
ne od stopnia utlenowania lub
wysycenia tlenkiem węgla.
Dlatego te\
zwykle porównuje się kolor hematyny, czyli oksyheminy uzyskanej z badanej krwi pod
wpływem kwasu solnego, z z wzorcowym roztworem kwaśnej hematyny, powstałej ze znanej ilości
hemoglobiny. W ten sposób kolorymetria staje się niezale\
na od stopnia utlenowania krwi u\
ytej do badania,
gdy\
zabarwienie kwaśnej hematyny jest ju\
zale\
ne tylko od ilości hemoglobiny w badanej próbce, a nie od
stopnia jej wysycenia tlenem. Poza tym wzorcowe roztwory kwaśnej hematyny są o wiele bardziej trwałe ni\

roztwory nie zmienionej hemoglobiny, zawierającej białko i \
elazo dwuwartościowe. Ostatnio stosuje się w tym
celu cyjanometemoglobinę.
Metoda gazometryczna polega na tym, \
e próbkę krwi całkowicie uprzednio nasyconą tlenem pozbawia
się w pró\
ni pochłoniętego tlenu, którego objętość dokładnie mierzy się odpowiednimi przyrządami. Biorąc pod
uwagę, \
e 1 g Hb wią\
e  a więc mo\
e te\
uwolnić  1,34 ml O2, mo\
na ze znanej ilości uwolnionego tlenu
obliczyć ilość wią\
ącej go hemoglobiny i określić ją w g / 100 ml badanej krwi.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Metoda fotometryczna, elektrofotometryczna lub spektrofotometryczna polega na tym, \
e światło o
danej długości fali przepuszcza się przez roztwór badanej krwi o znanej grubości warstwy i ustala się, jaka
ró\
nica powstała między siła światła padającego a przepuszczonego, czyli ile światła zostało pochłonięte przez
roztwór hemoglobiny lub barwnika z niej powstałego. Mo\
na to określić na oko lub bardzo dokładnie zmierzyć
za pomocą odpowiednich fotometrów elektrycznych.
Znając długość fali u\
ytego światła, grubość warstwy roztworu badanej krwi, przez którą światło
przechodzi oraz stopień ekstynkcji lub przepuszczalności światła w tym przypadku i stałą ich zale\
ność od
stę\
enia barwnika wzorcowego bardzo dokładnie i łatwo mo\
emy ju\
obliczyć, jakie jest stę\
enie Hb w
badanym roztworze, a tym samym  jaka jest jej wartość w 100 ml badanej krwi.
Metoda refraktometryczna polega na pomiarze współczynnika załamywania światła w roztworze
przygotowanym z badanej krwi. Znając zale\
ność między tym współczynnikiem a stę\
eniem hemoglobiny w
roztworze mo\
na obliczyć stę\
enie, a przez to ilość hemoglobiny w badanej próbce krwi.
W klinikach wystarczają przewa\
nie prostsze metody kolorymetryczne, dające wprawdzie wynik z
błędem około ą 5 %, ale za to szybkie i łatwe do wykonania. Na tej zasadzie opiera się najczęściej stosowna
metoda Sahliego. Odmierzoną ilość krwi miesza się z kwasem solnym, aby hemoglobiną przemienić w kwaśną
hematynę, którą porównuje się kolorymetrycznie z odpowiednimi wzorcami. Obecnie najczęściej oznacza się
ilość hemoglobiny na podstawie fotoelektrycznego określenia stę\
enia jej pochodnej cyjanowodorowej  metodą
Drabkina.
A Metoda Sahliego
Aparat Sahliego składa się z oprawki, w której przed matową szybką stoją dwa zworce barwne.
Zabarwienie wzorców odpowiada barwie kwaśnej hematyny, tj. chlorohemicy uzyskanej z krwi człowieka o
prawidłowej zawartości hemoglobiny rozcieńczonej 0,1 M kwasem solnym (100 mmol/l) w stosunku 1 : 100.
Sahli uwa\
ał za prawidłową krew, która zawiera 17,3 Hb w 100 ml. Między te wzorce wstawia się
wykalibrowaną próbówkę pomiarową.
Pierwotne hematokryty miały rurki pomiarowe z jedną podziałką w stopniach Sahliego. Kontrolne
badania wykazały jednak, \
e większość zdrowych ludzi w naszych warunkach geograficznych nie osiąga 100o
Sahliego. Wprowadzono przeto drugą podziałkę, a mianowicie w procentach w stosunki do normy. Norma ta
wynosi dla mę\
czyzn 16, a dla kobiet 14,4 g Hb / 100 ml krwi (9,93 i 8,93 mmol/l). Wreszcie bywają rurki
pomiarowe z podziałką bezpośrednio w gramach hemoglobiny / 100 ml krwi.
Z jaką skalą mamy do czynienia, mo\
na się zorientować po tym, \
e podziałka wyra\
ona małymi
liczbami (do 24) oznacza gramy Hb w 100 ml. Spośród dwóch skal wyra\
onych liczbami ponad 100, ta jest
podziałką procentową, która ma większe liczby, a skalą Sahliego jest ta, której liczby są mniejsze i podziałka 80
odpowiada podziałce 100 na poprzedniej skali, zatem 16 g = 100 % = 80o Sahliego (obecnie rzadko stosowane).
Zwykła pipetką nalewa się 0,1 M kwasu solnego (100 mmol/l) do podziałki 10 w środkowej rurce
hemoglobinometru Sahliego. W miarową pipetkę tego aparatu naciąga się 20 ul krwi z nakłutej opuszki palca,
jak opisano przy liczeniu krwinek. Pipetkę wyciera się z ewentualnych śladów krwi na zewnątrz i sprawdza, czy
nieprzerwany słupek krwi w kapilarze sięga dokładnie do podziałki 20. Ewentualny nadmiar krwi w pipetce
obciąga się przez wylotu bibuła filtracyjną lub watą. Wylot pipetki wprowadza się pod powierzchnię kwasu w
próbówce pomiarowej i ostro\
nie wydmuchuje się krew, która opada na dno. Kwasem nie zmieszanym jeszcze z
krwią przemywa się wnętrze pipetki przez dwukrotne naciągnięcie do podziałki 20 i ponowne wydmuchnięcie
do probówki.
Mniej więcej przez minutę potrząsa się probówką wyjęta ze statywu, a\
krew dobrze zmiesza się z
kwasem, ulegnie hemolizie, a hemoglobina przejdzie w kwaśną hematynę, tzn. a\
powstanie roztwór
ciemnobrunatny i przejrzysty. Je\
eli krew częściowo skrzepnie i w roztworze widzi się zawiesiną grudek
skrzepu, doświadczenia trzeba powtórzyć, oczyściwszy przedtem przyrządy. Mieszając następnie zawartość
probówki szklana pałeczką, dolewa się kroplami wodę destylowana tak długo, a\
kolory badanego roztworu i
wzorców dokładnie się zrównają. Nale\
y uwa\
ać, aby szklanym pręcikiem do mieszania nie wynieść poza
probówkę ani kropli płynu. W tym celu wskazane jest albo nie wysuwać go całkowicie z rurki albo dokładnie
wycierać o wewnętrzne jej ścianki.
Całe doświadczenie trzeba tak wykonywać, aby wynik był odczytany po upływie 3 minut od momentu
zmieszania krwi z kwasem. Pomiar powinien być wykonany przy świetle dziennym. Cyfry podziałek na
probówce pomiarowej powinny być zwrócone na boki, a więc do roztworów barwnych, aby nie przeszkadzały w
polu widzenia.
Metoda Sahliego jest obcią\
ona licznymi błędami. Dlatego te\
wszystkie laboratoria dysponujące ju\

fotokolorymetrami stosują jedną z metod elektrofotometrycznych, najczęściej cyjnomethemoglobinową metodę
Drabkina.
B Metoda Drabkina
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Do małej probówki z korkiem, np. fiolki po penicylinie, odmierza się 5 ml odczynnika Drabkina, który
zawiera 0,305 g \
elazicyjanku potasowego, 1,0 g kwaśnego węglanu sodowego i 0,05 g cyjanku potasowego w
jednym litrze wody. Do tego dodaje się 0,02 ml krwi, zamyka korkiem, miesza i czeka przynajmniej 5 minut, a\

z hemoglobiny wytworzy się cyjanomethemoglobina. Wtedy spektrofotometrycznie mierzy się ekstynkcję przy
długości fali 540 nm, uwzględniając analogiczny pomiar próby zerowej, czyli z odczynnikami bez próbki krwi.
Podstawiając znalezione wartości do wykresu kalibracyjnego lub te\
do wzoru razem z ekstynkcją wzorcowego
roztworu cyjanomethemoglobiny, znajduje się g % Hb w badanej krwi.
(...)
C Obliczanie wskaz
nika barwnego
Ustalenie wskaz
nika barwnego krwi  WB  pozwala zorientować się ile hemoglobiny w stosunku do
normy zawierają poszczególne krwinki czerwone. Wskaz
nik poucza czy mamy niedokrwistość nadbarwiliwą
czy niedobarwliwą. Prawidłowa krew zawiera prawidłową liczbą krwinek czerwonych i prawidłową ilość
hemoglobiny, czyli ka\
da krwinka zawiera prawidłową ilość hemoglobiny. Wskaz
nik takiej krwi, jako stosunek
normy do normy wynosi 1.
WB = 100 % tj. norma Hb ( u mę\
czyzny 16 g / 100 ml, czyli 9,93 mmol/l) / 100 % tj. norma krwinek (u
mę\
czyzny 5 mln / 1 ul, czyli 5 T / l) albo (100 % Hb = 100) / (2 x 50 = 100) = 1
Wskaz
nik ten znajduje się, dzieląc procentową zawartość hemoglobiny w badanej krwi przez liczbą
otrzymaną z podwojenia pierwszych dwóch cyfr liczby oznaczającej ilość krwinek czerwonych w 1 ul tej krwi.
Gdy indeks jest większy od jedności, to poszczególne krwinki czerwone mają za du\
o Hb
(hyperchromia), a gdy jest mniejszy od jedności, to ilość Hb w pojedynczych krwinkach czerwonych jest za
mała (hipochromia). Wartości prawidłowe WB mieszczą się w granicach 0,85  1,15.
(...)
12 Oznaczanie czasu krwawienia
Odstęp czasu między sztucznie wywołanym małym skaleczeniem skóry a ustaniem krwawienia z tego
miejsca nazywamy czasem krwawienia. Prawidłowy czas krwawienia waha się od 2 do 6 minut. Czas ten zale\
y
od krzepliwości krwi, jednak w większym jeszcze stopniu od właściwości naczyń krwionośnych oraz liczby i
cech czynnościowych krwinek płytkowych.
Czas krwawienia przedłu\
a się w następujących przypadkach: niedobór witaminy C, toksyczne lub
zakaz
na uszkodzenie ściany naczyń krwionośnych, niedostateczna szybkość krzepnięcia krwi oraz zmniejszona
liczba płytek krwi albo upośledzona ich czynność.
Czas krwawienia mo\
na oznaczyć za pomocą bibuły filtracyjnej. Odka\
oną opuszka palca nakłuwa się
jałowym ostrze na głębokość około 3 mm. Notuje się czas nakłucia. Następnie co 30 s dotyka się bibułą
filtracyjną miejsca krwawiącego. Ślady krwawe na bibule, gdy ka\
de dotknięcie zaznaczone jest w oddzielnym
miejscu, stają się coraz słabsze, a\
wreszcie bibuła przestaje się barwić. Ten moment oznacza koniec
krwawienia.
13 Oznaczanie czasu krzepnięcia
Czas krzepnięcia, czyli odstęp czasu od chwili wynaczynienia krwi do momentu ej skrzepnięcia, mo\
na
oznaczyć wieloma metodami. Podając wynik trzeba dodać, jaką metodą i w jakiej temperaturze został
osiągnięty, gdy\
ró\
ne metody dają rozmaite wielkości czasu krzepnięcia. Pełną wartość porównawczą mają
tylko wyniku uzyskane jedną metodą w jednakowych warunkach pomiaru.
A Metoda Vierordta
Oczyszczoną opuszka palca nakłuwa się, notuje czas i wyciera pierwszą kroplę krwi. Do następnej
dostawiamy jeden koniec poziomo trzymanej rurki, do której krew wnika na przestrzeni 0,5 do 2 cm. Przez drugi
koniec rurki wprowadza się włos, który po upływie 3 min zaczyna się przesuwać przez słupek krwi, pociągając
go w jednym kierunku co 15 s zawsze w kilka milimetrów. Obserwujemy, kiedy na włosie dadzą się zauwa\
yć
czerwone plamki, pochodzące od krzepnącej krwi i kiedy znów przestaną się pojawiać. Te momenty oznaczają
początek i koniec krzepnięcia, a czas od chwili pojawienia się krwi na opuszce palca do początku krzepnięcia
oznacza czas krzepnięcia.
B Metoda kroplowa
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Na środku wklęsłej powierzchni jednego szkiełka zegarkowego daje się du\
ą kroplę krwi i przykrywa
się drugim szkiełkiem odwróconym wypukłością ku górze. Obydwa szkiełka trzyma w płaszczyz
nie poziomej
między kciukiem a palcem wskazującym. Następnie ostro\
nie przechyla się szkiełka w kierunku płaszczyzny
pionowej i wraca do poziomu. Te ruchy wykonuje się zwykle co 30 s, poczynając od czwartej minuty po
wynaczynieniu krwi. Początkowo nie przyczepiona jeszcze do podstawy kropla krwi ślizga się po szkiełku
podczas pochylania w kierunku działania siły cię\
kości. W pewnej chwili przestaje się ślizgać, gdy\
wydzielone
pierwsze nitki włóknika przyczepiają krew do podstawy. Jest to początek krzepnięcia. Wreszcie po pewnym
czasie kropla nie tylko nie posuwa się ku dołowi w pionowym ustawieniu szkiełek, ale te\
nie odkształca się
więcej w postaci zwisającego woreczka. Jest to chwila oznaczająca koniec krzepnięcia.
(...)
15 Oznaczanie szybkości opadania krwinek (odczyn Biernackiego, OB)
Szybkość rozdzielania się nie krzepnącej krwi na górną warstwę osocza i dolną, zawierającą składniki
postaciowe, jest w warunkach prawidłowych stała. Zrozumiałe jest, \
e cię\
sze krwinki czerwone (cię\
ar
właściwy 1,090) zawieszone w osoczu o znacznie mniejszym cię\
arze właściwym (1,027), pozostające w
spokoju poza organizmem, musza pod działaniem siły cię\
kości opadać i oddzielać się od osocza. Objaśnienia
wymaga jednak fakt, \
e krwinki opadają szybciej, ni\
by się tego mo\
na spodziewać, uwzględniając tylko silę
cią\
enia działającą na pojedyncze komórki w osoczu. Według takiego rozumowania erytrocyty powinny opadać
z prędkością około 0,2 mm / h. W rzeczywistości opadają jednak szybciej, gdy\
układają się w ró\
nej wielkości
zespoły, co znane jest pod nazwą agregacji. Szybkość opadania krwinek zale\
y przeto od tego, jak łatwo i w jak
wielkie zespoły układają się erytrocyty. Je\
eli agregacja prowadzi do powstawania zlepów po 10 komórek, to
krwinki opadają z prędkością 1 mm / h. W przypadku powstawania zlepów, z których ka\
dy zawiera około
50 000 erytrocytów, prędkość sedymentacji zwiększa się do 75 mm / h.
Ogólnie mówiąc, przyspieszenie sedymentacji powodują: zwiększenie zdolności agregacyjnej krwinek
czerwonych, zmniejszenie ich liczby oraz zwiększenie frakcji globulinowej w stosunku do albuminowej w
osoczu i wzrost lepkości. Wydaje się, \
e najwa\
niejszą przyczyną zmian sedymentacji jest stosunek globulin do
albumin w osoczu. Gdy globuliny zyskują przewagę, zmniejsza się ładunek elektryczny krwinek czerwonych i
zwiększa sie ich zdolność zlepna, a przez to zwiększa się szybkość sedymentacji i na odwrót. Oznaczenie tej
szybkości jest przeto prostą metodą, pozwalającą wnioskować o zmianach, jakie zachodzą w osoczu podczas
wielu stanów patologicznych.
Fizjologiczne przyspieszenie sedymentacji występuje po obfitych posiłkach, po gorących kąpielach, w
czasie miesiączkowania i w cią\
y; szybkość opadania jest najmniejsza u noworodków; jest ona równie\
mniejsza
rano ni\
po południu.
W stanach chorobowych przyspieszenie sedymentacji powodują: nowotwory złośliwe, kiła, gościec
stawowy, gruz
lica i inne choroby zakaz
ne oraz procesy zapalne, niedokrwistość złośliwa, przewlekłe zatrucie
morfiną i inne. Zwolnienie sedymentacji wytęp uje w pewnych chorobach wątroby, wskutek nadu\
ycia chininy i
w niektórych stanach uczulenia.
Ze względu na ilość krwi konieczną do oznaczenia szybkości opadania rozró\
niamy metody makro i
mikro. W pierwszych konieczne jest pobranie krwi przez nakłucie \
yły, w drugich wystarcza ilość krwi, jaką
mo\
emy uzyskać przez nakłucie opuszki palca u dorosłych lub pięty u małych dzieci.
A Pobierane krwi przez nakłucie \
yły
W celu pobrania krwi z \
yły przygotowuje się strzykawkę ,kilka igieł do wstrzyknięć do\
ylnych i
szczypczyki anatomiczne wyjałowione przez gotowanie co najmniej 15 minut w wodzie destylowanej albo w
autoklawie pod ciśnieniem 2 atm.
Obna\
one ramię podpiera się tak, aby zgięcie łokciowe zwrócone było ku górze. Przedramię powinno
być wyprostowane, a pięść zaciśnięta. Dookoła ramienia zakłada się opaskę w celu wywarcia ucisku większego
ni\
ciśnienie w \
yłach, ale mniejszego ni\
ciśnienie skurczowe w tętnicach. W ten sposób zamyka się odpływ
krwi \
ylnej, a pozostawia swobodny dopływ krwi tętniczej, wskutek czego \
yły nabrzmiewają i łatwo mogą być
nakłute.
Ostrze igły kieruje się w stronę najlepiej widocznej lub wyczuwalnej \
yły w przegubie łokciowym.
Miejsce to trzeba przedtem dokładnie oczyścić watą zwil\
oną w eterze lub alkoholu. Gdy wyschnie środek
odka\
ający, igłę wkłuwa się w miejsce gdzie \
yła jest najlepiej wypełniona. Po przebiciu skóry tak nachyla się
strzykawkę, aby igła przebiegała równolegle do podłu\
nej osi \
yły i jednym ruchem przekłuwa się przednią
ścianę \
yły, wsuwając do niej igłę na mała głębokość w kierunku dosercowym. Ostro\
nie przekłada się teraz
strzykawkę w lewą rękę, opartą o nakłuwane przedramię, a prawa delikatnie cofa się tłok strzykawki, aby
upewnić się, czy koniec igły tkwi w \
yle, co objawia się napływem krwi do strzykawki. W ten sposób mo\
na
naciągnąć do strzykawki po\
ądaną ilość krwi, zwolnić ucisk na ramieniu, przyło\
yć jałowy tamponik z gazy lub
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
waty zwil\
onej w alkoholu tu\
nad miejscem nakłucia i znów jednym ruchem wyciągnąć igłę z \
yły. Przez kilka
minut nale\
y lekko przyciskać miejsce nakłucia tamponikiem lub nało\
yć mały opatrunek z elastycznego
przylepca.
Podobnie wykonuje się wstrzyknięcia do\
ylne, z ta tylko ró\
nicą, \
e przed nakłuciem wypełnia się
strzykawkę i igłę odpowiednim płynem, tak aby nie było w nich powietrza. Po zaaspirowaniu krwi zdejmuje się
opaskę uciskową i powoli wtłacza płyn do \
yły.
Na ćwiczeniach z fizjologii studenci powinni najpierw wykonać nakłucie \
yły brze\
nej mał\
owiny
usznej u królika lub \
yły odpiszczelowej psa i wstrzyknąć do\
ylnie fizjologiczny roztwór NaCl. Nakłuwania
\
yły u człowieka musi z pełna odpowiedzialnością dopilnować asystent lekarz.
B Metoda Westergrena
Aparat Westergrena składa się ze statywu i rurek pomiarowych. Rurka szklana długości 30 cm i
średnicy wewnętrznej 2,5 mm jest od dołu zaopatrzona w podziałkę milimetrową na przestrzeni 20 cm w ten
sposób, \
e ostatnia dolna kreska podziałki = 200, a pierwsza górna = 0.
Rurkę napełnioną od dołu a\
do podziałki o mieszaniną 4 części krwi i 1 części 3,8 % cytrynianu
sodowego ustawia się pionowo na środku gumowego korka tkwiącego w podstawie statywu. Na górny wylot
rurki nakłada się sprę\
ynowy zacisk statywu, tak aby rurka ściśle przylegała dolnym wylotem do gumowej
podstawki, co uniemo\
liwi wylewanie się krwi. W badaniach seryjnych 1,6 ml krwi z ka\
dej strzykawki wlewa
się najpierw do oddzielnej próbówki z 0,4 ml roztworu cytrynianu. Po skończeniu pobierania krwi zawartość
ka\
dej probówki ponownie miesza się i naciąga przez aspirację do pipet Westergrena.
Po upływie jednej godziny odczytuje się wartość słupa przezroczystego osocza nad nieprzerwaną
warstwą krwinek. Wielkość ta oznacza szukaną szybkość sedymentacji. Klinicznie wa\
ny jest tak\
e wynik
odczytany po 2 h, jak równie\
wskaz
nik obliczony z wyniku po pierwszej i drugiej godzinie.
C Metody mikro
W przypadku gdy pobranie krwi z \
ył napotyka trudności, musimy wykonać OB z krwi pobranej przez
nakłucie opuszki palca jedną z metod mikro.
Aparat mikrosedymentacyjny składa się ze statywu, rurek pomiarowych, małych próbówek i ustnika z
wę\
ykiem. Rurka o średnicy wewnętrznej 1 mm i długości 15 cm jest zaopatrzona na całej długości w
milimetrową podziałkę, a po napełnieniu krwią mo\
e być ustawiona pionowo na statywie jak w aparacie
Westergrena.
Do małego naczyńka nalewa się 5 % roztwór cytrynianu sodowego (169 mmol/l). Na górny koniec
rurki sedymentacyjnej nakłada się wę\
yk zakończony ustnikiem. Aspirując przez ustnik naciąga się cytrynian w
rurkę do podziałki 3 cm i wdmuchuje go do małej próbówki nale\
ącej do aparatu.
Dolny koniec poziomo trzymanej rurki dostawia się do du\
ej kropli krwi na opuszce nakłutego palca,
aby naciągnąć krwi do podziałki 12 cm. Dla uniknięcia skrzepu trzeba krew natychmiast wydmuchać do
probówki, w której zmiesza się z cytrynianem w stosunku 1 : 5. Tej mieszanki nabiera się teraz w rurkę do
podziałki 100 i ustawia w statywie. Wynik odczytany po pierwszej i drugiej godzinie zgadza się z wielkościami,
jakie daje powszechnie u\
ywana metodę Westergrena, gdy prędkość opadania nie jest większa ni\
30 mm / h.
U\
ywając najczęściej stosowanej metody Westergrena lub innych metod dających zgodnie z ni\
wyniki,
przyjmuje się jako prawidłową wartość sedymentacji następujące wartości: po 1 h u noworodków 1  2 mm, u
mę\
czyzn 2  6 mm, u kobiet 3  10 mm. Średnią szybkość opadania znajdziemy, jeśli do wartości odczytanej
po pierwszej godzinie dodamy pół ogólnej wartości po 2 godzinach sumę tę podzielimy przez 2. Ta wielkość
wynosi dla kobiet 2  8, a dla mę\
czyzn 2  4 mm.
(...)
17 Oznaczanie grup krwi
(...)
Istnieją ró\
ne metody oznaczania grup krwi. Najczęściej stosuje się metodę, w której u\
ywa się surowic
wzorcowych. Jedna z nich zawiera tylko aglutyniny alfa, czyli anty-A, druga natomiast beta, czyli anty-B.
Do osobnych kropli surowic wzorcowych dodaje się badanych krwinek w postaci 5 % zawiesiny
(50 ml / l) uzyskanej przez 20-krotne rozcieńczenie izotonicznym roztworem cytrynianu sodowego i obserwuje
się, w której z wzorcowych badane krwinki uległy aglutynacji, aby na tej podstawie ocenić, do jakiej musiały
nale\
eć grupy.
Je\
eli aglutynacja nie wystąpi w surowicy beta, czyli anty-B, ani w surowicy alfa, czyli anty-A, tzn. \
e
badane krwinki nie zawierają antygenu A ani antygenu B, badana krew nale\
y więc do grupy 0.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Je\
eli aglutynacja wystąpi tylko w surowicy alfa, czyli anty-A, badane krwinki zawierają jedynie
antygen A, a więc badana krew nale\
y do grupy A.
Je\
eli aglutynacja nastąpi tylko w surowicy zawierającej aglutyninę beta, czyli anty-B, to badane
krwinki mają jedynie antygen B, a więc krew tak nale\
y do grupy B.
Je\
eli aglutynacja nastąpi zarówno w surowicy anty-B, jak i w surowicy anty-A, tzn. \
e badane krwinki
musiały zawierać antygen A i B, a więc krew taka nale\
do grupy AB.
Dla kontroli mo\
na u\
ywać surowicy grupy 0 zawierającej aglutyninę alfa i beta.
Surowice do oznaczania grup krwi kupuje się zazwyczaj gotowe, chocia\
mo\
na je sporządzić samemu
z krwi osób z znanej grupie. Powinny one być świe\
e, zawarte w jałowych i hermetycznie zamkniętych
naczyniach, a miano ich nie powinno być mniejsze ni\
1 : 32, tzn. \
e rozcieńczone nawet 32 razy powinny
jeszcze aglutynować 5 % zawiesinę krwinek odpowiedniej grupy (50 ml / l). Surowice te przechowuje się w
pomieszczeniach ciemnych i w temperaturze ok. + 5oC.
A Oznaczanie grup krwi za pomocą surowic wzorcowych na szkiełku podstawowym
Szkiełko podstawowe umieszcza się na białym podkładzie. Na środek szkiełka wlewa się kroplę
surowicy wzorcowej 0 (alfa + beta), bli\
ej jednego końca umieszcza się kroplę wzorcowej surowicy beta, a
bli\
ej drugiego końca kroplę surowicy wzorcowej alfa. Do szkiełka zegarkowego nalewa się roztworu
cytrynianu sodowego. Nakłuwa się opuszkę palca, aby w mieszalnik Potaina nabrać badanej krwi do podziałki
0,5 i uzupełnić cytrynianem do podziałki 11. Po wymieszaniu usuwa się 2 pierwsze krople z mieszalnika.
Następnie do ka\
dej z 3 kropel surowic wzorcowych daje się po kropli zawiesiny badanej krwi z mieszalnika.
Pałeczką szklaną lub naro\
nikiem szkiełka podstawowego mieszamy zawiesinę krwi z kroplą surowicy,
rozpościerając ją na przestrzeni o średnicy około 15 mm. Szkiełko podstawowe chwyta się za długie krawędzie i
kołysząc nim obserwuje się aglutynację, która powinna wystąpić przed upływem 5 minut. Dla kontroli ogląda się
ka\
dą kroplę przez szkło powiększające lub mikroskop i według powy\
szego opisu znajduje się, do jakiej grupy
nale\
ała badana krew.
Aglutynacja prawdziwa, czyli zachodząca pod wpływem aglutynin, polaga na bezładnym zlepianiu się
krwinek w ró\
nej wielkości grudki i odznacza się du\
ą trwałością.
Czasami po liku minutach od chwili zmieszania badanej krwi z surowicą wzorcową wystepuje pseudo
aglutynacja, czyli aglutynacja pozorna, zwana równie\
agregacją, czyli odbywa się bez udziału aglutynin, a
polega na układaniu się krwinek czerwonych w ruloniki. Makroskopowo dostrzega się w badanej krwi
równomierną i drobną ziarnistość agregacji, widoczną przez warstwę przejrzystej cieczy. Ziarnistość tego typu
jest nietrwała, gdy\
wymieszanie przez wstrząśnięcie szkiełkiem, szczególnie po dodaniu fizjologicznego
roztworu soli, prowadzi do ponownego pojawienia się równomiernej i nieprzejrzystej zawiesiny.
W odró\
nieni od agregacji gruba ziarnistość prawdziwej aglutynacji utrzymuje się pomimo prób
mieszania lub rozcieńczania fizjologicznym roztworem soli.
Opisany sposób oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych mo\
na te\
wykonać bez u\
ycia
mieszalnika Potaina i cytrynianu sodowego do rozcieńczania krwi. Naro\
nik szkiełka podstawowego zanurza się
w kropli krwi wypływającej z ranki na opuszce palca. Przyczepioną do szkiełka małą ilość krwi przenosi się do
kropli jednej z surowic wzorcowych, umieszczonych jak poprzednio na szkiełku podstawowym. Mieszając
naro\
nikiem szkiełka podstawowego, otrzymuje się równomierną zawiesinę badanej krwi w surowicy
wzorcowej. W ten sposób przenosi się drugim naro\
nikiem szkiełka podstawowego badaną krew do drugiej
kropli surowicy wzorcowej i obserwuje się, gdzie wystąpi aglutynacja.
Nale\
koniecznie przestrzegać, aby w tych wszystkich czynnościach nie przenieść nawet śladów
kurwicy z jednej kropli do drugiej, a więc przede wszystkim nie mieszać tym samym przedmiotem najpierw
jednej, a potem drugiej kropli i bardzo czysto myć szkło laboratoryjne.
Dokładniejsze wyniki oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych uzyskuje się wykonując
badania nie w jednej kropli na szkiełku podstawowym, ale w nieco większej ilości surowic w małych
probówkach. W miarę potrzeby próby kontrolne prowadzi się w cieplarce o temperaturze 37oC.
B Próba zgodności krwi biorcy i dawcy bez posługiwania się izoaglutyninami wzorcowymi
Kiedy nie ma surowic wzorcowych zawierających znane izoaglutyniny i nie mo\
na przygotować ich we
własnym zakresie, mo\
na w inny sposób zorientować się, czy krew proponowanego dawcy będzie dobrze
znoszona przez biorcę, czy te\
przetoczenie wykonać nie wolno, dopóki nie znajdzie się odpowiedniego dawcy.
W tym celu na środek szkiełka podstawowego z wyszlifowanym zagłębieniem opuszcza się kroplę
wody destylowanej, z która miesza się dokładnie krople biorcy. Gdy nastąpi hemoliza, dodaje się kroplę
cytrynianu sodowego. W ten sposób otrzymuje się płyn zawierający izohemaglutyniny biorcy. Naro\
nikiem
szkiełka podstawowego przenosi się do tego płynu kroplę krwi proponowanego dawcy. Po dokładnym
wymieszaniu obserwuje się, czy wystąpi aglutynacja krwinek dawcy pod wpływem aglutynin krwi biorcy. Na
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
drugim szkiełku wykonuje się tę samą próbę w odwrotnym porządku, tzn. do zhemolizowanej kropli krwi
proponowanego dawcy dodaje się kroplę krwi biorcy. Jest to bardzo uproszczona próba krzy\
owa; gdy jej wynik
jes pozytywny, nie wolno przetaczać krwi od tego dawcy, lecz dobrać innego, z którego krwią próba krzy\
owa
wypadnie negatywnie.
Właściwą próbę krzy\
ową wykonuje się dokładniej. Nie u\
ywa się krwi zhemolizowanej i krwi pełnej,
lecz w obu częściach próby stosuje się osocze krwi dawcy lub biorcy, z którym miesza się 5 % zawiesinę
krwinek dawcy lub biorcy (50 ml / l), sporządzoną w 0,9 % roztworze NaCl (154 mmol/l) lub w odpowiednim
roztworze koloidalnym, a wynik odczytuje się po 30 min inkubacji w temperaturze 37oC.
Błędne oznaczanie grup krwi mo\
e wynikać nie tylko z pomylenia aglutynacji prawdziwej z pozorną i
na odwrót, ale równie\
z powodu pojawienia się nieswoistej aglutynacji i autoaglutynacji.
Aglutynacja nieswoista zachodzi wtedy, gdy badana krew jes dano pobrana zanieczyszczona
drobnoustrojami, które mają właściwość takiego zmieninia antygenów w krwinkach \
e aglutynują z ka\
dą
surowicą (zjawisko Thomsena).
Autoaglutynacja występuje w temperaturze od 0 do + 5oC i jest wywołana autoprzeciwciałami, które nie
mogą działać, gdy badania wykonuje się w temperaturze pokojowej.
W oznaczaniu grup krwi nie nale\
y posługiwać się hemolizynami, gdy\
hemoliza w temperaturze
pokojowej jest mniej wyraz
na i wymaga oprócz hemolizyn tak\
e dopełniacza hemolitycznego. Surowice
wzorcowe do oznaczanie grup krwi pozbawia się dopełniacza przez podgrzewanie ich w ciągu 30 min do
temperatury + 55oC. W \
ywym organizmie natomiast w przypadku przetoczenia krwi nieodpowiedniej grupy
występuje przede wszystkim hemoliza obok aglutynacji.
C Znaczenie czynnika Rh
(...)
Oprócz zgodności grupowej dawcy z biorcą w zakresie układu AB0 trzeba równie\
zapewnić zgodność
pod względem antygenu Rh.
Poniewa\
nie mamy surowicy anty-Rh jako izoprzeciwciał normalnych, musimy posiłkować się
surowicami odpornościowymi. Samo badanie odbywa się ju\
zasadniczo w sposób podobny jak w oznaczeniu
grup układu AB0.
Ze względu jednak na to, \
e przeciwciała anty-Rh nale\
ą do tzw. przeciwciał niekompletnych, badanie
nale\
y prowadzić za pomocą wzorcowych surowic z dodatkiem odpowiedniego enzymu proteolitycznego, np.
papainy aktywowanej cysteiną. Przeciwciała niekompletne nie mają bezpośredniego dostępu do antygenów w
nie przygotowanej specjalnie otoczce krwinek czerwonych. Z tego powodu wzorcową surowicę anty-Rh miesza
się najpierw z równą objętością papainy aktywowanej cysteiną, a dalsze postępowanie jest ju\
podobne do
opisanego przy oznaczaniu grup AB0.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com