WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ W GLIWICACH

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII

HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA
ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ

Prowadzący: mgr inż. Katarzyna Goj

WSTĘP TEORETYCZNY

Enzymy lipolityczne na przykładzie Lipazy

Lipaza należy do grupy enzymów lipolitycznych (klasa:hydrolazy, podgrupa:esterazy), hydrolizuje ona wiązanie estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi w obrębie różnorodnej grupy lipidów. Lipazy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, występują w nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin, w niektórych mikroorganizmach oraz w organizmach ludzi i zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka i jelit). Lipazy katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG). Reakcja ta zachodzi na granicy faz a produktami są kwasy tłuszczowe, diacyloglicerole (DAG), monoacyloglicerole (MAG) oraz glicerol. Lipazy katalizują również hydrolizę rozpuszczalnych w wodzie, krótkołańcuchowych estrów kwasów karboksylowych (reakcja zachodzi bardzo powoli).

Hydroliza triacylogliceroli jest reakcją odwracalną, kierunek reakcji jest zależny od środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody wywołuje estryfikacje glicerolu-reakcja odwrotna. Szybkość hydrolizy triacylogliceroli wzrasta z liczbą reszt kwasów tłuszczowych, długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia kwasów tłuszczowych. Reakcje katalizowane przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach buforowych możliwa jest wtedy kontrola zawartości wody (współczynnik aktywności wodnej).

Lipazy katalizują następujące typy reakcji:

1. hydrolizę (środowisko wodne, z nadmiarem wody),

2. estryfikację (środowisko z małym udziałem wody lub środowisko bezwodne),

3. transestryfikacja (wymiana kwasów tłuszczowych w TAG),

• acydoliza (grupy acylowe pochodzą od wolnych kwasów),

• interestryfikacja (wymiana grup arylowych pomiedzy estrami),

• alkoholiza (reakcja pomiedzy alkoholem i estrem w wyniku której powstaje nowy alkohol i ester).

Optymalne pH reakcji dla lipaz pochodzenia zwierzęcego wynosi 7.0-8.0, a dla lipaz roślinnych w granicach pH 4.7-5.0, natomiast temperatura efektywnego działania mieści się między 35 a 37˚C.

Aktywność lipaz można sprawdzić poprzez określenie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych w wyniku działania enzymu w reakcji prowadzonej w optymalnych warunkach doświadczalnych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w równych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasu.

Utlenianie lipidów zachodzi pod wpływem dwóch enzymów : lipazy i lipooksygenazy (schemat poniżej).

Reakcja zaczyna się od działania lipazy uwalniającej z cząsteczek triacylogliceroli kwasy tłuszczowe, z których następnie powstają produkty utleniania. Rozkład tłuszczów zachodzi szybko, np. podczas przemiału pszenicy wtedy mąka posiada gorzki smak. Wysoką aktywność lipolityczną mają zarodki pszenne a przede wszystkim otręby pszenne.

Lipazy wykorzystywane aktualnie w procesach przetwórczych są pochodzenia głównie mikrobiologicznego. Znaczne ich ilości syntezowane są przez różne szczepy drożdży, pleśni czy bakterii (Candida rugosa, Candida cylindracea, Candida antarctica, Aspergillus niger, Bacillus piocyaneum). Wykorzystane są w przemyśle spożywczym do otrzymywania komercyjnie ważnych niskocząsteczkowych estrów o określonych walorach smakowo-zapachowych, stosowane są najczęściej do napojów, soków, nektarów, a także do takich produktów jak budynie, kisiele, dżemy, ciastka i wiele innych. Niektóre z nich posiadają charakterystyczny smak np.:

• octan izoamylu-bananowy,

• maślan metylu-ananasowy,

• propionian metylu-owocowy,

• estry tolilu-aromat miodowy,

• octan cytronellylu-aromat różany,

• octan terpinylu-aromat owocowy.

Niektóre lipazy pochodzenia mikrobiologicznego hydrolizują tłuszcz mleka krowiego i uwalnianą są wtedy głównie lotne kwasy tłuszczowe (krótkołańcuchowe), których zawartość wynosi 8-10% ogólnej ilości związanych w tłuszczu kwasów, inne lipazy odszczepiają przede wszystkim kwasy o długich łańcuchach, w przemyśle mleczarskim odpowiedzialne są za intensyfikację cech organoleptycznych, w tym głównie serów twardych, którym uwolnione kwasy krótkołańcuchowe nadają pikantny smak. W ostatnim czasie lipazy wykorzystywane są do syntezy estrów kwasów tłuszczowych np. z kwasem askorbinowym oraz witaminą A. Przeciwutleniacze te posiadają zmienione właściwości hydrofobowo-hydrofilowe (kwas askorbinowy w postaci estru kwasu tłuszczowego rozpuszcza się w olejach) i mogą mieć szerokie zastosowanie w przemysle tłuszczowym lub kosmetycznym.

W procesach trawiennych mających miejsce w organizmach ludzi i zwierząt największe znaczenie mają lipazy: trzustkowa, wątrobowa i jelitowa. W produktach enzymatycznego rozkładu tłuszczu występują obok uwolnionych kwasów tłuszczowych i glicerolu, także mono- i diacyloglicerole. Lipaza trzustkowa odszczepia wyłącznie kwasy tłuszczowe w pozycjach α i α' w cząsteczce triacylogliceroli (wiązania estrowe utworzone w reakcji kwasów karboksylowych z pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi). Natomiast lipaza jelitowa działa na wiązania estrowe w położeniu β, powstające w reakcji kwasów tłuszczowych z drugorzędową grupą hydroksylową glicerolu. W warunkach fizjologicznych równowaga reakcji jest przesunięta na korzyść produktów rozkładu dlatego biosynteza estrów praktycznie nie zachodzi.

Przemysłowe zastosowanie lipaz zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i mikrobiologicznego:

• przemysł mleczarski-produkcja serów typu roquefort, cheddar, oraz serów włoskich, częściowa hydroliza tłuszczu (poprawa aromatu, smaku), skrót czasu dojrzewania,

• przemysł cukierniczy-hydroliza pozostałości tłuszczu w suchej albuminie jaj, ponieważ obecność tłuszczu obniża zdolność białka do tworzenia piany (traktuje się lipazą masę jajeczną przed suszeniem przez co wzrasta organoleptyczna jakość gotowego produktu), w produkcji czekolady mlecznej lipaza powoduje powstawanie kwasów tłuszczowych, które poprawiają jej smak i aromat,

• przemysł tłuszczowy-modyfikacja tłuszczów, niekorzystna w przypadku transportu i przechowywania nasion oleistych, przy zbyt wysokiej zawartości wody wzrasta kwasowość nasion co niekorzystnie wpływa z uwagi na zachodzącą pod wpływem lipazy hydrolizę acylogliceroli i uwalnianie kwasów tłuszczowych,

• przemysł skórzany-odtłuszczanie skór, wełny, szczeciny,

• przemysł tekstylny-produkcja jedwabiu, odtłuszczanie włókien,

• przemysł chemiczny-składnik detergentów, bioemulgatorów do produkcji środków piorących, preparatów usuwających tłuste plamy z tekstyliów,

• przemysł farmaceutyczny-otrzymywanie preparatów leczniczych, leków wspomagających działanie trzustki i wątroby.

WYKONANIE ĆWICZENIA

Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach w substracie zawierającym tłuszcz. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w kolejnych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika.

Cześć analityczna

Materiały i odczynniki:

• Kolba (250-500cm³) - 1szt

• Kolba stożkowa (100cm³) - 7szt

• Kolba stożkowa (300-400 cm³) - 2szt

• Cylinder (100cm³)

• Pipety (5cm³; 2x10cm³; 25cm³)

• Lejek

• Łaźnia wodna (38°C)

• Zestaw do miareczkowania

• Homogenizator

• 0,05 M roztwór KOH

• 1% roztwór fenoloftaleiny

• Metanol

• Badany produkt

• Trzustka wieprzowa

• Uniwersalne papierki wskaźnikowe

• Sączki

• Gaza

Postępowanie

Otrzymanie wyciagu lipazy z trzustki

Zhomogenizować 200g świeżej, pokrojonej trzustki wieprzowej z 300cm³ wody destylowanej. Zawiesinę przesączyć przez gazę. Otrzymany przesącz, stanowiący roztwór enzymu, zobojętnić do pH 7 przy użyciu 0,1M roztworu KOH wobec papierka wskaźnikowego.

Oznaczenie

Do kolby stożkowej o pojemności 250cm³ odmierzyć 100cm³ mleka lub śmietanki, a następnie kolbę umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 38°C. Przygotować sześć ponumerowanych kolb stożkowych o pojemności 100cm³ i do każdej z nich odmierzyć po 25cm³ metanolu. Po upływie 10 minut od momentu wstawienia kolby z mlekiem do łaźni, dodać do mleka 30cm³ przygotowanego wstępnie wyciągu enzymatycznego z trzustki i dokładnie wymieszać. Kolbe pozostawić w łaźni wodnej i co kilka minut powtarzać mieszanie. Po upływie 15 minut od dodania wyciągu enzymatycznego pobrać z mieszaniny reakcyjnej 10cm³ roztworu do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ (próba nr 1). W analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 90min., w odstępach 15-minutowych (łącznie sześć prób). Poszczególne próbki miareczkować 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do pojawienia się lekko różowego zabarwienia.

Próba zerowa

Przenieść 50cm³ uzyskanego na wstępie wyciągu enzymatycznego do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ i ogrzewać do wrzenia w celu inaktywacji enzymu. Po oziębieniu gotowanego roztworu ewentualny wytracony osad odsączyć. Następnie do kolby stożkowej o pojemności 100cm³ (nr 0) odpipetować 10cm³ mleka lub śmietanki, 3cm³ przesączu z ogrzewanego wyciągu enzymatycznego oraz 25cm³ metanolu. Próbę miareczkować analogicznie jak próby badane 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny. Wyniki zebrać i przedstawić w postaci tabel i wykresów w sprawozdaniu z ćwiczeń.

• Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w tabeli.

Nr próby	Czas (min.)	Ilość cm^3 0.05M KOH zużytego do miareczkowania próby:
0	0
1	15
2	30
3	45
4	60
5	75
6	90

• Obliczyć mikroekwiwalenty uwolnionych kwasów tłuszczowych z równania:

Gdzie:

A - ilość cm³ 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej

B - ilość cm³ 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej

C - molowość użytego do miareczkowania KOH

D - ilość cm³ wyciągu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu

• Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych (mikroekwiwalenty) w czasie (min.)

---