str_56_57_58

Wprowadzenie

Lipazy bakterii i grzybów stanowią niezwykle ważną grupę enzy-
mów wykorzystywanych zarówno w procesach przemysłowych, jak
i w ochronie  środowiska.  Produkowane są zarówno przez bakterie
Gram-ujemne (Acinetobacter,  Alcaligenes, Burkholderia, Pseudomonas),
jak i Gram-dodatnie (Bacillus,  Micrococcus, Staphylococcus) oraz przez
liczne gatunki drożdży (Candida,  Saccharomyces) i grzybów mikro-
skopowych (Aspergillus,  Fusarium, Geotrichum,  Penicillium, Rhizopus).
Zainteresowanie lipazami mikroorganizmów przypada na przełom
lat 80. i 90. XX wieku. W latach 1990-1994 zrealizowano największy
projekt Bridge Lipase T-Project, który umożliwił poznanie dokładnej
budowy lipaz, mechanizmu ich sekrecji, oznaczania aktywności oraz
zastosowania inżynierii białek w konstruowaniu enzymów o lepszych
właściwościach katalitycznych.

Różnorodne zdolności katalityczne lipaz umożliwiają szerokie za-

stosowanie tych enzymów w różnych gałęziach przemysłu. Używa się
ich między innymi w procesach syntez wielu organicznych związków
chemicznych, w produkcji detergentów i biosurfaktantów, w przemy-
śle petrochemicznym, skórzanym, agrochemicznym, papierniczym,
spożywczym i farmaceutycznym. Obecnie lipazy znalazły także
zastosowanie w produkcji biopolimerów używanych jako materiały
opakowaniowe, w produkcji biopaliw jako alternatywnego źródła
energii oraz oczyszczaniu ścieków.

Ogólna charakterystyka lipaz

Lipazy (hydrolazy acyloglicerolowe, EC 3.1.1.3) katalizują reakcje
hydrolizy triglicerydów do wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu.
Mają także zdolność przeprowadzania reakcji odwrotnej, tj. estryfikacji
i transestryfikacji (rys. 1).

Pod względem budowy lipazy są hydrolazami serynowymi o struk-

turze trzeciorzędowej α/β. W miejscu aktywnym enzymu znajdują się
trzy aminokwasy: seryna, kwas asparaginowy lub glutaminowy oraz hi-
stydyna, stanowiące tzw. triadę katalityczną. W strukturze przestrzennej
enzymu występuje 8 równoległych harmonijek β (β1-β8) otoczonych
z obu stron 6 helisami α (αA-αF) (rys. 2). Centrum aktywne enzymu
u większości lipaz zakryte jest hydrofobowym oligopeptydem, zwa-
nym wieczkiem, które, odsuwając się, udostępnia substratom dostęp
do centrum katalitycznego enzymu i umożliwia przebieg reakcji na
granicy lipid – woda.

Lipazy są białkami o masie cząsteczkowej 19-60 kDa, rozpuszczal-

nymi w wodzie, wydzielanymi do podłoża hodowlanego w późnej
fazie logarytmicznego wzrostu bakterii. Na ich syntezę i wydzielanie
poza komórkę ma wpływ wiele czynników, takich jak temperatura, pH
podłoża, rodzaj i stężenie źródła węgla i azotu, dostępność jonów oraz
stopień natlenienia hodowli.

Lipazy w biotechnologii

Lipazy mikroorganizmów są atrakcyjnym narzędziem dla biotechnolo-
gii z wielu powodów. Są stabilne w rozpuszczalnikach organicznych,
nie potrzebują do swojego działania dodatkowych kofaktorów, cha-
rakteryzują się niską specyficznością substratową i wykazują wysoką
enancjoselektywność. Z biotechnologicznego punktu widzenia ważne
są także takie ich właściwości, jak tolerancja na wysokie pH i termo-
stabilność.

W przemyśle mlecznym lipazy stosowane są w procesie hydrolizy

tłuszczu mleka, w udoskonalaniu smaku serów, przyspieszaniu
procesu ich dojrzewania, w uzyskiwaniu seropodobnych produktów
oraz lipolizie tłuszczu masłowego i śmietany. Dodatek lipaz do

dr Agnieszka Mrozik, dr Katarzyna Hupert-Kocurek, dr hab. Sylwia Łabużek, prof. UŚ

Wydział Biologii i Ochrony Środowiska

Uniwersytet Śląski w Katowicach

Streszczenie
Lipazy mikroorganizmów stanowią różnorodną grupę enzymów
przeprowadzających szereg ważnych reakcji. Katalizują reakcje
hydrolizy i transestryfikacji triacylogliceroli, enancjoselektywną
syntezę i hydrolizę różnych estrów. Duże zainteresowanie tymi
enzymami wynika z możliwości wykorzystania ich w wielu proce-
sach biotechnologicznych i ochronie środowiska. Stosuje się je
powszechnie w przemyśle spożywczym, przy produkcji kosmetyków
i farmaceutyków, w organicznej syntezie chemicznej, przemyśle
skórzanym, w produkcji detergentów, w obróbce i produkcji pa-
pieru oraz w produkcji biopaliw.

Summary
Microbial lipases represents versatile group of enzymes that
are capable of performing a variety of important reactions. They
catalyse the hydrolysis and transesterification of triglycerides,
enantioselective synthesis, and the hydrolysis of esters. They are
currently attracting because of their application in biotechnology
and environment protection. Microbial lipases find great use in
a large number of fields such as the dairy industry, cosmetics and
pharmaceutical processing, organic synthesis, leather industry,
detergent production, pulp and paper manufacture as well as in
biodiesel production.

Słowa kluczowe
lipazy, mikroorganizmy, zastosowanie

Key words
lipases, microorganisms, application

Zastosowanie lipaz

pochodzenia mikrobiologicznego

w biotechnologii i ochronie środowiska

ochrona środowiska | temat numeru BIOTECHNOLOGIA

Laboratorium |

/2007

Rys. 2. Struktura trzeciorzędowa wzorcowej α/β lipazy

produkcji serów lub śmietany powoduje uwolnienie z tłuszczów
krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (C

i C

), nadających

produktom ostry i pikantny smak, a także średniołańcuchowych
kwasów tłuszczowych (C

i C

), które nadają wyrobom posmak

mydlany. Dzięki lipazom można uzyskać odpowiednią wartość
odżywczą i smakową produktu. Na przykład walory smakowe
czekolady poprawia zmniejszenie w maśle kakaowym ilości długo-
łańcuchowych nasyconych kwasów tłuszczowych z jednoczesnym
zwiększeniem ilości kwasów 18:0 i 18:1. Lipazy używane są także
w produkcji żywności wzbogaconej w polinienasycone kwasy
tłuszczowe (PUFAs), które nie są syntetyzowane w organizmie,
a są niezbędne do jego prawidłowego funkcjonowania. PUFAs
są potrzebne w syntezie prostaglandyn oraz stanowią lipidowe
składniki błon komórkowych. Na skalę przemysłową otrzymuje
się je z oleju z wątroby dorsza, oleju sardynek, tuńczyka, menha-
dena i ogórecznika. Pod wpływem lipaz, głównie bakterii rodzaju
Pseudomonas, dodawanych do oleju następuje koncentracja PUFAs
w postaci monoglicerydów. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe
stanowią również dodatki do produktów farmaceutycznych, między
innymi do leków przeciwzapalnych, przeciwcholesterolowych oraz
fibrynolitycznych. Innym zastosowaniem lipaz jest wykorzystanie
ich w piekarnictwie, produkcji napojów oraz do usuwania niepo-
żądanego tłuszczu z produktów mięsnych i rybnych.

Jednym z ważniejszych zastosowań hydrolaz acyloglicerolowych

na skalę przemysłową jest asymetryczna synteza związków orga-
nicznych. Dzięki posiadanej przez lipazy zdolności katalizowania
wielu różnych chemo-, regio- i stereoselektywnych reakcji możliwe
jest przekształcanie substratów prochiralnych w chiralne i rozdzielanie
mieszaniny racematów. Dzięki tym reakcjom otrzymywane są czyste

Rys. 1. Reakcje hydrolizy (A), estryfikacji (B) i transestryfikacji (C) kata-
lizowane przez lipazy

temat numeru BIOTECHNOLOGIA l ochrona środowiska

Laboratorium |

/2007

związki o podstawowym znaczeniu w przemyśle farmaceutycznym
i kosmetycznym. Związki te stosowane są do produkcji wielu leków
przeciwzapalnych, na przykład naproksenu i ibuprofenu, oraz leków
przeciwnadciśnieniowych, jak captopril, enalaprim, ceranopril, zofena-
pril i lisinoprim. W przemyśle kosmetycznym uzyskane z mieszanimy
racemicznej (-)- mentolowe estry służą do syntezy metakrylanu mentylu,
długotrwałego związku zapachowego dodawanego do perfum. Innym
związkiem szeroko stosowanym w kosmetyce jest także mirystynian
izopropylu. Z kolei metylowane ketony uzyskiwane w syntezie orga-
nicznej z udziałem lipaz znalazły zastosowanie jako czynniki nadające
smak niebieskim serom pleśniowym.

Lipazy w ochronie środowiska

Pod pojęciem ochrony środowiska rozumie się podjęcie działań umoż-
liwiających zachowanie równowagi przyrodniczej. Ochrona polega
na racjonalnym kształtowaniu środowiska i gospodarowaniu jego
zasobami zgodnie z zasadą zrównoważonego rozwoju, przywracaniu
elementów przyrodniczych do stanu wyjściowego oraz przeciwdziałaniu
zanieczyszczeniom.

W ciągu ostatnich lat obserwuje się wzrost produkcji lipaz o znacze-

niu przemysłowym. W wielu procesach na miejsce starych technologii,
wykorzystujących szkodliwe dla zdrowia i środowiska związki chemicz-
ne, wprowadza się nowe, oparte na procesach enzymatycznych. Reakcje
katalizowane przez lipazy nie stanowią zagrożenia dla środowiska,
a zużyte enzymy są nietoksyczne.

Lipazy w przemyśle skórzanym

Związki chemiczne, takie jak: rozpuszczalniki organiczne, surfaktan-
ty, sole, siarczan sodu(IV), tlenek wapnia, stosowane powszechnie
w obróbce i produkcji skór stanowią jedno z większych zagrożeń dla
środowiska biologicznego. Szczególnie niebezpieczne są zanieczysz-
czenia powstające w procesach poprzedzających barwienie skór, czyli
w namaczaniu, odtłuszczaniu, odwłasianiu i wytrawianiu. Zastosowanie
lipaz w tych procesach ogranicza ilość substancji toksycznych uwal-
nianych do środowiska.

Komercyjnymi bioproduktami zawierającymi lipazy są Foren-

zym SK i LM stosowane powszechnie w namaczaniu i odwłasianiu,
Novolime w wapnieniu, Forenzym BT w wytrawianiu, Forenzym
WG-L, DG, Greasex i NovoCor A w odtłuszczaniu. Lipazy są enzy-
mami, które specyficznie rozkładają tłuszcz, nie niszcząc skóry. Co
więcej, hydrolizują one tłuszcz nie tylko na powierzchni skóry, ale
także wewnątrz jej struktury. Niektóre z wymienionych preparatów,
szczególnie te stosowane w namaczaniu i odwłasianiu, są wzbogacone
dodatkowymi enzymami z grupy proteaz. Mieszanina tych enzymów
znacznie przyspiesza procesy namaczania i odwłasiania skór w porów-
naniu ze standardowymi procedurami z użyciem jedynie związków
chemicznych. Rolą proteaz w tych preparatach jest usuwanie błon
otaczających komórki tłuszczowe, w wyniku czego stają się one
bardziej dostępne dla lipaz. Rozkład tłuszczu przez lipazę i macierzy
białkowej, szczególnie siarczanu dermatanu, przez proteazę ułatwia
usunięcie włosów.

Kolejnym etapem w obróbce skóry jest jej odtłuszczanie, któ-

re prowadzi się poprzez emulsyfikację z użyciem surfaktantów
(oksyetylenowanych alkoholi, fenoli) lub w procesie ekstrakcji
rozpuszczalnikami organicznymi (trichloroetylenem, naftą, ben-
zyną). Użycie lipaz na tym etapie redukuje ilość zużywanych,
niebezpiecznych chemikaliów nawet o 50%. Dodatkową zaletą
użycia lipaz w przemyśle skórzanym jest jednolita i równomierna
barwa oraz gładka powierzchnia skór.

Lipazy w produkcji detergentów

Poza przemysłem skórzanym lipazy produkowane przez bakterie i grzy-
by znalazły zastosowanie w życiu codziennym do usuwania tłustych
zanieczyszczeń z powierzchni tekstylnych, w zmywarkach do naczyń
i do udrażniania rur. Tak powszechne użycie i znaczenie lipaz wynika
nie tylko z ich zdolności do efektywnego usuwania różnych tłuszczów,
ale także ograniczania obciążenia środowiska detergentami. Enzymy
stosowane w środkach piorących i czyszczących są bowiem biode-
gradowalne, nie pozostawiają szkodliwych produktów, nie wpływają
negatywnie na procesy oczyszczania ścieków i co ważne – nie stanowią
zagrożenia dla organizmów ekosystemów wodnych.

Lipazy będące składnikami proszków do prania i środków

czyszczących powinny być stabilne w szerokim zakresie pH
i temperatury, wykazywać szeroką specyficzność substratową i być
efektywnymi przy niskich stężeniach enzymu. Powinny być także
odporne na różne czynniki utleniające, chelatujące oraz na rozkład
przez inne enzymy wchodzące w skład detergentu. Takimi ideal-
nymi enzymami wydają się lipazy uzyskiwane z bakterii Ralstonia
pickettii, Burkholderia cepacia, drożdży Candida cylindracea oraz
grzyba Aspergillus niger.

Pierwszą lipazą o znaczeniu komercyjnym była wprowadzona na

rynek przez firmę Novo-Nordisk Lipolaza, naturalnie pochodząca
z grzyba Thermomyces lanuginosus i produkowana w komórkach Aspergil-
lus oryzae. Lipolase

jest aktywna i stabilna w środowisku zasadowym

i szerokim zakresie temperatur oraz odporna na działanie proteaz.
Umożliwia usuwanie tłustych plam ze szminek, sebum, masła, olejów,
zabrudzeń na mankietach i kołnierzach. Skutek działania Lipolase

nie ujawnia się jednak po pierwszym praniu, ale dopiero po kolejnym,
poprzedzonym etapem suszenia.

Lipazy są również wykorzystywane w produkcji tzw. aktywato-

rów wybielaczy. Są to związki biorące udział w reakcjach rozkładu
nadtlenku wodoru, prowadzących do powstawania nadtlenokwasów
karboksylowych. Nadtlenokwasy są odpowiedzialne za usuwanie
różnego rodzaju plam. W ciągu ostatnich kilku lat aktywatory
wybielaczy stały się ważnym składnikiem środków piorących. Najbar-
dziej znanymi spośród nich są TEAD i PAG, skutecznie usuwające
plamy z kawy i herbaty oraz NOBS, usuwający plamy z trawy i soku
pomidorowego.

Lipazy w obróbce drewna
i produkcji papieru

Niektóre rodzaje drewna, szczególnie sosnowego, bogate są w lipofilne
substancje, takie jak: triglicerydy, estry sterylu, terpeny, terpenoidy,
żywice i woski. Podczas obróbki drewna i tworzenia pulpy drzewnej
związki te są uwalniane łącznie z węglowodanami i ligninami. Tworzą
rozproszone, koloidalne krople wielkości 0,15-0,40 μm, utrudniające
absorpcję wody przez pulpę, powodujące powstawanie dziur i rozdarć,
przebarwień i hydrofobowych plam na papierze. Szczególnie kłopo-
tliwymi składnikami drewna są triglicerydy, które znacznie obniżają
wytrzymałość mechaniczną papieru. Dodatkowo niektóre ekstrakty
uwolnione z drewna razem z rozpuszczalnikami organicznymi stanowią
poważne zagrożenie dla środowiska.

Lipazy, szczególnie pochodzące z różnych gatunków grzybów, stoso-

wane podczas wstępnej obróbki drewna obniżają zawartość triglicery-
dów w pulpie, przyspieszają absorpcję wody i zwiększają wytrzymałość
uzyskiwanego papieru. Wykorzystanie lipaz ogranicza znacznie zużycie
związków chemicznych, w tym wybielających. Jednym z preparatów
stosowanych w przemyśle drzewnym jest rekombinowana lipaza, znana
pod nazwą Resinase, produkowana przez Aspergillus oryzae.

ochrona środowiska | temat numeru BIOTECHNOLOGIA

Laboratorium |

/2007

Lipazy a biopaliwa

Wyczerpywanie się naturalnych źródeł energii, takich jak: węgiel kamienny,
węgiel brunatny, ropa naftowa i gaz ziemny powoduje wzrost zainteresowa-
nia alternatywnymi sposobami produkcji paliw. Jednym z nich jest produk-
cja biopaliw, które mogą być otrzymywane z olejów roślinnych (sojowego,
rzepakowego, słonecznikowego i kokosowego), tłuszczów zwierzęcych
oraz glonów. Pod względem chemicznym biopaliwa stanowią mieszaninę
monoalkilowych estrów i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, są
niepalne, nie eksplodują, redukują emisję spalin i – w przeciwieństwie do
pochodnych ropy naftowej – są biodegradowalne.

Biopaliwa uzyskuje się w wyniku reakcji transestryfikacji triacylogli-

ceroli, obecnych w tłuszczach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego,
z monohydroksylowymi alkoholami (np. z metanolem) w obecności
nieorganicznych katalizatorów (np. NaOH i KOH). Powstałe w wyniku
tej reakcji glicerol i katalizator są usuwane przez wymywanie wodą.
Większość producentów stosuje do syntezy biopaliw katalizatory al-
kaliczne, ale obecnie prowadzone są próby z zastosowaniem katalizy
enzymatycznej. Dla przykładu immobilizowana lipaza z drożdży
Candida sp. 99-125 była wykorzystana w wydajnej produkcji biopaliwa
w reakcji metanolu z długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi.
W innych badaniach reakcje transestryfikacji olejów palmowego
i kokosowego z różnymi alkoholami prowadzono z użyciem lipazy
PS30 jako katalizatora. Wydajność produkcji biopaliwa była najwyż-
sza (ok. 72%), gdy w reakcji transestryfikacji oleju palmowego użyto
etanolu w miejsce metanolu (15%).

Wykorzystanie biopaliw w miejsce tradycyjnych źródeł energii jest

przyjazne dla środowiska. Biopaliwa redukują emisję tlenku węgla
o około 50%, dwutlenku węgla o 78,5%, eliminują emisję związków
siarki i o około 65% pyłów zawieszonych. Ograniczeniami w ich

produkcji są jednak wysokie koszty, otrzymywanie nie zawsze przewi-
dywanych produktów o określonym stopniu czystości oraz trudności
z ich oczyszczaniem.

Lipazy w oczyszczaniu ścieków

Ścieki miejskie i przemysłowe, szczególnie przemysłu mleczarskiego,
charakteryzują się znaczną zawartością biodegradowalnych związków
organicznych, zwykle tłuszczów i białek. Zbyt duża ilość olejów
i tłuszczów zwierzęcych powoduje powstawanie na powierzchni
wód ściekowych tłustych błon ograniczających dyfuzję tlenu, co
prowadzi do rozwoju niepożądanych w procesie oczyszczania nitko-
watych mikroorganizmów z rodzaju Thiothrix, Beggiatoa i Nocardia.
Co więcej, związki lipidowe opłaszczają kłaczki osadu czynnego,
ograniczając procesy transportu komórkowego, wywołują flokulację
i sedymentację kłaczków, prowadząc do zmniejszenia biomasy drob-
noustrojów. Aby zapobiec tym procesom, do oczyszczania ścieków
bogatych w lipidy stosuje się lipazy. Szczególnie obiecujące wydają
się lipazy pozyskiwane z gatunków Aspergillus niger, Rhizopus delemar,
Penicilium restrictum oraz bakterii Pseudomonas aeruginosa LP602. Dla
przykładu, dodanie lipazy ze szczepu LP602 do bogatych w tłuszcze
ścieków restauracyjnych powodowało znaczny ich ubytek, wyno-
szący 70%, w czasie pierwszych 24 godzin prowadzonego procesu
oczyszczania. Bardzo efektywne w usuwaniu związków lipidowych
okazało się również zastosowanie mieszanej populacji mikroorga-
nizmów zdolnych do syntezy lipaz. W ciągu 12 dni w warunkach
tlenowych zawartość tłuszczów w ściekach uległa zmniejszeniu
z 20 tys. mg/l do mniej niż 20 mg/l.

Piśmiennictwo dostępne na stronie www.laboratorium.elamed.pl

temat numeru BIOTECHNOLOGIA l ochrona środowiska

Laboratorium |

/2007

Piśmiennictwo

1. Abigor R.D., Uadia P.O., Foglia T.A., Haas M.J., Jones K.C., Okpefa E., Obibuzor J.U.,

Bafor M.E.: Lipase-catalysed production of biodiesel fuel from some Nigerian lauric oils.

„Biochem. Soc. Trans.”, 2000, 28, 979-981.

2. Cammarota M.C., Freire D.M.G.: A review on hydrolytic enzymes in the treatment of

waste water with high oil and grease content. „Bioresour. Technol.”, 2006, 97, 2195-

2210.

3. Demirbas A.: Biodiesel fuels from vegetable oils via catalytic and non-catalytic

supercritical alcohol transesterifications and other methods: a survey. „Energy Conv.

Manag.”, 2003, 44, 2093-2109.

4. Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B.: Lipase from Pseudomonas aeruginosa LP602:

biochemical properties and application for wastewater treatment. „J. Ind. Microbiol.

Biotechnol.”, 1998, 21, 75-80.

5. Hasan F., Shah A.A., Hameed A.: Industrial applications of microbial lipases. „Enzyme

Microb. Technol.”, 2006, 39, 235-251.

6. Hemachander C., Puvanakrishnan R.: Lipase from Ralstonia picketti as an additive in

laundry detergent formulations. „Process Biochem.”, 2000, 35, 809-814.

7. Filipsen J.A.C., Appel A.C.M., van der Hijden H.T.W.M., Verrips C.T.: Mechanism of

removal of immobilized triacylglycerol by lipolytic enzymes in a sequential laundry wash

process. „Enzyme Microb. Technol.”, 1998, 23, 274-280.

8. Jaeger K-E., Reetz M.T.: Microbial lipases form versatile tools for biotechnology.

„Trends Biotechnol.”, 1998, 16, 396-403.

9. Jaeger K-E., Eggert T.: Lipases for biotechnology. „Curr. Opin. Biotechnol.”, 2002, 13,

390-397.

10. Kamini N.R., Hemachander C., Mala J.G.S., Puvanakrishnan R.: Microbial enzyme

technology as an alternative to conventional chemicals in leather industry. „Curr. Sci.”,

1999, 76, 101-107.

11. Ma F., Hanna M.A.: Biodiesel production: a review. „Biores. Technol.”, 1999, 70, 1-15.

12. Mongkolthanaruk W., Dharmshiti S.: Biodegradation of lipid-rich wastewater by a mixed

bacterial consortium. „Int. Biodeter. Biodegr.”, 2002, 50, 101-105.

13. Saxena R.K., Ghosh P.K., Gupta R., Davidson W.S., Bradoo S., Gulati R.: Microbial

lipases: potential biocatalysts for the future industry. „Curr. Sci.”, 1999, 1, 101-115.

14. Schuchardt U., Sercheli R., Vargas R.M.: Transesterification of vegetable oils: a review.

„J. Braz. Chem. Soc.”, 1998, 9, 199-210.