Badanie szybko
ś
ci hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywno
ś
ci lipazy
trzustkowej
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy
trzustkowej z użyciem śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości
katalizowanej reakcji zależnie od czasu jej trwania.
Wprowadzenie
Lipazy (EC 3.1.) to enzymy klasy hydrolaz, podklasy esteraz katalizujące reakcję hydrolizy wiązań
estrowych triacylogliceroli (TAG) nierozpuszczalnych w wodzie. Reakcja ta zachodzi na styku
fazy wodnej ( lipazy) z fazą lipidową (substratu) prowadząc do powstania kwasów tłuszczowych,
diacylogliceroli (DAG), monoacylogliceroli (MAG) i glicerolu.
Enzymy te odznaczają się niską specyficznością substratową gdyż odpowiadają za rozkład estrów
utworzonych przez kwasy tłuszczowe o krótkim lub długim łańcuchu zarówno nasycone i
nienasycone oraz alkohole jedno lub wielowodorotlenowe mające łańcuch krótki lub długi.
Lipazy występują w organizmach ludzi i zwierząt ( w trzustce, wątrobie, ścianie żołądka i jelit), w
nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin oraz u niektórych mikroorganizmów.
Zależnie od pochodzenia enzymy te różnią się optimum pH działania. Dla lipazy trzustkowej
wynosi ono około 7.0, dla lipazy wątrobowej około 8.0, a dla lipaz roślinnych 4.5–5.0.
Temperatura efektywnego działania lipaz mieści się miedzy 35°C a 37
°
C.
W trawieniu lipidów pożywienia ludzi i zwierząt, największe znaczenie ma lipaza trzustkowa,
wątrobowa i jelitowa. W jelicie cienkim człowieka, gdzie odbywa się właściwe trawienie
acylogliceroli i fosfolipidów pokarmowych, aktywność lipaz wzmagają składniki żółci wydzielanej
do światła dwunastnicy. Obecne w żółci sole kwasów żółciowych obniżają napięcie
powierzchniowe kuleczek tłuszczu, co przy równoczesnym mieszaniu treści dwunastniczej
prowadzi do emulsyfikacji tłuszczów (zwiększenia powierzchni granicznej między fazą wodną i
kuleczkami lipidu).
Lipaza trzustkowa działając na triacyloglicerole odłącza kwasy tłuszczowe przy skrajnych atomach
węgla C
1
i C
3
. Produktem tej reakcji jest mieszanina 2-monoacyloglicerolu i wolnych kwasów
tłuszczowych (rys.1). Triacyloglicerole są nierozpuszczalne w wodzie stąd hydroliza z udziałem
tego enzymu odbywa się powoli. W miarę wzrostu stężenia diacylogliceroli, które są bardziej
polarne niż triacyloglicerole, rośnie szybkość działania lipazy trzustkowej.
Aktywność tego enzymu może być regulowana przez różnego rodzaju aktywatory i inhibitory.
Aktywatorami są m.in. jony Ca
2+
, cyjanek, związki zawierające grupę –SH, inhibitorami zaś są
ketony, aldehydy oraz związki reagujące z grupami –SH.
C
R
3
O
O
C
R
2
O
O
C
C
H
2
C
H
2
1
C
H
2
3
O
R
1
O
C
R
O
O
C
H
2
C
H
2
C
H
2
OH
OH
C
R
O
O
H
triacyloglicerol
+ 2 H
2
O
lipaza
2-acyloglicerol
kwas tluszczowy
+
2
Rys.1. Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy trzustkowej: R – reszta alkilowa kwasu
tłuszczowego związanego estrowo z glicerolem
Badanie aktywności lipaz ma znaczenie diagnostyczne. Niska aktywność tych enzymów w osoczu
występuje przy schorzeniach wątroby, awitaminozie A, niektórych nowotworach złośliwych i
cukrzycy natomiast aktywność lipaz wzrasta przy ostrym zapaleniu trzustki i raku trzustki.
Metody oznaczania aktywności lipaz
Aktywność lipaz można badać określając ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w czasie
działania enzymu w optymalnych warunkach doświadczalnych.
Większość metod opiera się na alkacymetrycznym oznaczeniu uwolnionych kwasów tłuszczowych
w wyniku działania lipazy na estry rozpuszczalne w wodzie np. tween lub nierozpuszczalne np.
substraty naturalne (lipidy). Substraty nierozpuszczalne w wodzie powinny znajdować się w postaci
zemulgowanej tj. silnie rozproszonej. Otrzymanie jednorodnej emulsji i zachowanie jej przez cały
czas działania enzymu ma podstawowe
znaczenie przy oznaczaniu jego aktywności.
Zasada stosowanej metody
Metoda stosowana na ćwiczeniu opiera się na pomiarze ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z
lipidów mleka pod działaniem lipazy trzustkowej w temp. 37°C i początkowym pH 7.7, którego
wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obniżeniu (do pH 7.0) w wyniku uwalniania kwasów
tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się przez miareczkowanie
mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny.
W opisanej metodzie, dopiero po 60 minutach inkubacji uzyskuje się proporcjonalność między
ilością wyciągu trzustkowego a szybkością reakcji.
Odczynniki
1. 12 % słodka śmietanka homogenizowana zobojętniona 1-molowym wodorotlenkiem potasowym
z dodatkiem 1 ml toluenu na 100 ml śmietanki (śmietankę o wyższej zawartości tłuszczu
rozcieńczyć wodą).
2. 0,7-molowy bufor fosforanowy o pH 7,7.
3. 96 % etanol (może być skażony, np. metanolem, acetonem) lub metanol.
4. 0,5 % fenoloftaleina w 70 % etanolu.
5. 0,05-molowy mianowany roztwór wodorotlenku potasowego.
6. Wyciąg z trzustki wieprzowej; 30 g odtłuszczonej trzustki homogenizować przez ok. 5 min
(z przerwami, aby uniknąć nagrzania się roztworu) ze 100 ml wody i uzupełnić wodą do 1 l;
homogenat przesączyć przez podwójną warstwę gazy, wirować przy 4000 obr./min przez 10 minut i
przesączyć przez sączek z waty.
Wykonanie
Otrzymany w kolbie miarowej ekstrakt enzymatyczny lipazy uzupełnić wodą do kreski i dobrze
wymieszać. Do 6 enzymatycznie czystych probówek (próby pełne) odmierzyć po 2,5 ml śmietanki
(1) i po 1 ml buforu (2). Wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp. 37°C. Po około 5 minutach
do wszystkich sześciu probówek dodać kolejno z otrzymanej kolby miarowej po 0,5 ml ekstraktu
lipazy, dobrze wymieszać i wstawić do łaźni wodnej.
Po 20 minutach od dodania enzymu wyjąć z łaźni dwie probówki, dodać po 5 ml etanolu (3), kilka
kropli fenoloftaleiny (4) i całość mieszaniny przenieść do kolby stożkowej na 100 ml. Zawarte w
próbie kwasy tłuszczowe miareczkować mianowanym roztworem wodorotlenku potasu (5) do
trwałego różowego zabarwienia (wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej
intensywności).
Kolejne dwie próby wyjąć po 40 minutach, a ostatnie dwie po 60 minutach
od dodania enzymu i postępować z nimi wg. procedury opisanej wyżej.
Chcąc określić kwasowość składników mieszaniny inkubacyjnej należy wykonać także próbę
kontrolną (w dwóch powtórzeniach).
W tym celu należy odmierzyć do dwóch kolb stożkowych na 100 ml po 2,5 ml śmietanki (1), 1 ml
buforu (2), 5 ml etanolu (3), kilka kropli fenoloftaleiny (4) oraz 0,5 ml ekstraktu lipazy a następnie
miareczkować (jak wyżej) mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego (5).
Dla zbadania samej aktywności lipazy trzustkowej należy wykonać oznaczenie po 60 minutach
(dwie próby pełne), jak to opisano wyżej.
Obliczenie aktywności lipazy trzustkowej
1. Od uśrednionej objętości mianowanego roztworu KOH zużytego do miareczkowania prób
pełnych po 60 minutach inkubacji, odjąć średnią wartość próby kontrolnej. Aktywność lipazy
wyrazić w µmolach kwasów tłuszczowych uwolnionych w ciągu 1 minuty przez enzym z 1g
trzustki wiedząc, że 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego zobojętnia 50 µmoli kwasów
tłuszczowych oraz uwzględniając schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego.
Przykładowe obliczenia:
Uśredniona objętość roztworu
KOH zużytego do
zmiareczkowania prób
kontrolnych (P
1
)
Uśredniona objętość roztworu
KOH zużytego do
zmiareczkowania prób po 60
minutach inkubacji (P
2
)
Różnica między próbą po 60
minutach inkubacji a próbą
kontrolą (P
2
– P
1)
7,2 ml
30,2 ml
23 ml
Jeżeli 1 ml KOH zobojętnia 50 µmoli kwasów tłuszczowych to 23 ml KOH zobojętni 1150 µmoli
kwasów tłuszczowych.
Do reakcji pobrano 0,5 ml ekstraktu lipazy trzustkowej zatem ilość uwolnionych kwasów
tłuszczowych przez 0,5 ml lipazy wynosi 1150 µmoli.
Aktywność lipazy w 10 ml roztworu jest więc równa 23000 µmolom uwolnionych kwasów
tłuszczowych.
Wiedząc, że przed uzupełnieniem do objętości 10 ml kolba zawierała 5 ml roztworu lipazy
trzustkowej przygotowanego przez homogenizację 30g trzustki z 1000 ml wody możemy obliczyć
aktywność lipazy w następujący sposób:
•
aktywność 5 ml wyjściowego roztworu lipazy wynosi 23000 µmoli kwasów tłuszczowych
•
aktywność 1 g trzustki wynosi 153333,33 µmoli kwasów tłuszczowych, a po uwzględnieniu
czasu reakcji enzymatycznej wynoszącego 60 minut, aktywność enzymu będzie równa
2555,55 µmoli kwasów tłuszczowych x min.
-1
x g
-1
trzustki.
2. Obliczyć liczbę µmoli uwolnionych kwasów tłuszczowych w 20 minutowych przedziałach czasu,
tj. 0–20, 20–40 i 40–60 minut wiedząc, że 1ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego
zobojętnia 50 µmoli kwasów tłuszczowych. Obliczenia należy prowadzić jak opisano powyżej
uwzględniając jedynie różnice czasu inkubacji tj. 20, 40, i 60 minut.
3. Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości reakcji hydrolizy tłuszczu od czasu,
odkładając na osi rzędnych µmole kwasów tłuszczowych, a na osi odciętych czas w minutach. Na
podstawie otrzymanych wyników wnioskować o szybkości hydrolizy lipidów w badanych
przedziałach czasu.
Pytania
1.
Dlaczego lipazy charakteryzują się niską specyficznością substratową?
2.
Jakie znaczenie diagnostyczne ma badanie aktywności lipaz?
3.
Przedstaw sposób działania lipazy trzustkowej na TAG. Dlaczego szybkość uwalniania
kwasów tłuszczowych z tłuszczu mleka jest niska na początku reakcji i rośnie wraz ze
wzrostem stężenia DAG ?
4.
Podaj zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania lipazy. Wyjaśnij dlaczego do
mieszaniny inkubacyjnej dodaje się bufor o wysokim stężeniu?
5.
30 g trzustki wieprzowej po homogenizacji rozcieńczono do 1000 ml. Następnie pobrano 5
ml i rozcieńczono do 25 ml. Do oznaczenia aktywności lipazy pobrano 1ml wyciągu
enzymatycznego i przez 60 minut inkubowano z substratem. Uśredniona objętość roztworu
KOH zużytego do zmiareczkowania próby pełnej wynosiła 21,5 ml, a próby kontrolnej 4,5
ml. Oblicz aktywność lipazy trzustkowej w mmolach kwasów tłuszczowych na 1 min. i 1g
trzustki.
Literatura
1.
Thomas F., Whayne Jr., J. F. Morelli. (1977) Biochem. Med. 17: 248-257.
2.
Walter G.L., McGraw P., Tvedten H.W. Vet Clin Pathol. (1992) 21:23-27.
3.
Balcao V. M., Malcata F. X. Biotechnol. Adv. (1998) 16: 309-341.
4.
Rotticci D., Norin T., Hult K., Martinelle M. Biochim Biophys Acta. (2000) 1483: 132-40.
5.
Bańkowski E., Biochemia, MedPharm Polska, Wrocław 2006.