Medycyna Wet. 2007, 63 (8)

990

Praca oryginalna

Original paper

U ró¿nych gatunków zwierz¹t miejscem bogatym

w enzymy umo¿liwiaj¹ce interakcjê gamet w czasie

zap³odnienia jest akrosom plemnika. To w³aœnie w nim

stwierdzono obecnoϾ proteinaz serynowych, tiolo-

wych, arylowych, karboksylowych oraz metaloprote-

inaz (3). Wiele z nich bierze równie¿ udzia³ w proce-

sie regulacji ruchu plemników, jak równie¿ w degra-

dacji starzej¹cych siê plemników w naj¹drzach (6, 14).

Najbardziej poznanym, a zarazem najwa¿niejszym

enzymem branym pod uwagê przy ocenie jakoœci na-

sienia nale¿¹cym do proteinaz serynowych – enzymów

proteolitycznych maj¹cych w swym centrum aktyw-

nym serynê, jest akrosyna (12). Ten trypsynopodobny,

zwi¹zany z b³on¹ wewnêtrzn¹ akrosomu plemnika

enzym bierze bezpoœredni udzia³ w procesie zap³od-

nienia ssaków, poprzez katalizowanie reakcji hydroli-

tycznego rozpadu os³onki przejrzystej komórki jajo-

wej (11) oraz uczestniczy w dyspersji matrix akroso-

mu i przy³¹czania plemników do zona pellucidda (12).

Istotn¹ rolê w regulacji aktywnoœci akrosyny pe³ni¹

obecne w plazmie nasienia inhibitory tego enzymu (8),

zaadsorbowane na zewnêtrznej powierzchni b³ony

plazmatycznej plemników. Inhibitory te (dziêki posia-

danej du¿ej zdolnoœci wi¹zania siê z akrosyn¹ lub tryp-

syn¹) s¹ naturalnymi antagonistami akrosyny. G³ówn¹

funkcj¹ inhibitorów akrosyny jest ochrona bia³ek na-

sienia i tkanek uk³adu rozrodczego przed proteolitycz-

nym i immunogennym dzia³aniem tego enzymu, uwal-

nianego z uszkodzonych lub obumar³ych plemników

(11). W takich przypadkach uwalniana akrosyna jest

trwale wi¹zana przez te inhibitory. Ich zawartoœæ

w plazmie nasienia uzale¿niona jest od gatunku, a na-

wet od wieku zwierz¹t (10). Wed³ug Torskiej (12),

w ejakulowanych plemnikach cz³owieka, knura czy try-

ka molowa zawartoœæ inhibitorów odpowiada molo-

wej zawartoœci akrosyny.

W nienaruszonym akrosomie, akrosyna wraz z na-

turalnymi inhibitorami oraz z form¹ zymogenow¹, tzw.

proakrosyn¹, stanowi system akrosynowy plemników

(4). W plemnikach ejakulowanych prawie ca³a akro-

syna wystêpuje w formie nieaktywnej. Dopiero po

uszkodzeniu akrosomu czy to w czasie reakcji akro-

somowej, czy te¿ pod wp³ywem niekorzystnych wa-

runków œrodowiska proakrosyna aktywowana jest do

akrosyny (3). Dlatego te¿ odpowiednia zawartoœæ pro-

akrosyny i akrosyny w plemnikach jest wskaŸnikiem

stabilnoœci akrosomów i mo¿e byæ wykorzystana jako

biochemiczny test w ocenie jakoœci nasienia konser-

wowanego (1).

W dostêpnej literaturze wiadomoœci o pozosta³ych

proteinazach obecnych w akrosomie plemnika s¹

przedstawiane w sposób fragmentaryczny. Do mniej

poznanych proteinaz o specyficznoœci trypsynowej

mo¿na zaliczyæ wykryty w plemnikach cz³owieka sys-

tem sperminogen-spermina czy w plemnikach buhaja

inhibinê. SH-proteinazê zaliczan¹ do grupy proteinaz

AktywnoϾ inhibitora trypsyny w plazmie nasienia

lisa polarnego w sezonie rozrodczym

KAROLINA STASIAK, BOGDAN JANICKI

Katedra Biologii Ma³ych Prze¿uwaczy i Biochemii Œrodowiska Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t ATR,

ul. Mazowiecka 28, 85-024 Bydgoszcz

Stasiak K., Janicki B.

Activity of the trypsin inhibitor on the semen plasma of the polar fox Alopex lagopus L.

during the reproductive season

Summary

The aim of this work was to determine the activity of the akrosin inhibitor on the basis of depressing the

tripsin activity of polar fox (Alopex lagopus) semen and to follow the changes that affect these properties

throughout the whole reproductive season. Additionally, the molecular forms of the inhibitor were electro-

phoretically separated. The research covered 126 ejaculates obtained manually seven times from 18 polar

foxes (at intervals of 10-12 days). The highest inhibitor activity was observed in the seminal plasma from the

ejaculates obtained in the first sample, the lowest results were characteristic of the fifth sample. The lowest

activity of the akrosin inhibitor, determined on the basis of depressing the tripsin activity, indicates either the

weakest protection of the semen proteins along with the whole reproductive system from the influence of the

akrosin devoid of damaged acrosomes or the already initiated process of proteolysis.

Keywords: fox, Alopex lagopus, seminal plasma, trypsin inhibitor

Medycyna Wet. 2007, 63 (8)

991

tiolowych wyizolowano z plemników wiêkszoœci ga-

tunków zwierz¹t hodowlanych. Natomiast proteinazy

karboksylowe zwane inaczej kwaœnymi poznano dziêki

wyizolowanej z j¹der królika proakrozyminy (3).

Celem badañ by³o okreœlenie: a) aktywnoœci inhibi-

tora akrosyny w plazmie nasienia lisa polarnego na

podstawie hamowania aktywnoœci trypsyny oraz prze-

œledzenie zmian, jakim ten parametr podlega w okre-

sie sezonu reprodukcyjnego, b) form molekularnych

inhibitora trypsyny.

Materia³ i metody

Materia³em badawczym by³o nasienie pobrane siedmio-

krotnie od osiemnastu lisów polarnych Alopex lagopus L.

pochodz¹cych z fermy zwierz¹t futerkowych w £achowie

k. Szubina w województwie kujawsko-pomorskim. Próbki

nasienia pozyskiwano od samców metod¹ manualn¹ przez

ca³y okres wzmo¿onej aktywnoœci p³ciowej, tj. od po³owy

lutego do po³owy kwietnia 2003 roku, w odstêpach 10-12-

-dniowych, uzyskuj¹c ogó³em 126 ejakulatów. Po odwiro-

waniu plemników z ejakulatów (10 minut przy 8000 × g)

pozyskano plazmê nasienia, w której oznaczono aktywnoœæ

inhibitorów akrosyny na podstawie hamowania aktyw-

noœci trypsyny, a tak¿e wykonano profile elektroforetycz-

ne form molekularnych inhibitora. Powy¿sze badania wy-

konano w Instytucie Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoœci

PAN w Olsztynie.

Oznaczanie spektrofotometryczne inhibitora znajduj¹ce-

go siê w plazmie nasienia wykonano w kuwetach polisty-

renowych, za pomoc¹ spektrofotometru firmy Beckman

(lampa vis, faktor 980,50). W tym celu sporz¹dzono taki

roztwór trypsyny, w którym aktywnoœæ tego enzymu wy-

nosi³a oko³o 36-40 U/l (ok. 6 mg trypsyny wo³owej roz-

puszczono w 300 cm

3

buforu Tris-HCl o stê¿eniu 0,05

molowym i pH 8,2). Podczas oznaczania aktywnoœci spo-

rz¹dzony roztwór przechowywano w lodzie. Po kalibracji

aparatu przyst¹piono do oznaczenia inhibitora w badanych

próbkach. W tym celu plazmê lisów polarnych rozcieñczo-

no 200 × buforem Tris-HCl. Dalszy sposób przygotowania

próbek zosta³ przedstawiony w tab. 1. Po 5-minutowej in-

kubacji próbek (temp. 25°C) w spektofotometrze do ka¿-

dej z kuwet dodano po 0,1 cm

3

roztworu BAPNA (do

0,0217 g BAPNA dodano 2,5 cm

3

DMSO, a po rozpusz-

czeniu 7,5 cm

3

buforu Tris-HCl), wymieszano ich zawar-

toœæ i dokonano pomiaru przy d³ugoœci fali 410 nm co

1 minutê przez 5 minut. Zebrane wyniki aktywnoœci po pod-

stawieniu do wzoru: (aktywnoϾ wzorcowa РaktywnoϾ

inhibitorowa próbki) × rozcieñczenie plazmy przedstawio-

ne by³y w postaci U/l.

Elektroforetyczne wykrywanie aktywnoœci inhibitorów

trypsyny przeprowadzono na ¿elach poliakrylamidowych

o ró¿nej gêstoœci, zgodnie z metodyk¹ opracowan¹ przez

Laemmli’ego (7), z zastosowaniem aparatu do elektrofore-

zy pionowej Mighty Small II firmy Amersham Pharmacia

Biotech. (Szwecja). Rozdzielenia bia³ek dokonano dwoma

ró¿nymi sposobami: za pomoc¹ elektroforezy niedenatu-

ruj¹cej, zwan¹ inaczej natywn¹ i denaturuj¹cej (z dodat-

kiem dodecylo siarczanu sodu – SDS).

Elektroforeza natywna (bez dodatku SDS) pozwala roz-

dzieliæ bia³ka ze wzglêdu na gêstoœæ ich ³adunku. Brak de-

tergentu w postaci SDS powoduje utrzymanie bia³ka w sta-

nie niezdenaturowanym. Rozdzia³y elektroforetyczne prze-

prowadzono na 10% ¿elach poliakrylamidowych. Przed

elektroforez¹ próbki plazmy nasienia mieszano z buforem

obci¹¿aj¹cym w stosunku 1 : 1. Na ¿el nanoszono po 21 µl

próby. Rozdzia³y przeprowadzono w buforze Tris-glicyna

o pH 8,3 przy 20 mA i 200 V przez 85 minut. Po zakoñcze-

niu elektroforezy ¿ele inkubowano w roztworze trypsyny

wo³owej (1,5 mg trypsyny wo³owej w 25 cm

3

0,1 molowe-

go buforu fosforanowego pH 7,4/1 ¿el) przez 15 minut

w temperaturze 37°C. Nastêpnie zlano roztwór trypsyny,

a ¿ele zalano mieszanin¹ barwi¹c¹ (13).

Masy molekularne rozdzielonych bia³ek oznaczono me-

tod¹ elektroforezy denaturuj¹cej (SDS-PAGE). Rozdzia³y

przeprowadzano na 12,5% ¿elach poliakryloamidowych

z dodatkiem SDS, dziêki któremu bia³ka w plazmie nasie-

nia zostaj¹ rozbite na podjednostki – ³añcuchy polipepty-

dowe. Przed elektroforez¹ próby plazm nasienia rozcieñ-

czono roztworem soli fizjologicznej w stosunku 1 : 3,

a nastêpnie uzyskany roztwór zmieszano z buforem do przy-

gotowania prób z dodatkiem SDS i DTT (ditiotreitol)

w stosunku 1 : 1. Z przygotowanej mieszaniny pobrano

0,005 cm

3

i naniesiono do odpowiednich studzienek w ¿elu.

Równolegle naniesiono mieszaninê standardów firmy

Bio-Rad: fosforylaza B (110,0 kDa), albumina surowicy

wo³owej (90,0 kDa), albumina jaja kurzego (51,2 kDa), an-

hydraza wêglanowa (36,2 kDa), sojowy inhibitor trypsyny

(29,0 kDa) i lizozym (21,4 kDa). Rozdzia³ elektroforetycz-

ny bia³ek plazmy nasienia przeprowadzono przy sta³ym

natê¿eniu 40 mA i napiêciu o wartoœci 200 V. Po zakoñ-

czeniu elektroforezy (oko³o 90 minut) ¿ele umieszczono

w 100 cm

3

roztworu barwi¹cego, na 18 godzin w tempera-

turze pokojowej. Nastêpnie nadmiar barwnika wyp³ukano

z ¿elu rozpuszczalnikiem o sk³adzie woda : metanol : kwas

octowy w proporcji 8 : 2 : 1, do uzyskania bezbarwnego

t³a. Z tak przygotowanego elektroforogramu, na podstawie

mas molekularnych wzorców, wyznaczono masy cz¹stecz-

kowe rozdzielonych frakcji bia³kowych. Masy moleku-

larne frakcji bia³kowych by³y oceniane przy u¿yciu pro-

gramu Kodak 1D (Eastman Kodak company, New Haven,

USA).

Uzyskane wyniki aktywnoœci inhibitora nie spe³nia³y

za³o¿eñ o normalnoœci rozk³adu i jednorodnoœci wariancji,

dlatego szacowanie statystycznej istotnoœci oddzia³ywania

terminu pobrania nasienia na wartoœci aktywnoœci wyko-

nano z wykorzystaniem nieparametrycznej jednoczynniko-

wej analizy wariancji (test Kruskala-Wallisa). Obliczenia

statystyczne uzyskanych wyników wykonano przy pomo-

cy programu Statistica 5.0 oraz Microsoft Excel 2003.

k

i

n

n

y

z

c

d

O

c

e

z

r

o

z

W

m

c

(

3

)

a

n

a

d

a

B

m

c

(

a

k

b

ó

r

p

3

)

y

n

i

m

u

b

l

a

g

3

8

0

,

0

o

d

(

¹

n

i

m

u

b

l

a

z

r

o

f

u

B

m

c

0

5

o

n

a

d

o

d

j

e

w

o

³

o

w

3

)l

C

H

-

s

ir

T

u

r

o

f

u

b

0

3

,

0

5

2

,

0

l

C

a

C

2

a

i

n

p

a

w

u

k

r

o

l

h

c

r

ó

w

tz

o

r

M

2

,

0

(

)l

C

H

-

s

ir

T

e

z

r

o

f

u

b

w

y

n

o

z

c

z

s

u

p

z

o

r

5

0

,

0

5

0

,

0

j

e

w

o

³

o

w

y

n

y

s

p

y

rt

r

ó

w

tz

o

R

5

0

,

0

5

0

,

0

)

a

n

o

z

c

ñ

e

i

c

z

o

r

o

i

n

d

e

i

w

o

p

d

o

(

a

m

z

a

l

P

–

5

0

,

0

Tab. 1. Przygotowanie próbek do oznaczenia

Medycyna Wet. 2007, 63 (8)

992

Wyniki i omówienie

Oznaczona w plazmie nasienia lisa polarnego, œred-

nia aktywnoœæ inhibitora trypsyny dla ca³ego sezonu

rozrodczego wynosi³a 3305,71 U/l. Najwy¿sz¹ aktyw-

noϾ inhibitora stwierdzono w plazmie nasienia z eja-

kulatów uzyskanych podczas pierwszego pobrania

4296,48 U/l, natomiast najni¿sz¹ charakteryzowa³y siê

próby pozyskane w pobraniu pi¹tym 2089,83 U/l

(ryc. 1). Uzyskane wartoœci aktywnoœci inhibitora tryp-

syny ró¿ni³y siê statystycznie istotnie (przy p £ 0,001)

w zale¿noœci od terminu pobrania, co potwierdzi³ za-

stosowany test nieparametryczny. Najbardziej nieko-

rzystnym wydaje siê pobranie pi¹te, gdzie oznaczona

aktywnoœæ inhibitora jest najni¿sza, co z kolei œwiad-

czy o najs³abszej ochronie bia³ek nasienia i ca³ego

uk³adu rozrodczego przed dzia³aniem uwolnionej

z uszkodzonych akrosomów – akrosyny lub o rozpo-

czêtej ju¿ proteolizie. Uzyskane wartoœci aktywnoœci

inhibitora trypsyny skorelowano z innymi parametra-

mi biochemicznymi. Dziêki wyznaczonym zale¿noœ-

ciom oraz uzyskanym dodatnim i statystycznie istot-

nym wspó³czynnikom korelacji z koncentracj¹ plem-

ników (r = 0,65, przy p £ 0,01), z aktywnoœci¹ fosfa-

tazy alkalicznej (r = 0,81, przy p £ 0,01) i kwaœnej

(r = 0,65, przy p £ 0,01) mo¿na stwierdziæ, ¿e za po-

chodzenie tych inhibitorów odpowiedzialne s¹ naj¹d-

rza. Z kolei wyznaczony wspó³czynnik korelacji miê-

dzy aktywnoœci¹ inhibitora a zawartoœci¹ bia³ka ogól-

nego w plazmie nasienia (r = 0,36, przy p £ 0,01) su-

geruje ochronê plemników przed proteoliz¹ podczas

przebywania ich w nasieniowodach (2).

Przeprowadzona elektroforeza natywna (bez œrod-

ków denaturuj¹cych) wykaza³a w plazmie nasienia

obecnoœæ trzech, ró¿ni¹cych siê tempem migracji,

molekularnych form inhibitora trypsyny (5). Na ryc. 2

przedstawiono bia³ka o aktywnoœci inhibitora w plaz-

mie nasienia pochodz¹cej od dziewiêciu losowo wy-

branych lisów podczas pierwszego pobrania. We

wszystkich próbach wykryto trzy ró¿ne formy tego

inhibitora, spoœród których tylko druga forma, o œred-

nim tempie migracji, stanowi³a szerokie pasmo. Po-

dobnej ocenie poddano plazmê nasienia pozyskan¹ od

dziewiêciu tych samych lisów podczas ostatniego –

siódmego pobrania (ryc. 3). Badane plazmy charakte-

ryzowa³y siê obecnoœci¹ form molekularnych inhibi-

tora trypsyny o najwiêkszym i œrednim tempie migra-

cji. W niektórych tylko przypadkach pojawi³a siê do-

datkowo trzecia forma tego inhibitora. Najbardziej

intensywnym, a zarazem najszerszym pasmem okaza-

³a siê, podobnie jak to by³o w pobraniu pierwszym,

forma o œrednim tempie migracji. Porównuj¹c plazmê

Ryc. 2. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoœci inhibito-

ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej

(plazmy pochodz¹ce od losowo wybranych lisów – pobranie

pierwsze)

Ryc. 3. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoœci inhibito-

ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej

(plazmy pochodz¹ce od losowo wybranych lisów – pobranie

siódme)

Ryc. 4. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoœci inhibito-

ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej

(plazmy pochodz¹ce losowo wybranego osobnika przez

wszystkie siedem pobrañ)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0

1

2

3

4

5

6

7

8

termin pobrania

aktywnoϾ

inhibitora

trypsyny

mediana

œrednia

min-max

Ryc.1 AktywnoϾ inhibitora trypsyny w plazmie nasienia lisa

polarnego w sezonie rozrodczym [U/l]

–

+

–

+

–

+

Medycyna Wet. 2007, 63 (8)

993

pozyskan¹ w dwóch pobraniach pod k¹tem obecnoœci

ró¿nych form molekularnych inhibitora wyraŸnie za-

uwa¿a siê zanik jednej z nich. W celu stwierdzenia,

od którego pobrania nastêpuje zanik tej formy, wyko-

nano obrazy elektroforetyczne aktywnoœci inhibitora

dla jednego osobnika przez wszystkie siedem pobrañ

(ryc. 4). Z uzyskanego elektroforogramu wynika, ¿e

trzy formy pojawiaj¹ siê w plazmie zawsze na pocz¹t-

ku sezonu rozrodczego. W póŸniejszych pobraniach

mo¿na stwierdziæ zanik formy inhibitora o najwolniej-

szym tempie migracji.

W celu oszacowania masy molekularnej inhibitora

w plazmie nasienia lisów polarnych zastosowano elek-

troforezê denaturuj¹c¹ (SDS-PAGE). U¿ytym marke-

rem by³a mieszanina szeœciu wzorców o ró¿nych ma-

sach molekularnych (110,0÷21,4 kDa). Na ryc. 5 przed-

stawiono rozdzielenie elektroforetyczne bia³ek w plaz-

mie nasienia pochodz¹cej od jednego osobnika przez

wszystkie siedem pobrañ. W wyniku rozdzia³u we

wszystkich przypadkach uzyskano dwa, ró¿ni¹ce siê

zabarwieniem pasma. W postaci ciemniejszych pasm

widoczne jest bia³ko o aktywnoœci esterazy (26,5 kDa),

natomiast jaœniejsze pr¹¿ki wykazywa³y cechy pro-

teinazy serynowej (23,6 kDa). Masa cz¹steczkowa tego

pasma podobna by³a do masy trypsyny, która w orga-

nizmach ssaków aktywuje i degraduje inne enzymy

(9, 14).

Podsumowanie

W dostêpnym piœmiennictwie niewiele uwagi po-

œwiêca siê aktywnoœci i formom molekularnym inhi-

bitora trypsyny obecnego w plazmie nasienia lisa po-

larnego, dlatego tym cenniejsze wydaj¹ siê wyniki

uzyskane w badaniach w³asnych. Autorzy wykazali

w badaniach elektroforetycznych obecnoϾ trzech form

inhibitora o ró¿nym tempie migracji w polu elektrycz-

nym. Pod koniec sezonu reprodukcyjnego obok wy-

raŸnego obni¿enia aktywnoœci tego bia³ka stwierdziæ

mo¿na spadek, a czasami wrêcz zanik formy inhibi-

Ryc. 5. Profil elektroforetyczny inhibitora trypsyny uzyskany w wyniku

elektroforezy SDS-PAGE (plazmy pochodz¹ce od jednego osobnika przez

wszystkie siedem pobrañ)

kDa

kDa
110,0

90,0

51,2

36,2

29,0

21,4

26,5

23,6

tora o najwolniejszym tempie migracji. Te

bia³ka inhibitorowe, syntetyzowane g³ów-

nie w naj¹drzach odpowiedzialne s¹ za blo-

kowanie aktywnoœci wolnej akrosyny, któ-

ra jako enzym proteolityczny mo¿e prowa-

dziæ do destrukcji plemników w mêskim

uk³adzie rozrodczym.

Dziêki prowadzonej kontroli aktywnoœci

inhibitora akrosyny (oznaczonego na pod-

stawie hamowania aktywnoœci trypsyny),

mo¿na w dowolnym momencie sezonu roz-

rodczego oceniæ jakoœæ pobranego nasienia.

Uzyskane wówczas wyniki staj¹ siê bardzo

przydatne w praktyce, gdy¿ ka¿dego hodow-

cê interesuje nasienie o wysokiej wartoœci

hodowlanej, na któr¹ sk³ada siê, miêdzy in-

nymi, wysoka aktywnoϾ inhibitora w plaz-

mie nasienia.

Piœmiennictwo

1.Borkowski K., Strze¿ek J.: Wykorzystanie wskaŸników biochemicznych do

oceny jakoœci nasienia tryka. Medycyna Wet. 1994, 50, 200-202.

2.Ciereszko A., Piros B., D¹browski K., Kucharczyk D., £uczyñski M. J.,

Dobosz S., Glogowski J.: Serine proteinase inhibitors of seminal plasma of

teleost fish: distribution of activity, electrophoretic profiles and relation to

proteinase inhibitors of blood. J. Fish Biol. 1998, 53, 1292-1305.

3.Èechova D.: Enzymy proteolityczne w akrosomie plemnika. Materia³y

letniej szko³y m³odych pracowników nauki nt. Fizjologiczne, biochemiczne

i immunologiczne zagadnienia mêskiego uk³adu rozrodczego oraz nasienia.

Biul. Infor. ART, Olsztyn 1988, nr 25, 97-104.

4.Glogowski J., Falkowski J., Rotkiewicz T.: AktywnoϾ fosfataz w plazmie

nasienia knurów w cyklu rocznym i ich zwi¹zek z podstawowymi wyznacz-

nikami jakoœciowymi ejakulatów. Rocz. Nauk. Zoot. 1997, 24, 85-95.

5.Kot³owska M., Kowalski R., Glogowski J., Jankowski J., Ciereszko A.:

Gelatinases and serine proteinase inhibitors of seminal plasma and the repro-

ductiven tract of turkey (Meleagris gallopavo). Theriogenology 2005, 63,

1667-1681.

6.Kowalski R., Wojtczak M., Glogowski J., Ciereszko A.: Gelatinolytic and

anti-trypsin activities in seminal plasma of common carp: relationship to

blood, skin mucus and spermatozoa. Aquat. Living Resour. 2003, 16, 438-

-444.

7.Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the

head bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685.

8.Lee C., Keefer M., Zhao Z. W., Kroes R., Berg L., Liu X. X., Sensibar J.:

Demonstration of the role of prostate-specific antigen in semen liquefaction

by two-dimensional electrophoresis. J. Andrology 1989, 10, 432-438.

9.Paju A., Bjartel A., Hang W.-M., Nordling S., Borgstrom A., Hansson J.,

Stenman U.-H.: Expresion and characterization of trypsinogen produced in

the human male genital tract. Amer. J. Pathol. 2000, 157, 2011-2020.

10.Strze¿ek J.: Wybrane uk³ady enzymatyczne nasienia zwierz¹t gospodarskich

w aspekcie doskonalenia jego konserwacji i p³odnoœci samców. Zesz. Probl.

Post. Nauk. Rol. 1987, 340, 9-40.

11.Œmigielska J., Strze¿ek J.: Aktywnoœæ inhibitorów akrosyny w plazmie

nasienia buhaja jako wskaŸnik oceny stanu b³on akrosomu. Zesz. Probl. Post.

Nauk. Rol. 1986, 263, 185-197.

12.Torska J.: W³aœciwoœci wysokocz¹steczkowych inhibitorów proteinaz

z plazmy nasienia buhaja. Zesz. Nauk. ART Olsztyn. Zootechnika 1989, 351,

supl. D.

13.Uriel J., Berges J.: Characterization of natural inhibitors of trypsin and

chymotrypsin by electrophoresis in acrylamide-agarose gels. Nature 1968,

218, 578-580.

14.Wojtczak M., Glogowski J., Ko³dras M., Kucharczyk D., Ciereszko A.:

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids.

Aquat. Living Resour. 2003, 16, 461-465.

Adres autora: dr in¿. Karolina Stasiak, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Byd-

goszcz; e-mail: [e-mail]

–

+