Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Badanie wpływu temperatury, pH, aktywatorów i inhibitorów na aktywność -amylazy

Wstęp

Szybkość reakcji enzymatycznej jest ściśle uzależniona od stężenia zarówno enzymu, jak i substratu. Nie są to jednak jedyne czynniki determinujące przebieg reakcji. Na katalityczne działanie enzymów mają również wpływ: pH, temperatura reakcji, w niektórych przypadkach potencjał redukcyjno-oksydacyjny środowiska, w którym zachodzi reakcja, obecność rozmaitych związków (koenzymów, aktywatorów, inhibitorów), a także siła jonowa i stała dielektryczna środowiska.

Wpływ temperatury na aktywność enzymów

Wzrost temperatury zwiększa szybkość reakcji enzymatycznych, ale tylko w pewnym zakresie. Ponieważ enzym jest substancją białkową, wzrost temperatury powyżej temperatury optymalnej dla jego działania powoduje stopniową denaturacje i zanik zdolności katalitycznych. Dla większości enzymów optymalna temperatura jest bliska 40°C. Znane są jednak przykłady enzymów, których optymalna temperatura jest zarówno wyraźnie wyższa, jak i niższa niż 40°C. Nadmierny wzrost temperatury zwiększa prawdopodobieństwo zrywania licznych słabych wiązań stabilizujących strukturę przestrzenną białka, w tym strukturę centrum katalitycznego. Szybkość inaktywacji enzymu zależy w pewnym stopniu od stężenia enzymu, pH środowiska reakcji oraz siły jonowej roztworu. Krzywa zależności aktywności enzymatycznej od temperatury posiada charakterystyczne maksimum, przy którym szybkość katalizowanej reakcji jest największa (Rys. 1). Dla większości enzymów zmiany denaturacyjne zachodzą bardzo intensywnie powyżej 45-50°C, jednakże są i takie, które wykazują znaczną odporność na inaktywujące działanie podwyższonej temperatury - cechuje je wysoka termostabilność. Termostabilność enzymu określa się, podając najwyższą temperaturę, w której nie dochodzi jeszcze do termicznej inaktywacji enzymu.

Rys. 1 Wpływ temperatury i pH środowiska na aktywność enzymu.

Wpływ pH na aktywność enzymów

Do utrzymania aktywności katalitycznej enzymy wymagają odpowiedniego pH środowiska. Dla większości enzymów optymalne jest pH 5,5 - 7,4. Znane są jednak enzymy, które działają najlepiej w środowisku kwaśnym (np. pepsyna w pH 1,5 - 2,7; fosfataza kwaśna pH 4 - 6) lub zasadowym ( trypsyna, chymotrypsyna - pH 7 - 9; fosfataza zasadowa pH 8-9 ). Dla jeszcze innych enzymów najkorzystniejsze jest środowisko bliskie obojętnego (dehydrogenaza mleczanowa pH 7,2; kinaza pirogronianowa pH 7,4). Uwzględniając odczyn środowiska wewnątrzkomórkowego, należy zauważyć, iż w organizmie nie wszystkie enzymy działają przy optymalnym pH. Zależność aktywności enzymów od pH środowiska jest więc jednym z istotnych czynników regulujących szybkość reakcji. Niewielkie zmiany pH nie dezaktywują enzymu, ale obniżają szybkość reakcji, ponieważ wpływając na stopień jonizacji enzymu i substratu, zmieniają warunki tworzenia się kompleksu enzym-substrat. Środowisko silnie kwaśne i silnie zasadowe z reguły działa denaturująco, niszcząc nieodwracalnie wiązania stabilizujące cząsteczkę enzymu i zmieniają jonizację reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym białka (Rys. 1).

Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność enzymów

Enzymy mogą podlegać zarówno inhibicji, jak i aktywacji przez różne specyficzne cząsteczki lub jony. Ma to szczególnie istotne znaczenie dla kontroli fizjologicznej ich działania w układach biologicznych. W ten sam sposób działa wiele leków i czynników toksycznych.

Większość enzymów wymaga dla zachowania swojej aktywności aktywatorów. Aktywatorami nazywamy związki niskocząsteczkowe, których obecność w miejscu katalizy enzymatycznej przyspiesza przebieg reakcji. Aktywatorami enzymów mogą być jony metali (np. Mn²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Ca²⁺, rzadziej Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺), czy aniony współdziałające z białkami (np. Cl^-). Jon metalu może być zlokalizowany w katalitycznym centrum enzymu (bierze wówczas bezpośredni udział w reakcji) lub też w innym fragmencie molekuły (stabilizuje wtedy jej aktywną konformację).

Substancje hamujące działanie enzymów to inhibitory reakcji enzymatycznych. Inhibicja enzymu może zachodzić pod wpływem małych cząsteczek lub jonów, zarówno nieodwracalnie jak i odwracalnie. W inhibicji nieodwracalnej inhibitor wiąże się kowalencyjnie z enzymem tak silnie, że jego dysocjacja jest niemożliwa. W inhibicji odwracalnej szybko osiągany jest stan równowagi w układzie enzym-inhibitor. Podstawowe typy odwracalnej inhibicji, to:

• Inhibicja kompetycyjna, kiedy inhibitor jest podobny do substratu i wiąże się w miejscu aktywnym enzymu, blokując wiązanie substratu. Inhibitor współzawodniczy z enzymem o centrum aktywne.

• Inhibicja niekompetycyjna, kiedy inhibitor wiąże się z cząsteczka enzymu w innym miejscu niż centrum aktywne enzymu. Następuje wtedy zmiana konformacji enzymu, która pociąga za sobą zmianę konformacji centrum aktywnego.

Niespecyficznymi inhibitorami enzymów są jony metali ciężkich (Cu, Pb, Hg, Ag). Wiążą się one łatwo i w sposób nieodwracalny ze wszystkimi białkami, powodując rozległe zmiany ich konformacji, prowadzące do denaturacji, której często towarzyszy wypadanie białka w postaci osadu. Szczególnie podatne na wiązanie jonów metali ciężkich są grupy sulfhydrylowe (-SH); metal może się również wbudować w mostek disiarczkowy.

Ogólna charakterystyka amylaz

Wśród enzymów katalizujących konwersje skrobi wyróżniamy:

• endoamylazy (amylazy dekstrynujące, tzw. -amylazy), rozcinające przypadkowo wewnętrzne wiązania ,1-4 glikozydowe amylozy i amylopektyny (frakcje skrobi). Wskutek działania -amylazy silnie spada lepkość produktów skrobiowych, gdyż rozkłada ona skrobie do -dekstryn o małej masie cząsteczkowej,

• egzoamylazy (amylazy scukrzające), rozkładające skrobie od końca łańcucha. Wśród nich wyróżnia się -amylazy, które rozkładają wyłącznie wiązanie -1,4 glikozydowe lub takie, które rozkładają zarówno wiązanie -1,4-, jak i -1,6 glikozydowe (amyloglukozydazy i glukoamylazy). W wyniku działania -amylazy powstają dekstryny o dużych cząsteczkach, tzw. amylodekstryny oraz znaczna ilość maltozy. Glukoamylaza rozkłada długołańcuchowe polisacharydy do glukozy, a glukozydaza - maltooligosacharydy.

• enzymy rozkładające wyłącznie wiązanie -1,6 glikozydowe: izoamylaza i pullulanaza typu I.

• transferazy rozcinające wiązanie -1,4 i przenoszące uzyskany w wyniku rozkładu sacharydu fragment do glikozydowego akceptora z utworzeniem nowego wiązania glikozydowego.

Amylazy są olbrzymią rodziną enzymów, wytwarzają je liczne drobnoustroje oraz organizmy roślinne i zwierzęce. W przemyśle znacząca rolę odgrywają przede wszystkim -amylazy, począwszy od przemysłu spożywczego, fermentacyjnego, lekkiego, a skończywszy na papierniczym. Źródłem enzymów dla tych przemysłów mogą być zarówno rośliny, jak i mikroorganizmy. Amylazy wykazują bardzo zróżnicowane właściwości. Tak np.: - i - amylazy roślinne mają odmienne optymalne warunki działania, tj. temperaturę i pH środowiska. -amylaza jest najbardziej aktywna w środowisku mało kwaśnym (pH 4,7 - 5,0) i w temp. 51 - 66°C, natomiast -amylaza jest aktywniejsza w środowisku bardziej kwaśnym, ale w niższej temperaturze (48 - 51°C). Podobnie bardzo zróżnicowane właściwości wykazują -amylazy wytwarzane przez różne mikroorganizmy (Tab. 1).

Tab. 2. Porównanie właściwości -amylaz produkowanych przez wybrane mikroorganizmy.

-amylaza katalizuje reakcję rozkładu wewnętrznego wiązania ,1-4 glikozydowego, powodując stopniowe rozszczepienie łańcuchów skrobi na coraz krótsze fragmenty, zwane dekstrynami. Przebieg tego etapu, zwanego etapem dekstrynowania, można śledzić dzięki barwnej reakcji zarówno nierozłożonej skrobi, jak i dłuższych dekstryn z roztworem jodu w jodku potasu. Nierozłożona skrobia potraktowana tym odczynnikiem zabarwia się na kolor ciemnoniebieski. Nieco krótsze od łańcuchów skrobi, łańcuchy dekstryn, zwane amylodekstrynami, zabarwiają się z J₂ w KJ na kolor fioletowy, a jeszcze krótsze produkty hydrolizy, zwane erytrodekstrynami barwią się podczas wspomnianej reakcji na kolor czerwono-brunatny. -amylaza degraduje powstałe erytrodekstryny do achrodekstryn, których łańcuchy są zbyt krótkie by reagować z J₂ w KJ. W kolejnym etapie hydrolizy achrodekstryny rozkładane są przez -amylazę do mieszaniny glukozy, maltozy i oligocukrów redukujących, zawierających do 5 reszt glukozy w cząsteczce.

Przebieg hydrolizy skrobi pod działaniem -amylazy można obserwować nie tylko za pomocą barwnej reakcji z roztworem jodu w jodku potasu. Wykorzystuje się w tym celu także metody pozwalające na pomiar przyrostu stężenia cukrów redukujących uwalnianych z substratu przez enzym. Jedną z nich jest metoda Millera z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNS), który w obecności cukrów redukujących przekształcany jest do kwasu 3-amino-5-nitrosalicylowego. Pomiar absorbancji następuje przy długości fali 540 nm. Stężenie cukrów redukujących odczytuje się z krzywej wzorcowej sporządzonej dla maltozy.

Wykonanie ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu jonów metali Cu²⁺, Ag²⁺ oraz Cl^- na aktywności -amylazy z Aspergillus oryzae oraz określenie optymalnych warunków działania enzymu ( temperatura, pH).

Materiały i sprzęt

1. Amylaza: 15mg  -amylazy Aspergillus oryzae rozpuścić w 10 ml wody.

2. 1% roztwór skrobi ziemniaczanej: odważyć 1 g skrobi i przygotować zawiesinę w ok. 10 ml wody, odmierzyć 90 ml wody i zagotować. Do wrzącej wody wlać zawiesinę skrobiową, zagotować i szybko schłodzić otrzymany 1 % kleik skrobiowy.

3. 0,2M Na₂HPO₄

4. 0,1M kwas cytrynowy

5. bufor fosforanowo-cytrynianowy o pH 5,5

6. 1% roztwór kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS): Przygotowując roztwór DNS w pierwszej kolejności przygotowano roztwory:

1g DNS w 20 ml H₂O - roztwór A

1,6g NaOH w 15 ml H₂O - roztwór B

Do roztworu A powoli wkraplać roztwór B i mieszaninę ogrzać na łaźni wodnej, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Następnie do ciepłego płynu - ciągle mieszając -dodać 30g winianu sodowo-potasowego. Roztwór uzupełnić do objętości 100 ml i w razie potrzeby przefiltrować.

7. 20 mM NaCl

8. 20 mM CuSO₄

9. 20 mM AgNO₃

10. łaźnia wodna: 35°C, 55°C, 80°C

11. pipeta szklana 10ml, pipety automatyczne: 200-1000l, 20-200l

1. Badanie wpływu pH na aktywność a-amylazy z Aspergillus oryzae

Oznaczenie aktywności enzymu

• Przygotować bufory fosforanowo-cytrynianowe zgodnie z tabelą:

Wyjściowe roztwory	Wartości pH
		3,0	4,0	5,0	5,5	6,0	7,0
		Objętości roztworów [ml]
0,2 M Na2HPO4	2	4	5,15	5,75	6,3	7,45
0,1 M kwas cytrynowy	8	6	4,85	4,25	3,7	2,55

• Przygotować siedem probówek na mieszaninę inkubacyjną. Do każdej dodać 0,5 ml 1% kleiku skrobiowego oraz 0,5 ml buforu o odpowiednim pH. Do wszystkich dodać 0,1 ml roztworu -amylazy. W próbie kontrolnej zastąpić bufor oraz enzym wodą. Reakcję prowadzić w temperaturze pokojowej przez 5 min.

• W celu zatrzymania reakcji enzymatycznej do probówek dodać 1 ml roztworu DNS i umieścić je na 5 min w łaźni wrzącej.

• Probówki schłodzić i dodać 10 ml wody.

• Zmierzyć absorbancję przy długości fali 530 nm

Wykonanie krzywej wzorcowej dla maltozy.

Wykonać roztwory maltozy w buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 6 według tabeli:

2% roztwór maltozy [ml]	bufor [ml]
0	2
0,1	1,9
0,2	1,8
0,3	1,7
0,4	1,6
0,5	1,5

Pobrać do probówek po 0,5ml przygotowanych roztworów maltozy, dodać 0,5ml buforu i 1ml DNS. Mieszaninę ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5minut i po schłodzeniu dodać 10 ml wody. Zmierzyć absorbancję roztworów na spektrofotometrze przy długości fali 530 nm wobec próby kontrolnej (woda zamiast maltozy).

2. Badanie wpływu temperatury na aktywność a-amylazy z Aspergillus oryzae

Przygotować dwie serie po 5 probówek oznaczonych A₁-A₅ i B₁-B₅ oraz próbę kontrolną . Do wszystkich dodać 0,5 ml 1% roztworu skrobi. Do serii A dodać 0,5 ml buforu o pH 5, zaś do serii B 0,5 ml buforu o pH 6. Do wszystkich dodać 0,1 ml roztworu -amylazy. W próbie kontrolnej zastąpić bufor oraz enzym wodą. Próbki umieścić w odpowiedniej temperaturze zgodnie z tabelą:

Seria A	Seria B	Temperatura [°C]
A1	B1	4	lodówka
A2	B2	20	Temp. pokojowa
A3	B3	35	łaźnia
A4	B4	55	łaźnia
A5	B5	80	łaźnia

• Reakcję prowadzić przez 5 min.

• W celu zatrzymania reakcji enzymatycznej do probówek dodać 1 ml roztworu DNS i umieścić je na 5 min w łaźni wrzącej.

• Probówki schłodzić i dodać 10ml wody.

• Zmierzyć absorbancję przy długości fali 530nm wobec K(-)

2. Badanie wpływu Cu²⁺, Ag²⁺ oraz Cl ^- na aktywność a-amylazy z Aspergillus oryzae

Mieszaniny inkubacyjne przygotować w probówkach zgodnie z danymi w tabelce:

Odczynniki	Oznakowanie probówek i objętości dodawanych roztworów [ml]
	K(-)	K(+)	C1	C2	C3
1% kleik skrobiowy	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Bufor o pH 6	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
woda	0,35	0,25	-	-	-
20 mM CuSO4	-	-	0,25	-	-
20 mM AgNO3	-	-	-	0,25	-
20 mM NaCl	-	-	-	-	0,25
Roztwór -amylazy	-	0,1	0,1	0,1	0,1

Reakcję prowadzić w temperaturze pokojowej zgodnie z procedurą opisaną w poprzednim punkcie.

Opracowanie wyników

1. Wyznaczyć aktywność - amylazy, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość maltozy (μM) uwolnionej podczas 1-minutowej hydrolizy 1 %-owej skrobi:

gdzie:

V - objętość, w której wyrażamy aktywność enzymu (1000 μl)

V pr - objętość próbki enzymu (100 l)

t - czas inkubacji (5 min)

E - odczytana wartość absorbancji

Em - wartość absorbancji dla 1 M maltozy

2. Wyznaczyć zależności JAA = f(pH) oraz JAA = f(temp). Na podstawie wykresów wyznaczyć optimum pH oraz temperatury dla -amylazy z Aspergillus oryzae.

3. Określić jak pH zmienia wrażliwość -amylazy na temperaturę, oszacować termostabilność enzymu.

4. Określić wpływ badanych związków na aktywność enzymu. Obliczyć procentowy stopień wzrostu lub spadku aktywności enzymu po dodaniu soli.

ENZYMOLOGIA - Badanie wpływu temperatury, pH, aktywatorów i inhibitorów na aktywność -amylazy

1

---