Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej

background image

Badanie szybko

ś

ci hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywno

ś

ci lipazy

trzustkowej

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy

trzustkowej z użyciem śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości

katalizowanej reakcji zależnie od czasu jej trwania.

Wprowadzenie

Lipazy (EC 3.1.) to enzymy klasy hydrolaz, podklasy esteraz katalizujące reakcję hydrolizy wiązań

estrowych triacylogliceroli (TAG) nierozpuszczalnych w wodzie. Reakcja ta zachodzi na styku

fazy wodnej ( lipazy) z fazą lipidową (substratu) prowadząc do powstania kwasów tłuszczowych,

diacylogliceroli (DAG), monoacylogliceroli (MAG) i glicerolu.

Enzymy te odznaczają się niską specyficznością substratową gdyż odpowiadają za rozkład estrów

utworzonych przez kwasy tłuszczowe o krótkim lub długim łańcuchu zarówno nasycone i

nienasycone oraz alkohole jedno lub wielowodorotlenowe mające łańcuch krótki lub długi.

Lipazy występują w organizmach ludzi i zwierząt ( w trzustce, wątrobie, ścianie żołądka i jelit), w

nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin oraz u niektórych mikroorganizmów.

Zależnie od pochodzenia enzymy te różnią się optimum pH działania. Dla lipazy trzustkowej

wynosi ono około 7.0, dla lipazy wątrobowej około 8.0, a dla lipaz roślinnych 4.5–5.0.

Temperatura efektywnego działania lipaz mieści się miedzy 35°C a 37

°

C.

W trawieniu lipidów pożywienia ludzi i zwierząt, największe znaczenie ma lipaza trzustkowa,

wątrobowa i jelitowa. W jelicie cienkim człowieka, gdzie odbywa się właściwe trawienie

acylogliceroli i fosfolipidów pokarmowych, aktywność lipaz wzmagają składniki żółci wydzielanej

do światła dwunastnicy. Obecne w żółci sole kwasów żółciowych obniżają napięcie

powierzchniowe kuleczek tłuszczu, co przy równoczesnym mieszaniu treści dwunastniczej

prowadzi do emulsyfikacji tłuszczów (zwiększenia powierzchni granicznej między fazą wodną i

kuleczkami lipidu).

background image

Lipaza trzustkowa działając na triacyloglicerole odłącza kwasy tłuszczowe przy skrajnych atomach

węgla C

1

i C

3

. Produktem tej reakcji jest mieszanina 2-monoacyloglicerolu i wolnych kwasów

tłuszczowych (rys.1). Triacyloglicerole są nierozpuszczalne w wodzie stąd hydroliza z udziałem

tego enzymu odbywa się powoli. W miarę wzrostu stężenia diacylogliceroli, które są bardziej

polarne niż triacyloglicerole, rośnie szybkość działania lipazy trzustkowej.

Aktywność tego enzymu może być regulowana przez różnego rodzaju aktywatory i inhibitory.

Aktywatorami są m.in. jony Ca

2+

, cyjanek, związki zawierające grupę –SH, inhibitorami zaś są

ketony, aldehydy oraz związki reagujące z grupami –SH.

C

R

3

O

O

C

R

2

O

O

C

C

H

2

C

H

2

1

C

H

2

3

O

R

1

O

C

R

O

O

C

H

2

C

H

2

C

H

2

OH

OH

C

R

O

O

H

triacyloglicerol

+ 2 H

2

O

lipaza

2-acyloglicerol

kwas tluszczowy

+

2

Rys.1. Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy trzustkowej: R – reszta alkilowa kwasu

tłuszczowego związanego estrowo z glicerolem

Badanie aktywności lipaz ma znaczenie diagnostyczne. Niska aktywność tych enzymów w osoczu

występuje przy schorzeniach wątroby, awitaminozie A, niektórych nowotworach złośliwych i

cukrzycy natomiast aktywność lipaz wzrasta przy ostrym zapaleniu trzustki i raku trzustki.

Metody oznaczania aktywności lipaz

Aktywność lipaz można badać określając ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w czasie

działania enzymu w optymalnych warunkach doświadczalnych.

Większość metod opiera się na alkacymetrycznym oznaczeniu uwolnionych kwasów tłuszczowych

w wyniku działania lipazy na estry rozpuszczalne w wodzie np. tween lub nierozpuszczalne np.

substraty naturalne (lipidy). Substraty nierozpuszczalne w wodzie powinny znajdować się w postaci

zemulgowanej tj. silnie rozproszonej. Otrzymanie jednorodnej emulsji i zachowanie jej przez cały

czas działania enzymu ma podstawowe

znaczenie przy oznaczaniu jego aktywności.

background image

Zasada stosowanej metody

Metoda stosowana na ćwiczeniu opiera się na pomiarze ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z

lipidów mleka pod działaniem lipazy trzustkowej w temp. 37°C i początkowym pH 7.7, którego

wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obniżeniu (do pH 7.0) w wyniku uwalniania kwasów

tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się przez miareczkowanie

mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny.

W opisanej metodzie, dopiero po 60 minutach inkubacji uzyskuje się proporcjonalność między

ilością wyciągu trzustkowego a szybkością reakcji.

Odczynniki

1. 12 % słodka śmietanka homogenizowana zobojętniona 1-molowym wodorotlenkiem potasowym

z dodatkiem 1 ml toluenu na 100 ml śmietanki (śmietankę o wyższej zawartości tłuszczu

rozcieńczyć wodą).

2. 0,7-molowy bufor fosforanowy o pH 7,7.

3. 96 % etanol (może być skażony, np. metanolem, acetonem) lub metanol.

4. 0,5 % fenoloftaleina w 70 % etanolu.

5. 0,05-molowy mianowany roztwór wodorotlenku potasowego.

6. Wyciąg z trzustki wieprzowej; 30 g odtłuszczonej trzustki homogenizować przez ok. 5 min

(z przerwami, aby uniknąć nagrzania się roztworu) ze 100 ml wody i uzupełnić wodą do 1 l;

homogenat przesączyć przez podwójną warstwę gazy, wirować przy 4000 obr./min przez 10 minut i

przesączyć przez sączek z waty.

Wykonanie

Otrzymany w kolbie miarowej ekstrakt enzymatyczny lipazy uzupełnić wodą do kreski i dobrze

wymieszać. Do 6 enzymatycznie czystych probówek (próby pełne) odmierzyć po 2,5 ml śmietanki

(1) i po 1 ml buforu (2). Wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp. 37°C. Po około 5 minutach

do wszystkich sześciu probówek dodać kolejno z otrzymanej kolby miarowej po 0,5 ml ekstraktu

lipazy, dobrze wymieszać i wstawić do łaźni wodnej.

Po 20 minutach od dodania enzymu wyjąć z łaźni dwie probówki, dodać po 5 ml etanolu (3), kilka

kropli fenoloftaleiny (4) i całość mieszaniny przenieść do kolby stożkowej na 100 ml. Zawarte w

próbie kwasy tłuszczowe miareczkować mianowanym roztworem wodorotlenku potasu (5) do

trwałego różowego zabarwienia (wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej

intensywności).

background image

Kolejne dwie próby wyjąć po 40 minutach, a ostatnie dwie po 60 minutach

od dodania enzymu i postępować z nimi wg. procedury opisanej wyżej.

Chcąc określić kwasowość składników mieszaniny inkubacyjnej należy wykonać także próbę

kontrolną (w dwóch powtórzeniach).

W tym celu należy odmierzyć do dwóch kolb stożkowych na 100 ml po 2,5 ml śmietanki (1), 1 ml

buforu (2), 5 ml etanolu (3), kilka kropli fenoloftaleiny (4) oraz 0,5 ml ekstraktu lipazy a następnie

miareczkować (jak wyżej) mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego (5).

Dla zbadania samej aktywności lipazy trzustkowej należy wykonać oznaczenie po 60 minutach

(dwie próby pełne), jak to opisano wyżej.

Obliczenie aktywności lipazy trzustkowej

1. Od uśrednionej objętości mianowanego roztworu KOH zużytego do miareczkowania prób

pełnych po 60 minutach inkubacji, odjąć średnią wartość próby kontrolnej. Aktywność lipazy

wyrazić w µmolach kwasów tłuszczowych uwolnionych w ciągu 1 minuty przez enzym z 1g

trzustki wiedząc, że 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego zobojętnia 50 µmoli kwasów

tłuszczowych oraz uwzględniając schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego.


Przykładowe obliczenia:

Uśredniona objętość roztworu

KOH zużytego do

zmiareczkowania prób

kontrolnych (P

1

)

Uśredniona objętość roztworu

KOH zużytego do

zmiareczkowania prób po 60

minutach inkubacji (P

2

)

Różnica między próbą po 60
minutach inkubacji a próbą
kontrolą (P

2

– P

1)

7,2 ml

30,2 ml

23 ml


Jeżeli 1 ml KOH zobojętnia 50 µmoli kwasów tłuszczowych to 23 ml KOH zobojętni 1150 µmoli

kwasów tłuszczowych.

Do reakcji pobrano 0,5 ml ekstraktu lipazy trzustkowej zatem ilość uwolnionych kwasów

tłuszczowych przez 0,5 ml lipazy wynosi 1150 µmoli.

Aktywność lipazy w 10 ml roztworu jest więc równa 23000 µmolom uwolnionych kwasów

tłuszczowych.

Wiedząc, że przed uzupełnieniem do objętości 10 ml kolba zawierała 5 ml roztworu lipazy

trzustkowej przygotowanego przez homogenizację 30g trzustki z 1000 ml wody możemy obliczyć

aktywność lipazy w następujący sposób:

aktywność 5 ml wyjściowego roztworu lipazy wynosi 23000 µmoli kwasów tłuszczowych

background image

aktywność 1 g trzustki wynosi 153333,33 µmoli kwasów tłuszczowych, a po uwzględnieniu

czasu reakcji enzymatycznej wynoszącego 60 minut, aktywność enzymu będzie równa

2555,55 µmoli kwasów tłuszczowych x min.

-1

x g

-1

trzustki.


2. Obliczyć liczbę µmoli uwolnionych kwasów tłuszczowych w 20 minutowych przedziałach czasu,

tj. 0–20, 20–40 i 40–60 minut wiedząc, że 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego

zobojętnia 50 µmoli kwasów tłuszczowych. Obliczenia należy prowadzić jak opisano powyżej

uwzględniając jedynie różnice czasu inkubacji tj. 20, 40, i 60 minut.

3. Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości reakcji hydrolizy tłuszczu od czasu,

odkładając na osi rzędnych µmole kwasów tłuszczowych, a na osi odciętych czas w minutach. Na

podstawie otrzymanych wyników wnioskować o szybkości hydrolizy lipidów w badanych

przedziałach czasu.

Pytania

1.

Dlaczego lipazy charakteryzują się niską specyficznością substratową?

2.

Jakie znaczenie diagnostyczne ma badanie aktywności lipaz?

3.

Przedstaw sposób działania lipazy trzustkowej na TAG. Dlaczego szybkość uwalniania

kwasów tłuszczowych z tłuszczu mleka jest niska na początku reakcji i rośnie wraz ze

wzrostem stężenia DAG ?

4.

Podaj zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania lipazy. Wyjaśnij dlaczego do

mieszaniny inkubacyjnej dodaje się bufor o wysokim stężeniu?

5.

30 g trzustki wieprzowej po homogenizacji rozcieńczono do 1000 ml. Następnie pobrano 5

ml i rozcieńczono do 25 ml. Do oznaczenia aktywności lipazy pobrano 1ml wyciągu

enzymatycznego i przez 60 minut inkubowano z substratem. Uśredniona objętość roztworu

KOH zużytego do zmiareczkowania próby pełnej wynosiła 21,5 ml, a próby kontrolnej 4,5

ml. Oblicz aktywność lipazy trzustkowej w mmolach kwasów tłuszczowych na 1 min. i 1g

trzustki.









background image



Literatura

1.

Thomas F., Whayne Jr., J. F. Morelli. (1977) Biochem. Med. 17: 248-257.

2.

Walter G.L., McGraw P., Tvedten H.W. Vet Clin Pathol. (1992) 21:23-27.

3.

Balcao V. M., Malcata F. X. Biotechnol. Adv. (1998) 16: 309-341.

4.

Rotticci D., Norin T., Hult K., Martinelle M. Biochim Biophys Acta. (2000) 1483: 132-40.

5.

Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczania aktywności lipazy trzustkowej
9) Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych
Oznaczanie aktywności enzymów lipolitycznych
Kraking katalityczny – oznaczanie aktywności katalizatorów metodą UOP
Hydroliza lipidów mleka za pomocą lipazy trzustkowej, Biotechnologia Enzymatyczna
Biochemia, Oznaczanie aktywnościi amylazy metodą Noeltinga i Bernfelda w ziarnie pszenicy
cwiczenie 5 amylaza oznaczanie aktywnosci enzymu metoda kolorymetryczna 05 05 2014
Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy
Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności katalazy
IG.6 - Oznaczanie aktywności enzymatycznej metaloproteinaz komórkowych, Genetyka, Inżynieria genetyc
Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności katalazy
oznaczanie aktywności enzymów, Biotechnologia, laborki
Oznaczanie aktywności katalazy i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznejx
11) Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny
Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny
Oznaczenie aktywnosci czastek p Nieznany

więcej podobnych podstron