1

Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą oznaczania aktywności endopeptydaz na

przykładzie trypsyny.

Wprowadzenie

Peptydazy (hydrolazy peptydowe EC 3.4.) to enzymy, które rozrywają, przy udziale

cząsteczki wody, wiązania peptydowe łączące aminokwasy w peptydach i białkach. Reakcja

hydrolizy wiązania peptydowego prowadzi do odtworzenia grupy α-karboksylowej jednego, i

grupy α-aminowej drugiego aminokwasu. Peptydazy charakteryzują się niską specyficznością

wobec hydrolizowanego substratu, wykazują natomiast specyficzność wobec położenia

rozrywanego wiązania. Na tej podstawie wyróżnia się endopeptydazy (proteinazy), które

rozszczepiają wiązania peptydowe położone w pewnej odległości od końca łańcucha oraz

egzopeptydazy hydrolizujące wiązania peptydowe położone skrajnie. Egzopeptydazy

działające przy C-końcu peptydu nazywane są karboksypeptydazami, zaś te, które

odszczepiają aminokwas N-końcowy – aminopeptydazami. Znane są także omega peptydazy

rozrywające wiązania peptydowe położone zarówno przy N-, jak i C- końcu peptydu.

Endopeptydazy podzielono na podpodklasy na podstawie mechanizmu katalizy

powiązanego z budową centrum aktywnego tych enzymów na: serynowe (EC 3.4.21),

cysteinowe (EC 3.4.22), aspartylowe (EC 3.4.23), treoninowe (EC 3.4.25), metaloproteinazy

(EC 3.4.24) oraz proteinazy o nieznanym mechanizmie katalizy (EC 3.4.99). Wiedza

dotycząca sekwencji aminokwasowej peptydaz, wtórnej struktury oraz preferencji wobec

miejsca cięcia w substratach jest stale aktualizowana na stronie http://merops.sanger.ac.uk/.

Ze względu na miejsce działania, peptydazy dzieli się na wewnątrzkomórkowe

(lizosomalne/wakuolarne i cytozolowe) oraz pozakomórkowe (peptydazy wydzielane przez

komórki bakteryjne oraz zwierzęce peptydazy trawienne wydzielane do przewodu

pokarmowego). Do grupy peptydaz działających pozakomórkowo należy zaliczyć także

peptydazy syntetyzowane podczas kiełkowania w liścieniach i komórkach warstwy

aleuronowej ziarniaków zbóż, a następnie transportowane do bielma skrobiowego.

Peptydazy wewnątrzkomórkowe są odpowiedzialne przede wszystkim za regulację

wielkości puli białek w komórce, usuwanie białek nieprawidłowych i uszkodzonych, a także

2

za inicjację procesu apoptozy. Natomiast biologiczna rola peptydaz pozakomórkowych

działających w przewodzie pokarmowym zwierząt polega na wstępnej hydrolizie białek

pokarmowych. Do tej grupy enzymów zalicza się: pepsynę, podpuszczkę (syn. chymozyna,

rennina), trypsynę, chymotrypsynę, karboksypeptydazę A i elastazę. Z kolei roślinne

peptydazy syntetyzowane podczas kiełkowania nasion (głównie proteinazy cysteinowe oraz

karboksypeptydazy) hydrolizują białka zapasowe do peptydów i ostatecznie do

aminokwasów, transportowanych następnie do rosnącej siewki.

Endopeptydazy charakteryzują się niską specyficznością substratową, wykazują jednak

preferencje wobec charakteru łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie

peptydowe. Przykładowo chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe powstałe z udziałem grupy

karboksylowej aminokwasów aromatycznych (fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan) lub aminokwasów o

dużych, hydrofobowych łańcuchach bocznych np. metionina czy leucyna. Elastaza natomiast

rozszczepia wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy o niewielkich, pozbawionych ładunku

łańcuchach bocznych. Z kolei pepsyna wykazuje aktywność wobec wiązań peptydowych utworzonych

z udziałem grupy aminowej aminokwasów aromatycznych i kwaśnych oraz między waliną i leucyną

(Bańkowski 2006). Peptydazy trawienne syntetyzowane są w postaci nieaktywnych prekursorów

ulegających aktywacji proteolitycznej najczęściej inicjowanej przez trypsynę.

Trypsyna

(EC 3.4.21.4). Enzym ten, podobnie jak chymotrypsyna i elastaza, jest

zaliczany do podpodklasy proteinaz serynowych, których centrum aktywne tworzą łańcuchy

boczne seryny, kwasu asparaginowego i histydyny. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań

peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny (rys. 1A).

C

O

CH

NH

C

H

OH

CH

3

C

O

N

H

3

+

C

CH

NH

CH

2

CH

2

CH

2

N

H

NH

C

O

CH

NH

CH

2

CH

2

S

CH

3

C

O

CH

NH

3

+

NH

CH

2

CH

2

CH

2

CH

2

C

O

CH

N

CH

2

OH

H

Thr

Ser

Lys

Arg
er

trypsyna

trypsyna

Met

Ser – Ala – Asp – Gly – Lys – Met – Trp – Gly – Arg – Gly – Ala – Lys – Cys – Gly

Ser – Ala – Asp – Gly – Lys

Met – Trp – Gly – Arg

Gly – Ala – Lys – Cys – Gly

Rys. 1 Działanie trypsyny na białko: A) wiązania peptydowe hydrolizowane przez

trypsynę, B) uwalnianie peptydów o różnej długości.

A)

B)

trypsyna

3

Produktem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha z resztą

lizyny lub argininy na C-końcu (Rys. 1B).

Ze względu na specyficzność działania, enzym ten jest stosowany do rozszczepiania

białek na peptydy przed ich sekwencjonowaniem metodą Edmana – metoda ta pozwala na

poprawne ustalenie sekwencji peptydów zbudowanych maksymalnie z 50 aminokwasów.

Trypsyna jest syntetyzowana przez komórki trzustki w postaci nieaktywnego

prekursora (proenzymu) – trypsynogenu (pojedynczy łańcuch polipetydowy zawierający 247

reszt aminokwasowych), który ulega w jelicie cienkim aktywacji pod wpływem enterokinazy

jelitowej

(syn.

enteropeptydaza).

Proces

aktywacji

polega

na

odłączeniu

sześcioaminokwasowego odcinka prekursorowego, co powoduje zmiany konformacyjne

prowadzące do uzyskania przez cząsteczkę właściwości katalitycznych. Zaktywowane w ten

sposób cząsteczki trypsyny aktywują kolejne cząsteczki trypsynogenu oraz prekursory innych

peptydaz wydzielanych przez komórki trzustki do światła jelita cienkiego. Optimum pH

działania trypsyny zawiera się w granicach 7–9.

Metody oznaczania aktywności endopeptydaz

bazują na fotometrycznym pomiarze

ilości peptydów (produktów reakcji) uwolnionych z substratu białkowego przez enzym.

Pomiaru tego dokonuje się po usunięciu, przez wirowanie lub sączenie, z mieszaniny

poreakcyjnej pozostałości substratu:

bezpośrednio:

- przy 280 nm - pomiar pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przez

wiązania peptydowe oraz pierścienie aromatyczne łańcuchów bocznych aminokwasów

- przy 340 nm dla produktów hydrolizy barwnych białek azowanych (białka poddane

reakcji sprzęgania z diazowanym kwasem sulfanilowym podstawianym do reszt histydyny i

tyrozyny)

pośrednio, po przeprowadzeniu reakcji zachodzącej pomiędzy łańcuchami bocznymi

aminokwasów zawartych w uwolnionych peptydach a odczynnikami dającymi barwny

produkt.

Zasada

metody Ansona. Metoda ta polega na pomiarze ilości tyrozyny i tryptofanu

zawartych w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (kazeina). Peptydy te, w

odróżnieniu od białek, są rozpuszczalne w 3-proc. kwasie trichlorooctowym. Wytrącone

kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie.

Enzymatyczną hydrolizę białka (substratu) prowadzi się w pH 8,6 i temp. 37°C.

Oznaczenie zawartości tyrozyny i tryptofanu w uwolnionych przez enzym peptydach

4

wykonuje się przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenie jest wprost

proporcjonalne do ilości tyrozyny i tryptofanu w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika

fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do

błękitu fosforomolibdenowego, zachodzącej pod wpływem wymienionych aminokwasów.

Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc pochłanianie (absorbancję)

promieniowania świetlnego o długości fali 670 nm.

Miarą aktywności trypsyny będzie ilość µmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych

peptydach.

Odczynniki

1.

0,1-molowy bufor Tris–HCl o pH 8,6 (500 ml 0,2-molowego roztworu Tris-

(hydroksymetylo)aminometanu doprowadzić do pH 8,6 za pomocą 1-molowego kwasu

solnego i uzupełnić wodą destylowaną do 1 litra)

2.

1% (w/v) roztwór kazeiny w 0,1 molowym buforze Tris-HCl o pH 8,6 (rozpuszczać na

mieszadle magnetycznym w czasie 45 minut, zmierzyć pH)

3.

Odczynnik Folina (Ciocalteu) rozcieńczony czterokrotnie wodą.

4.

0,5-molowy wodorotlenek sodowy.

5.

7,5-proc. roztwór kwasu trichlorooctowego (przechowywać w lodówce).

Wykonanie

Oznaczenie

1.

Hydroliza enzymatyczna kazeiny.

Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór trypsyny dopełnić do kreski 0,1-

molowym buforem Tris-HCl (1) i dobrze wymieszać. Do trzech enzymatycznie czystych

probówek (dwie próby pełne i jedna kontrolna) odmierzyć po 2 ml roztworu kazeiny (2) i

umieścić je w łaźni wodnej w temp. 37°C. Po około 5 minutach do dwóch probówek z

kazeiną (próby pełne) dodać po 1 ml enzymu z kolby miarowej na 10 ml, szybko

wymieszać i inkubować wszystkie trzy próby w temp. 37°C dokładnie przez 15 minut.

Następnie do wszystkich trzech prób dodać po 2 ml kwasu trichlorooctowego (5), wyjąć

probówki z łaźni wodnej i do próby kontrolnej dodać 1 ml enzymu z kolby miarowej na 10

5

ml. Wszystkie trzy próby wymieszać i pozostawić przez 30 minut w temperaturze

pokojowej w celu całkowitego wytrącenia osadu białka. Próby przesączyć do czystych

probówek przez sączki bibułowe.

2.

Fotometryczne oznaczanie tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej

Do kolejnych trzech czystych probówek odmierzyć po 1 ml klarownego przesączu z

dwóch prób pełnych i z próby kontrolnej. Do wszystkich trzech probówek dodać po 2 ml

0,5-molowego wodorotlenku sodowego (4) oraz po 0,6 ml odczynnika Folina (3) -

zawartość probówek dobrze wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję prób pełnych

w fotometrze przy długości fali 670 nm ustawionym na zero wobec próby kontrolnej.

Obliczenie aktywności trypsyny

1.

Obliczyć średnią wartości absorbancji prób pełnych.

2.

Posługując się obliczoną różnicą absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej ilość µmoli

tyrozyny zawartej w 1 ml przesączu.

3.

Obliczyć aktywność enzymu w µmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w

warunkach metody w ciągu 1 min przez 1 mg trypsyny [µmole tyrozyny × min.

-1

×

mg

trypsyny

-1

] uwzględniając:

a.

schemat rozcieńczeń trypsyny podany przez prowadzącego zajęcia

b.

czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu .

Przykładowe obliczenia:

Absorbancja

próby pełnej

nr 1

Absorbancja

próby pełnej

nr 2

Ś

rednia

absorbancja

Ilość µmoli tyrozyny odczytana z krzywej

wzorcowej dla średniej absorbancji

0,182

0,188

0,185

0,2

Ś

rednia absorbancja prób pełnych wynosi 0,185, czyli w 1 ml przesączu znajduje się 0,2

µmola tyrozyny.

Ponieważ do reakcji barwnej pobrano 1 ml z 5 ml przesączu, ilość tyrozyny zawartej w

peptydach uwolnionych z substratu przez 1 ml trypsyny wynosi 1 µmol. Aktywność trypsyny,

zawartej w 10 ml roztworu, jest więc równa 10 µmolom tyrozyny. Wiedząc, że przed

uzupełnieniem do objętości 10 ml kolbka zawierała 2 ml roztworu trypsyny przygotowanego

6

przez rozpuszczenie 7 mg tego enzymu w 40 ml buforu możemy obliczyć aktywność trypsyny

w następujący sposób:

•

aktywność 2 ml wyjściowego roztworu trypsyny wynosi 10 µmoli tyrozyny.

•

aktywność 7 mg trypsyny jest równa 200 µmoli tyrozyny

•

aktywność 1 mg trypsyny wynosi 28,57 µmoli tyrozyny, a po uwzględnieniu czasu

trwania reakcji enzymatycznej wynoszącego15 minut, aktywność ta będzie równa 1,91

µmola tyrozyny × min.

-1

× mg trypsyny

-1

.

Pytania

1.

Jakie kryteria podziału stosuje się wobec peptydaz?

2.

Czym różnią się karboksypeptydazy od aminopeptydaz? Przedstaw wzór dowolnego

tripeptydu i wskaż wiązanie peptydowe, które może rozerwać aminopeptydaza.

3.

Wymień peptydazy działające w przewodzie pokarmowym i krótko je scharakteryzuj.

4.

Podaj miejsce syntezy trypsynogenu i omów jego aktywację.

5.

Jaką rolę w aktywacji trypsynogenu pełni enterokinaza?

6.

Jakie praktyczne zastosowanie znalazła trypsyna w badaniach biochemicznych?

7.

Omów metodę oznaczania aktywności trypsyny na ćwiczeniu. Jaką role spełnia w tej

metodzie kwas trichlorooctowy (TCA)?

8.

Przedstaw, używając trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów, fragment łańcucha

polipeptydowego i wskaż miejsce działania trypsyny.

Literatura

1.

Anson, M.L. (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89.

2.

Chen J-M., Kurko Z., Le Marechal C., Toth C., Tsakiris L., Raguenes O., Ferec C.,

Sahin-Toth M. (2003) Mol. Biol. Evol. 20(11), 1767-1777

3.

Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006