W laboratorium mikrobiologicznym wynik badania zależy od wielu
czynników, poczynając od sposobu pobrania materiału lub próbek,
poprzez przechowywanie i transport, środowisko badania, przestrzegania
procedur oraz od sprawności „aparatury pomiarowej”, jaką w tym przy-
padku są pożywki mikrobiologiczne. Badania mikrobiologiczne powinny
być prowadzone według ściśle określonych procedur i dokumentów
normatywnych, które uwzględniają wszystkie niezbędne w badaniu
pożywki mikrobiologiczne dobrane tak, aby zapewniały osiągnięcie za-
mierzonego celu. Pożywki te muszą odpowiadać kryteriom jakościowym
gwarantującym uzyskiwanie stałych i powtarzalnych wyników.

Podłoża mikrobiologiczne są mieszaninami odpowiednio dobranych

naturalnych lub syntetycznych składników w płynnej, półpłynnej
lub stałej postaci, przeznaczonymi do hodowli mikroorganizmów
w warunkach laboratoryjnych. Stosuje się je do namnażania, izolacji,
różnicowania i identyfikacji mikroorganizmów, jak również wykorzy-
stuje w procesach biotechnologicznych do otrzymywania biomasy oraz
określonych produktów metabolizmu mikroorganizmów.

Poznawanie przez bakteriologów wymagań wzrostowych bakterii i grzy-

bów prowadziło do opracowywania wielu nowych pożywek. Ziemniaki,
mięso, pasta z mąki, chleb, ser, wywary, mleko, na których początkowo
hodowano drobnoustroje, zostały zastąpione przez pożywki przygo-
towane z różnych substancji. Wiele z nich w niezmienionym składzie
używana jest również obecnie, jak np. bulion odżywczy, woda peptonowa.
Hodowla w pożywkach płynnych nastręczała wielu trudności, zwłaszcza
gdy miano do czynienia z mieszaniną drobnoustrojów, ze względu na
przewagę szybko namnażających się mikroorganizmów. Wyizolowanie
pojedynczych komórek z hodowli płynnej zostało po raz pierwszy doko-
nane przez J. Listera, dzięki zastosowaniu metody rozcieńczeń. Znacznie
łatwiejsze i mniej pracochłonne miało być izolowanie drobnoustrojów na
pożywkach stałych. Obserwacje O. Brefelda dotyczące wzrostu grzybów
na powierzchni żelatyny doprowadziły do opracowania metody płytek
lanych zawierających właśnie żelatynę. Jednak surowiec ten okazał się
mało przydatny jako substancja zestalająca, ze względu na niską tempe-
raturę tężenia i związane z tym problemy przy inkubacji w temperaturze
37

о

C, preferowanej przez drobnoustroje chorobotwórcze dla człowieka

i zwierząt, czy z powodu upłynniania żelatyny przez niektóre z drobno-

ustrojów. Rozwiązaniem było zastosowanie pozyskiwanego z krasnorostu
agaru żelującego w temperaturze ok. 40

o

C i zachowującego konsystencję

nawet do 100

o

C. Praca J. R. Petriego – jednego ze współpracowników

R. Kocha – nad zestalonymi pożywkami, zaowocowała wynalezieniem
dwóch nachodzących na siebie naczyń szklanych nazywanych do dzisiaj
płytkami Petriego.

Pod koniec lat 80. XIX wieku zdano sobie sprawę, że poznanie

świata drobnoustrojów nie będzie możliwe bez zastosowania pożywek
selektywnych, ponieważ wykrycie specyficznych drobnoustrojów wy-
maga stosowania specyficznych warunków hodowli (pożywki, warunki
inkubacji), które wspomagając namnażanie jednych, mogą częściowo
lub całkowicie hamować wzrost innych drobnoustrojów. Początek
ubiegłego wieku to czas intensywnych badań nad pałeczkami kałowymi
i opracowywaniem pożywek do ich hodowli. Nikomu z nas nie są obce
nazwiska McConkey, Drigalski, Condrati i innych naukowców. Jednak
sama znajomość wymagań wzrostowych bakterii i składu pożywek była
niewystarczająca. Jakość pożywek mikrobiologicznych stosowanych
przez ich odkrywców nie zawsze była odpowiednia. Pożywki miały
bardzo ograniczony okres przydatności, łatwo ulegały zepsuciu i mi-
mo przygotowania ich według tej samej receptury znacznie różniły
się między sobą pod względem zapewnienia właściwych warunków
wzrostu. Jednym z wielu czynników odpowiedzialnych za brak po-
wtarzalności wyników badań było stosowanie naturalnych surowców,
z których w laboratorium przygotowywano wywary, co uniemożliwiało
zachowanie identycznego składu we wszystkich seriach pożywki. Na-
turalną potrzebą było znalezienie sposobu na ujednolicenie pożywek
przez stosowanie surowców o podobnej jakości, a więc wytwarzanych
w takich samych warunkach. Trafnym rozwiązaniem było użycie jako
składnika pożywek peptonu, stosowanego pierwotnie jako dodatek do
żywności. Pojawiły się pierwsze, produkowane na skalę przemysłową,
odwodnione pożywki mikrobiologiczne. Standaryzacja składników
w trakcie wytwarzania pozwoliła uzyskać pożywki o powtarzalnych
właściwościach. Prace badawcze prowadzone od połowy ubiegłego
wieku zmierzały nie tylko w kierunku poprawy jakości pożywek, ale
również – a może przede wszystkim – nad ich udoskonalaniem, tak aby
zwiększały możliwości diagnostyczne, usprawniały przebieg i skracały

dr Tomasz Zaręba

Zakład Antybiotyków i Mikrobiologii

Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego

Streszczenie
W laboratorium mikrobiologicznym wynik badania zależy od wła-
ściwego dla zamierzonego celu doboru pożywek, które muszą
odpowiadać właściwym kryteriom jakościowym, co gwarantuje
uzyskiwanie stałych i powtarzalnych wyników. Pierwsze próby ho-
dowli drobnoustrojów na pożywkach w warunkach laboratoryjnych
zapoczątkowały pionierskie prace m.in. Pasteura i Kocha i innych
im współczesnych. Wyniki ich badań wykazały, że wzrost drobno-
ustrojów nie jest możliwy na podłożach każdego typu, a hodowla
mikroorganizmów jest trudna i wymaga nie tylko stosowania wielu
różnych substancji, ale co równie ważne – muszą one występować
w pożywce w odpowiednich proporcjach.

Summary
In the microbiological laboratory the results are relative to the
selection of high quality media what warrants the procurance
of constant and repeatable results. The pioneering works with
culture of micro-organisms on media prepared in laboratory were
initiated in the end of XIX century by Pasteur, Koch and others.
They showed that the growth of microbes was not possible on
every type of media and depends on a composition as well as
the proportion of substances.

Słowa kluczowe
pożywki mikrobiologiczne, bezpieczeństwo, kontrola

Key words
media, safety, control

Pożywki mikrobiologiczne

...w laboratorium | temat numeru MIKROBIOLOGIA

Laboratorium |

6

/2007

18

czas trwania badania oraz były bezpieczne dla personelu laborato-
rium. W latach 80. minionego wieku opracowano pożywki zawiera-
jące w swoim składzie substraty fluorogenne, jak na przykład MUG
(4-metylumberillferyl-b-D-glukuronian) w pożywkach dla Escherichia coli,
lub chromogenne pozwalające na różnicowanie i identyfikację drobno-
ustrojów w obrębie pałeczek z grupy coli, drożdży z rodzaju Candida,
czy np. pomiędzy paciorkowcami kałowymi a enterokokami.

Obecnie laboratoria mikrobiologiczne mają do dyspozycji wiele

różnych pożywek zarówno gotowych do użycia, jak i w formie od-
wodnionej, z których przygotowuje się pożywki w postaci płynnej lub
stałej. Ze względu na swój skład i konsystencję wyróżniamy pożywki
izolacyjne, namnażające, wybiórczo namnażające, wybiórczo izolacyjne,
różnicujące, pożywki do przechowywania oraz podłoża transportowe.
Niektóre z nich mogą być zaliczone do wielu kategorii, jak chociażby
Columbia agar z dodatkiem krwi.

Asortyment pożywek proponowany przez wytwórców pokrywa

znaczną część zapotrzebowania laboratoriów pracujących na rzecz
mikrobiologii klinicznej, przemysłu spożywczego, farmaceutycznego
i kosmetycznego. Oczywiście oferta zależy od wytwórcy i może być kie-
rowana w większym lub mniejszym stopniu do określonego odbiorcy.
Lista proponowanych pożywek jest stale uzupełniana o nowe pozycje
w związku z podążaniem przez firmy za zmianami w obowiązujących
dokumentach normatywnych, których przedstawiciele biorą niejedno-
krotnie aktywny udział w opracowywaniu tych dokumentów.

Najbardziej popularne są przede wszystkim pożywki w formie goto-

wej do użycia posiadające certyfikaty producenta, potwierdzające ich
odpowiednią jakość lub pożywki złożone w formie proszków lub gra-
nulatów (podłoża odwodnione) do przygotowania w laboratorium, dla
których dostarczany jest certyfikat dla postaci końcowej, potwierdzają-
cy możliwość uzyskania pożywki odpowiedniej jakości pod warunkiem
przestrzegania procedury przygotowania określonej przez producenta.
Ze względu na znaczne nakłady pracy i materiałów, głównie na etapie
kontroli, najmniej popularne są pożywki składane w laboratorium
z pojedynczych składników, stosowane w odpowiednich sytuacjach,
gdy brak odpowiednich pożywek w formie gotowej lub sproszkowanej
lub w badaniach specjalnych (doświadczalnych).

Pracując z pożywkami odwodnionymi, należy mieć na uwadze

bezpieczeństwo personelu. Wdychanie pyłu w trakcie ważenia może
być szkodliwe ze względu na zawartość substancji toksycznych, jak
np. soli kwasów żółciowych, azydków, barwników itp. Rozwiązaniem,
które ograniczyło pylenie w trakcie naważania, była granulacja pożywek.
Innym zagadnieniem związanym z bezpieczeństwem było ogranicze-
nie ryzyka przenoszenia czynnika odpowiedzialnego za pasażowalne
gąbczaste encefalopatie (TSE) przez odwodnione pożywki lub inne
substancje wyjściowe pochodzenia zwierzęcego poprzez zastąpienie
ich surowcami o niskim ryzyku lub surowcami pochodzenia ro-
ślinnego, pozostając tym samym w zgodzie z wytycznymi EDQM
i Dyrektywami EU.

Stabilność pożywek przygotowywanych w laboratorium jest

znacznie ograniczona. Pożywki na płytkach, w probówkach lub
butelkach, które nie zostaną zużyte bezpośrednio po przygotowaniu,
powinny być przechowywane w sposób chroniący je przed światłem
i wysychaniem. Dla większości pożywek na płytkach optymalnymi
warunkami przechowywania jest temperatura 4-12

o

C w opakowaniu

ograniczającym wysychanie. Jednak w niektórych przypadkach, jak np.
pożywki zawierające krew, emulsję żółtka jaja kurzego lub antybiotyki,
korzystniejsza jest temperatura 2-8

o

C.

Utrata powyżej 15% wody podczas przechowywania lub w trakcie

inkubacji może niekorzystnie wpływać na wzrost drobnoustrojów,

szczególnie Gram-ujemnych. Również pożywki płynne w probówkach
lub butelkach należy przechowywać szczelnie zamknięte ponieważ
ubytek wody może prowadzić do wytrącania się substratów.

W przypadku pożywek, w skład których wchodzą niestabilne sub-

stancje, lepszym rozwiązaniem jest przygotowanie i przechowywanie
pożywki bez takich substratów i dodanie ich bezpośrednio przed
użyciem. Termin przydatności pożywek zależy od jakości surowców,
składu, sposobu przygotowania, rodzaju opakowania oraz warunków
przechowywania. Dla każdej z pożywek pożądane jest określenie
takiego terminu w badaniach stabilności.

Ważnym zagadnieniem jest kontrola jakości pożywek. Zakres takiej

kontroli zależy od rodzaju pożywki. Dokument EA-04/10 przygotowa-
ny przez grupę roboczą ds. żywności przy komitecie ds. Laboratoriów
w rozdziale 7 odnoszącym się do punktów 4.6 i 5.5 normy PN-EN
ISO/IEC 17025 zaleca, aby laboratoria zagwarantowały, że do badań
są stosowane odczynniki odpowiedniej jakości, dlatego też wymagane
jest przeprowadzenie kontroli każdej partii odczynników mających
kluczowe znaczenie dla określonych badań, stosując drobnoustroje
kontrolne pochodzące z uznanych kolekcji kultur. Zalecenia te dotyczą
nie tylko pożywek przygotowywanych w laboratoriach ale również
tych kupowanych w postaci gotowej do użycia o ile ich producent nie
posiada uznanego systemu jakości. W przypadku pożywek gotowych do
użycia lub częściowo przygotowanych od producentów posiadających
taki system, np. zarejestrowany system z serii ISO 9000, kontrola może
być ograniczona zgodnie z zasadą oczekiwania stałej jakości. Ogólne
informacje dotyczące kontroli pożywek mikrobiologicznych zawarte
są w normach EN 11133 cześć 1 i część 2 oraz PN-EN 12322, nato-
miast szczegółowych należy poszukiwać w normach przedmiotowych
w zakresie prowadzonych badań.

‰

19

temat numeru MIKROBIOLOGIA | ...w laboratorium

Laboratorium |

6

/2007

19