Zaprojektuj reakcję PCR, w której otrzymasz fragment białka Usp z Bombyx mori, obejmujący aminokwasy:
Ala5 – Ser71. Pamiętaj, że produkt reakcji będzie w kolejnym etapie wklonowany do wektora ekspresyjnego
pGEX-3X. Wybierz odpowiednie dwa różne miejsca restrykcyjne !

Ogranicz liczbę aminokwasów pochodzących z wektora !

A.

Zaprojektuj dwa startery posiadające odpowiednie miejsca restrykcyjne.

B.

Podaj składniki mieszaniny reakcyjnej – załóż, że zaprojektowane przez Ciebie „startery” zakupiłeś(aś)
w firmie, która przysłała je podając następujące stężenia: C

R

=37pmol/



l; C

F

=0,27



g/



l. Matryca

z wklonowanym genem całego białka (plazmid BS SK(+)/BmUsp) ma stężenie:

C

DNA

= 7,5 ng/



l.

C.

Uzupełnij schemat programu PCR, przedstawiony na stronie 5, wpisując m.in. odpowiednie wartości
jednostek, temperatur i czasów. Załóż, że dysponujesz polimerazą Vent (1U/



l) o procesywności 500

nukleotydów/30s, optimum aktywności (synteza DNA) enzym wykazuje w temperaturze 75



C;

optymalne stężenie dNTP wynosi 0,4 mM (probówka dostarczona przez producenta zawiera dNTP w
stężeniu 2,5 mM), optymalna liczba jednostek enzymu na jedną reakcję wynosi 1,5U, optymalna ilość
matrycy wynosi 15 ng, wystarczająca ilość starterów: 50 pmoli.



Sekwencja cDNA Usp z Bombyx mori obejmująca reszty: Met1-Pro80:

1 atgtcgagcgtggcgaagaaagataaacgcacaatgtcggtaactgcgttgatcaatagg 60
1 M S S V A K K D K R T M S V T A L I N R 20

61 gcgtggccaatgacgcctagcccacagcagcagcagcagatggtgccgtctacacagcat 120
21 A W P M T P S P Q Q Q Q Q M V P S T Q H 40

121 tcgaatttcctgcacgcaatggctacaccttcaaccacacccaatgttgaactcgatata 180
41 S N F L H A M A T P S T T P N V E L D I 60

181 caatggctgaacatagagtcagggtttatgtcgcctatgtcaccgcccgaaatgaagcca 240
61 Q W L N I E S G F M S P M S P P E M K P 80



Polilinker (MCS) wektora pGEX-3X:

k

odon startu

... ATG GTT CGG TAC CCC GTT TGA ATT CGT CCG TGA GAA GCT TAT GGC TGA ...
KpnI EcoRI

STOP

HindIII

STOP