Podstawy immunologii medycznej (skrypt dla studentów biotechnologii)

AKADEMIA MEDYCZNA W GDACSKU
PODSTAWY IMMUNOLOGII
MEDYCZNEJ
Skrypt do ćwiczeń praktycznych dla
studentów biotechnologii
Aleksandra Rutkowska
Gdańsk 2008
Aleksandra Rutkowska
Wydano za zgodą
Senackiej Komisji Wydawnictw Akademii Medycznej w Gdańsku
Recenzent
dr hab. Piotr Trzonkowski
� Copyright by Medical University of Gdańsk
ISBN 978-83-60253-39-7
Wydawca:
Akademia Medyczna w Gdańsku
Zlecenie KW/118/08
2
Spis treści
SPIS TREŚCI
ĆWICZENIE 1. HODOWLE KOMÓRKOWE. TWORZENIE MODELU IN VITRO
ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ NA ANTYGENY BAKTERYJNE....................... 10
1.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 10
1.1.1 Odpowiedz nieswoista, cząstki PAMP, receptory TLR................. 10
1.1.2 Bakteryjne DNA-specyficzne cząstki PAMP ................................. 11
1.1.3 Oligodeoksynukleotydy typy, zastosowanie kliniczne.............. 11
1.2 HODOWLE KOMÓRKOWE.................................................................... 15
1.2.1 Definicja....................................................................................... 15
1.2.2 Typy hodowli: .............................................................................. 16
1.2.3 Zalety i wady hodowli komórkowych .......................................... 19
1.2.4 Zastosowanie hodowli komórkowych ......................................... 20
1.2.5 Metody hodowli komórkowej ..................................................... 21
1.2.5.1 Metody izolacji komórek układu immunologicznego.............. 21
1.2.5.1.1 Metody izolacji ludzkich jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej.......................................................................................... 21
1.2.5.1.2 Metody izolacji komórek mysich na przykładzie
osteoklastów........................................................................................ 23
1.2.6 Naczynia hodowlane, pożywki..................................................... 23
1.2.6.1.1 Naczynia hodowlane ......................................................... 23
1.2.6.1.2 Pożywki.............................................................................. 25
3
Aleksandra Rutkowska
1.2.6.2 Zakładanie hodowli, zmiana pożywek, pasażowanie ..............25
1.2.6.2.1 Zakładanie hodowli komórkowej ......................................26
1.2.6.2.2 Zmiana pożywek hodowlanych..........................................27
1.2.6.2.3 Pasażowanie komórek.......................................................28
1.2.6.2.4 Mrożenie, bankowanie i rozmrażanie komórek................ 28
1.3 CEL ĆWICZENIA .................................................................................... 29
1.4 MATERIAAY ..........................................................................................29
1.4.1 Materiał biologiczny .................................................................... 29
1.4.2 Stymulanty:..................................................................................29
1.4.3 Sprzęt laboratoryjny, odczynniki .................................................30
1.4.4 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZENIA ..................................31
1.4.4.1 Izolacja PBMC z krwi żylnej metodą wirowania w gradiencie
gęstości Ficoll/Uropolina .........................................................................31
1.4.4.2 Liczenie komórek z wykorzystaniem kamery Fuchsa-Rosenthala
31
1.4.4.3 Ocena żywotności wyizolowanych komórek z wykorzystaniem
błękitu trypanu ........................................................................................32
1.4.4.4 Przygotowanie zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640 w
stężeniu 1 mln komórek na 1 ml pożywki................................................33
1.4.4.5 Zakładanie hodowli komórek...................................................33
ĆWICZENIE 2. MONOCYTY - JAKO KOMÓRKI ODPOWIEDZI ZAPALNEJ....... 34
2.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 34
2.1.1 Reakcja zapalna. Udział monocytów w zapaleniu. ......................34
2.1.2 Rola monocytów w odpowiedzi immunologicznej ...................... 35
4
Spis treści
2.1.2.1 Monocyty jako główne komórki fagocytujące układu
odpornościowego .................................................................................... 35
2.1.2.2 Modulacja odpowiedzi zapalnej .............................................. 36
2.2 Metody pomiaru stężenia cytokin....................................................... 37
2.2.1 Testy immunoenzymatyczne (ELISA)........................................... 37
2.2.2 Testy biologiczne z wykorzystaniem linii komórkowych
wrażliwych na cytokiny................................................................................ 37
2.2.3 Oznaczanie cytokin z wykorzystaniem cytometrii przepływowej38
2.3 Metody określania aktywności fagocytarnej monocytów i oceny
zdolności monocytów do generacji wybuchu tlenowego ............................... 38
2.4 CEL ĆWICZENIA.................................................................................... 39
2.5 MATERIAA ............................................................................................ 39
2.6 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC ............................................. 40
2.6.1 Określenie aktywności biologicznej IL-6 z wykorzystaniem
komórek B9.................................................................................................. 40
2.6.2 Określenie aktywności biologicznej TNF z wykorzystaniem
komórek WEHI164....................................................................................... 41
ĆWICZENIE 3. Komórki NK ............................................................................... 42
3.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 42
3.1.1 Komórki NK.................................................................................. 42
3.1.1.1 Morfologia, antygeny powierzchniowe komórek NK.......... 42
3.1.1.2 Subpopulacje komórek NK.................................................... 42
3.1.1.3 Fizjologiczna rola komórek NK............................................. 43
3.2 Metody określania aktywności cytotoksycznej komórek NK .............. 43
5
Aleksandra Rutkowska
3.3 CEL ĆWICZENIA .................................................................................... 44
3.4 MATERIAA DO ĆWICZEC ......................................................................44
3.5 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC .............................................45
3.5.1 Określenie aktywności cytotoksycznej komórek NK z
wykorzystaniem linii komórkowej K562......................................................45
ĆWICZENIE 4. ANALIZA LIMFOCYTÓW Z WYKORZYSTANIEM CYTOMETRII
PRZEPAYWOWEJ................................................................................................ 46
5.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 46
5.1.1 Limfocyty T...................................................................................46
5.1.2 Limfocyty B ..................................................................................49
5.1.3 Przeciwciała mono- i poliklonalne biotechnologiczne i kliniczne
zastosowanie ...............................................................................................50
5.2 Cytometria przepływowa..................................................................... 51
5.2.1 Ogólny schemat budowy i zasada działania cytometru
przepływowego............................................................................................51
5.2.2 Zalety wykorzystania cytometrii przepływowej .........................54
5.2.3 Materiał do analizy metodą cytometrii przepływowej...............55
5.2.4 Analiza cytometryczna................................................................. 55
5.3 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych.......................................57
5.3.1 Immunizacja zwierząt ..................................................................58
5.3.2 Hodowla szpiczaka.......................................................................59
5.3.3 Fuzja komórkowa tworzenie hybrydom ................................... 59
5.3.4 Hodowla hybrydom .....................................................................60
5.3.5 Oczyszczanie, testowanie przeciwciał monoklonalnych..............61
6
Spis treści
5.4 TEST MTT- BADANIE AKTYWNOŚCI METABOLICZNEJ I ŻYWOTNOŚCI
KOMÓREK ........................................................................................................ 61
5.5 CEL ĆWICZENIA.................................................................................... 61
5.6 MATERIAA DO ĆWICZEC ...................................................................... 62
5.7 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC ............................................. 62
5.7.1 Test MTT ...................................................................................... 62
5.7.2 Analiza cytometryczna limfocytów T:.......................................... 62
5.7.2.1 Określenie subpopulacji komórek krwi. Określenie wielkości i
ziarnistości komórek. Analiza antygenów powierzchniowych limfocytów
T: CD3, CD4, CD8, HLA-DR ....................................................................... 62
ĆWICZENIE 5. KOMÓRKI DENDRYTYCZNE- NOWA ERA TERAPII? .............. 64
6.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 64
6.1.1 Charakterystyka komórek dendrytycznych (DC), udział w
odpowiedzi immunologicznej...................................................................... 64
6.1.2 Subpopulacje komórek dendrytycznych...................................... 65
6.1.2.1 linia limfoidalna (komórki plazmacytoidalne) ......................... 65
6.1.2.2 linia mieloidalna....................................................................... 65
6.1.2.3 komórki pochodzenia monocytarnego.................................... 66
6.1.3 terapeutyczne wykorzystanie komórek dendrytycznych ............ 66
6.2 CEL ĆWICZENIA.................................................................................... 67
6.3 MATERIAA ............................................................................................ 67
6.4 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC ............................................. 68
6.4.1 Analiza fenotypu wygenerowanych komórek dendrytycznych... 68
7
Aleksandra Rutkowska
6.4.1.1 Analiza zmian fenotypu komórek dendrytycznych pod
mikroskopem świetlnym.......................................................................... 68
6.4.1.2 Analiza zmian fenotypu komórek dendrytycznych za pomocą
cytometrii przepływowej: FSC, SSC, CD11c, CD14, CD40, CD80, CD83,
CD86 69
ĆWICZENIE 6. ANALIZA FAZ CYKLU KOMÓRKOWEGO I APOPTOZY Z
WYKORZYSTANIEM CYTOMETRII PRZEPAYWOWEJ .....................................70
7.1 WSTP TEORETYCZNY.......................................................................... 70
7.1.1 Apoptoza......................................................................................70
7.1.2 Rola apoptozy w układzie immunologiczny. Aspekty kliniczne. .. 73
7.2 CYKL KOMÓRKOWY .............................................................................74
7.3 METODY OCENY APOPTOZY I FAZ CYKLU ............................................75
7.3.1 Ocena degradacji DNA elucja niskocząsteczkowego (LMW) DNA
75
7.3.2 Znakowanie wolnych końców 3 OH DNA (TUNEL) ...................... 76
7.3.3 Barwienie Aneksyną V- FITC ........................................................76
7.3.4 Barwienie jodkiem propidyny (PI) ...............................................76
7.4 CEL ĆWICZENIA .................................................................................... 77
7.5 MATERIAA DO ĆWICZEC ......................................................................78
7.6 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC .............................................78
7.6.1 Określenie poziomu apoptozy i odsetka komórek w
poszczególnych fazach cyklu komórkowego ...............................................78
7.6.1.1 cytometria przepływowa barwienie jodkiem propidyny......78
7.6.1.2 elektroforeza agarozowa ocena drabinki apoptotycznej .....79
ANEKS ..................................................................................................................80
8
Spis treści
9
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 1. HODOWLE KOMÓRKOWE. TWORZENIE
MODELU IN VITRO ODPOWIEDZI
IMMUNOLOGICZNEJ NA ANTYGENY BAKTERYJNE.
1.1 WSTP TEORETYCZNY
1.1.1 Odpowiedz nieswoista, cząstki PAMP, receptory TLR
Mimo ogromnego postępu naukowego współczesna medycyna nie potrafi nadal
do końca rozwiązać problemu zachorowalności i śmiertelności związanej z
infekcjami patogennymi mikroorganizmami. Niebezpieczne drobnoustroje
zasiedlają niemal wszystkie nisze ekologiczne, stąd ze wszystkich stron jesteśmy
narażeni na podstępny atak. W walce z patogenami nie jesteśmy jednak bez
szans, dzięki integralnej części naszego organizmu układowi
immunologicznemu. Pierwsza linia obrony przeciwbakteryjnej opiera się między
innymi na istnieniu szczelnych barier mechanicznych w postaci skóry i błon
śluzowych, ruchu rzęsek w tchawicy czy niskiego pH w żołądku. Taki nieswoisty
(wrodzony) system obrony sprawia, że tylko niewielka ilość potencjalnie
groznych mikroorganizmów z naszego otoczenia może przenikać do tkanek. Jeśli
jednak dojdzie do przełamania barier, organizm musi natychmiastowo uruchomić
systemy obronne w celu błyskawicznego zahamowania rozprzestrzeniającej się
infekcji. Niewątpliwie ogromną rolę odgrywają tu mechanizmy nieswoiste, które
charakteryzują się większą szybkością niż odpowiedz swoista, co ma kluczową
rolę, gdy wezmie się pod uwagę szybkość podziałów bakteryjnych (1 podział
komórki w ciągu 20 minut). Aby doszło do rozwoju nieswoistej reakcji obronnej,
układ immunologiczny organizmu musi rozpoznać obecność drobnoustrojów.
Jest to możliwe dzięki występowaniu na komórkach obrony nieswoistej
receptorów selektywnie rozpoznających wzorce molekularne związane z
patogenami, zwane cząstkami PAMP (ang. pathogen associated molecular
patterns), czyli najbardziej charakterystyczne struktury drobnoustrojów.
Receptory rozpoznające wzorce PRR (ang. pathogen recognition receptors),
występujące na wielu rodzajach komórek (limfocytach, monocytach,
makrofagach, neutrofilach, komórkach dendrytycznych) pełnią niezwykle ważne
funkcje w organizmie. Dzięki rozpoznaniu klasy patogena (cząstki PAMP są
typowe dla całych grup mikroorganizmów np. lipopolisacharyd dla bakterii
grammujemnych) możliwe jest precyzyjne dopasowanie mechanizmów
obronnych. Jeśli patogen jest zewnątrzkomórkowy, system immunologiczny
błyskawicznie aktywuje eozynofile i produkcję interleukiny 4 (IL-4) oraz
immunoglobulin E (IgE) (odpowiedz typu TH2), natomiast przy infekcji
drobnoustrojami pasożytującymi wewnątrzkomórkowo (wirusy, niektóre bakterie
np. Chlamydia pneumoniae) dochodzi do aktywacji komórek NK (ang. natural
10
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
killers naturalni zabójcy) oraz sekrecji m.in. interferonu gamma (IFN- ł)
(odpowiedz typu TH1). Do najlepiej scharakteryzowanych receptorów PRR
należą receptory Toll-podobne (TLR, ang. Toll-like receptors), odkryte przy
okazji badań nad mechanizmem rozwoju muszki owocowej Drosophila
melanogaster. Receptory TLR rozpoznają wiele składników mikroorganizmów
takich jak lipopolisacharyd bakterii grammujemnych (TLR4), peptydoglikany
(TLR2), kwas lipotejchojowy bakterii grammdodatnich (TLR2, TLR4) czy
bakteryjne DNA (TLR9). Aktywują one komórki układu odpornościowego do
sekrecji szeregu cytokin i chemokin, co prowadzi do zwiększenia
przepuszczalności naczyń i napłynięcia do miejsca infekcji komórek obronnych.
Ta niezwykle silnie konserwowana filogenetycznie rodzina 10 receptorów
zawdzięcza swą nazwę genowi toll , który nie tylko odpowiada za rozwój
embrionalny muszki, ale także koduje receptor, który bierze udział w reakcjach
obronnych (podobnie jak w komórkach ssaków). Ssacze receptory TLR posiadają
zewnątrzkomórkowe domeny bogate w leucynę (LRRs, ang. leucine reach
repeats) oraz fragmenty cytoplazmatyczne z domeną TIR (Toll-IL-1R, przez
analogię do odcinków występujących w receptorach interleukiny 1).
1.1.2 Bakteryjne DNA-specyficzne cząstki PAMP
Ostatnie badania wskazują na potencjalne immunostymulujące
właściwości bakteryjnego DNA. W przeciwieństwie do genomów kręgowców, u
których częstotliwość występowania dinukleotydów cytozyna guanozyna
(CpG) waha się w granicach 1/50-1/60, u bakterii wynosi ona około 1/16.
Dodatkowo mniej niż 5% cytozyn w dinukleotydach CpG bakteryjnego kwasu
nukleinowego jest zmetylowana, podczas gdy aż 70-90% tych dinukleotydów w
ssaczych genomach zawiera zmetylowana cytozynę. Podczas infekcji uwolnienie
takiego niemetylowanego CpG DNA z komórki bakteryjnej rozpoznawane jest
przez gospodarza jako sygnał o niebezpieczeństwie i wyzwala odpowiedz
obronną. CpG DNA aktywuje kaskadę mechanizmów, które prowadzą do
dojrzewania, różnicowania i proliferacji komórek układu immunologicznego
takich jak limfocyty B i T, komórki NK, monocyty, makrofagi oraz komórki
dendrytyczne. DNA zawierający niemetylowane motywy CpG nie tylko
indukuje poliklonalną aktywację limfocytów B, ale stymuluje także pozostałe
komórki do sekrecji prozapalnych cytokin: interleukiny 1 (IL-1), IL-6, IL-18 oraz
martwiczego czynnika nowotworu alfa (TNF-ą, ang. tumor necrosis factor
alpha). Dodatkowo, wydzielana IL-12 stymuluje aktywność przeciwbakteryjną,
przeciwwirusową, przeciwnowotworową komórek NK oraz sekrecję IFN- ł,
należącego do cytokin typu TH1. Wydzielane cytokiny (zarówno prozapalne jak i
typu TH1) wraz z innymi przeciwbakteryjnymi produktami takimi jak tlenek
azotu, czy fosfolipaza D mają na celu zahamowanie rozwijającej się infekcji.
1.1.3 Oligodeoksynukleotydy typy, zastosowanie kliniczne
Szereg badań nad immunomodulacyjnymi właściwościami bakteryjnego
DNA na układ odpornościowy kręgowców, zarówno tych o pozytywnych,
11
Aleksandra Rutkowska
terapeutycznych aspektach, jak i tych negatywnych, niebezpiecznych dla
zdrowia narzuciło konieczność znalezienia syntetycznego analogu, który mógłby
zostać powszechnie (bez ryzyka kontaminacji innymi składnikami komórek
bakteryjnych) wykorzystany w doświadczeniach in vitro i in vivo. Na początku
lat 90-tych ubiegłego stulecia japoński naukowiec S. Yamamoto udokumentował
po raz pierwszy aktywację komórek NK i sekrecję IFN- ł po stymulacji
syntetycznymi oligodeoksynukleotydami, których sekwencje nukleotydowe
oparto na wzorze genomu bakteryjnego.
Od tego momentu wiele grup badawczych na całym świecie rozpoczęło
poszukiwania takiej sekwencji nukleotydowej oligodeoksynukleotydów, która
byłaby optymalna dla celów terapeutycznych a jej stosowanie nie przynosiłoby
efektów ubocznych. Postęp w badaniach nad oligonukleotydami wykazał, że
efekty stymulacji układu odpornościowego zależą przede wszystkim od długości
(min. 10 nukleotydów), sekwencji nukleotydowej, ilości powtórzeń
niemetylowanego motywu CpG (oraz jego lokalizacji w sekwencji), a także typu
wiązań pomiędzy nukleotydami.
Ze względu na specyficzną budowę oligonukleotydów i związane z nią
różnice w stymulacji aktywności ludzkich jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej wyróżniono trzy grupy: ODN typu K (zwany również typem B),
ODN typu D (typ A) i ODN typu C.
Typ K oligodeoksynukleotydów posiada fosforosiarczanowy
(phosphothioate) szkielet i wielokrotnie powtórzony niemetylowany motyw
CpG. Dzięki takiemu rozwiązaniu są one mniej wrażliwe na działanie enzymów
trawiących kwas nukleinowy (DNaz) i wykazują dłuższy czas półtrwania in vivo
niż tradycyjne oligonukleotydy zawierające fosfodiestrowe wiązania. Za
optymalną sekwencję uważa się powtórzone motywy TCGTT i/lub TCGTA,
które silnie stymulują proliferację oraz sekrecję IL-6 oraz IgM. Przyjmuje się, że
aktywność oligonukleotydów typu K rośnie wraz z ilością powtórzonych
niemetylowanych motywów CpG oraz wraz z długością sekwencji (min. 12
nukleotydów). Zaobserwowano również, że położenie motywu CpG w
oligonukleotydach ma znaczenie dla ich aktywności. Odnotowano bowiem, iż
sztucznie syntetyzowane oligodeoksynukleotydy zawierające silnie stymulujący
motyw CpG przy końcu 5 indukują dużo silniejszą aktywację układu
immunologicznego niż te, które zawierały mniej aktywny motyw w tej samej
pozycji. Oligodeoksynukleotydy typu K wywołują silną odpowiedz organizmu,
która objawia się przede wszystkim aktywacją limfocytów B, ich proliferacją i
sekrecją IL-6 oraz immunoglobulin (IgM). Dodatkowo indukują dojrzewanie
komórek dendrytycznych pochodzenia plazmacytoidalnego.
Oligodeoksynukleotydy typu D charakteryzuje mieszany
fosfodiestrowo-fosforosiarczanowy (phosphothioate) szkielet oraz niezbędny dla
ich aktywności motyw, w którym niemetylowany dinukleotyd CpG jest
oflankowany z obu stron puryną i pirymidyną (puryna,/pirymidyna/CG/
puryna,/pirymidyna). Dodatkowym elementem wymaganym dla wysokiej
aktywności oligonukleotydów tego typu jest ogon poliguaninowy (poli-G) na
końcu 3 sekwencji, który może tworzyć strukturę pętli.
12
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
Minimalną długością sekwencji nukleotydowej dla optymalnej
aktywności oligonukleotydu wydaje się być wg D. Verthelyi i wsp. 18 par zasad.
Co ciekawe, niektórzy badacze sugerują, iż nie ma przesłanek, aby
sądzić, iż typ D oligonukleotydów oddziałuje z receptorami TLR9, a nawet
podejrzewają, iż długi ogon poliguaninowy może oddziaływać z receptorem
zmiataczem (ang. scavenger receptor) obecnym na wielu komórkach układu
immunologicznego. Mimo wielu wątpliwości, związanych z mechanizmem
rozpoznawania oligonukleotydów typu D przez komórki układu
immunologicznego, znany jest efekt ich aktywności. Stymulują one sekrecję
IFN-alfa przez komórki dendrytyczne pochodzenia plazmacytoidalnego oraz
przez komórki NK. Jak łatwo zauważyć oba typy oligodeoksynukleotydów
oddziałują z różnymi typami komórek układu odpornościowego i wywołują
odmienne odpowiedzi immunologiczne. Typ D silnie stymuluje produkcję IFN-
alfa, ale niewiele wiadomo o jego działaniu na limfocyty B, podczas gdy typ K
oligonukleotydów wykazują odwrotny efekt działania. Połączenie unikalnych
cech sekwencji obu typów zaowocowało powstaniem oligonukleotydu, który nie
tylko silnie stymulował komórki B do zwiększonej produkcji IL-6, ale
jednocześnie aktywował sekrecję IFN- alfa przez komórki dendrytyczne
pochodzenia plazmacytoidalnego.
Tak powstał typ C oligodeoksynukleotydów, którego budowa opiera się
o szkielet fosforosiarczanowy. Zawiera on palindromową sekwencję z centralnie
umieszczonym niemetylowanym dinukleotydem CpG (cecha ODN typu D) oraz
pojedynczy lub wielokrotnie powtórzony motyw GTCGTT (cecha ODN typu K).
Dodatkowo jego aktywność zwiększa położony przy końcu 5 dimer TCG
(TCGTCG), ale jednocześnie do stymulacji sekrecji IFN- alfa nie jest wymagany
ogon poliguaninowy na końcu 3 . Duże nadzieje wiąże się z poszukiwaniem
optymalnych sekwencji oligodeoksynukleotydów, które dzięki ich
immunomodulacyjnym właściwościom mogłyby zostać potencjalnie
wykorzystane w leczeniu.
Obecnie prowadzi się pierwsze próby kliniczne, mające na celu
sprawdzenie możliwości zastosowania oligonukleotydów z motywem CpG w
immunoprotekcji, leczeniu nowotworów, alergii. Wydaje się, iż ochrona
przeciwnowotworowa wywołana poprzez stymulację oligodeoksynukleotydami
z niemetylowanymi wyspami CpG skupia się przede wszystkim na
komponentach odpowiedzi nieswoistej niż odpowiedzi. Przeciwnowotworowe
właściwości oligonukleotydów prawdopodobnie opierają się na zwiększaniu
litycznej aktywności komórek NK. Nie wyklucza się także roli komórek
dendrytycznych, co sugerują wyniki modeli, w których komórki NK spowalniały
wzrost guza, ale nie powodowały jego regresji. Mimo, iż nadal trwają badania,
które pozwolą na znalezienie sekwencji oligonukleotydów optymalnych dla
aktywacji komórek NK lub cytotoksycznych limfocytów T, to już teraz z
powodzeniem stosuje się je w terapii białaczek, czerniaka, nowotworów jelit.
Oligonukleotydy, zawierające niemetylowany motyw CpG mogą być
wykorzystane ze względu na unikalne właściwości zarówno w leczeniu infekcji,
jak i immunoprotekcji. Jest to zasługa szybkiej aktywacji odpowiedzi
13
Aleksandra Rutkowska
nieswoistej, która poprzez wydzielane cytokiny prozapalne i tlenek azotu,
aktywację fagocytów, komórek NK hamują rozwój infekcji.
W 1998 roku Zimmermann i wsp. po raz pierwszy opublikowali wyniki
skutecznej terapii infekcji Leishmania major z wykorzystaniem
oligonukleotydów. Zawarty w nich motyw CpG zmieniał profil cytokin
produkowanych przez limfocyty z sekrecji IL-4 na IFN- ł oraz klasy przeciwciał
z IgG1 na IgG2a lub IgG2b. Taka odpowiedz hamowała rozwój choroby, i
jednocześnie zapewniała ochronę podczas powtórnej infekcji. Co więcej, w
kolejnych badaniach Zimmermann i wsp. wykazali, że oligonukleotydy
wykazują także terapeutyczne działanie po ich podaniu nawet po 20 dniach od
rozpoczęcia infekcji L. major. Leczenie z wykorzystaniem
oligodeoksynukleotydów wydaje się być również skuteczne w przypadku
infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi m.in. Franciscella tularensis czy
Listeria monocytogenes. Już pojedyncza dawka oligonukleotydów wystarczała
do indukcji immunoprotekcji opartej na aktywności limfocytów B oraz produkcji
IFN- ł. Kilkukrotne podanie oligonukleotydów zapewniało długotrwałą ochronę
przeciwko tym bakteriom. Dzięki immunostymulującym właściwościom
oligonukleotydów z motywem CpG, które objawiają się m.in. aktywacją
komórek prezentujących antygen oraz zwiększeniem ekspresji cząsteczek
kostymulujących na powierzchni komórek układu odpornościowego mają one
szanse by być wykorzystane jako adiuwanty w szczepionkach. Jednoczesne
podanie CpG DNA i oczyszczonych antygenów prowadzi do rozwoju
odpowiedzi opartej na antygenowo-specyficznych limfocytach B i komórkach T,
co czyni je przydatnymi jako nowa klasa adiuwantów.
Unikalne, terapeutyczne działanie oligonukleotydów objawia się również
przez przesuwanie równowagi z odpowiedzi typu TH2 (IL-4, IL-5, IgG1),
charakterystycznej dla rozwoju alergii na TH1 (IFN- ł, IgG2a), dzięki czemu
terapia oligonukleotydami może hamować rozwój schorzenia, a nawet jest
skuteczna w leczeniu astmy .
O skuteczności terapii oligodeoksynukleotydami decyduje wiele
czynników. Jednym z nich jest budowa szkieletu oligonukleotydu, a właściwie
rodzaj połączeń pomiędzy nukleotydami, który decyduje o stabilności i czasie
półtrwania (modyfikowane wiązania fosfosiarcznanowe wydają się być
najstabilniejsze).
Dużą rolę w wyborze terapii odgrywa typ oligodeoksynukleotydu i
związane z nim właściwości immunomodulacyjne. Typ D wydaje się być
korzystniejszy w leczeniu alergii oraz infekcji patogenami
wewnątrzkomórkowymi, podczas gdy typ K może być wykorzystany jako
adiuwant w szczepionkach indukujących silna odpowiedz humoralną.
Dodatkowo, bardzo ważną rolę w osiągnięciu pozytywnego efektu
terapeutycznego odgrywa miejsce podania oligonukleotydów. Przykładowo,
oligodeoksynukleotydy podane dopochwowo zapewniały odporność przeciwko
wirusowi Herpes simplex, czego nie osiągnięto w leczeniu systemicznym.
W przeciwieństwie do szczepionek antygenowo-specyficznych, po
których odporność organizmu rozwija się w ciągu tygodni, ale może trwać przez
14
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
całe życie, CpG DNA aktywuje odpowiedz w ciągu paru dni, ale zapewnia
ochronę tylko na około dwóch tygodni. Szczepionki na bazie oligonukleotydów
mogą być wykorzystywane w terapii infekcji wolno rosnącymi patogenami bądz
niskimi dawkami bardziej agresywnych patogenów. Wydają się również
użyteczne dla uzyskania odporności u pacjentów, o których wiadomo, iż mogą
być narażeni na infekcje.
Aby przedłużyć dość krótką aktywność oligodeoksynukleotydów, co
zwiększyłoby potencjalnie ich terapeutyczną użyteczność próbuje się dwie nowe
metody ich podawania. Jedną z nich jest powtarzanie dawek oligonukleotydów
co dwa tygodnie, druga zakłada ich enkapsulację w kationowe liposomy, które
znacznie zwiększają pobieranie CpG DNA i nawet dwukrotnie wydłużają
odporność.
1.2 HODOWLE KOMÓRKOWE
Ryc1.1. Przykład hodowli komórek w różnych naczyniach hodowlanych
(płytki wielodołkowe, szalki Petriego, butelki)
1.2.1 Definicja
Hodowla komórkowa jest modelem in vitro próbującym odzwierciedlić
system in vivo. Umożliwia utrzymanie żywych komórek poza organizmem przez
minimum 24 h
15
Aleksandra Rutkowska
1.2.2 Typy hodowli:
A) podział ze względu pochodzenie komórek i ich czas życia:
1. hodowle pierwotne hodowle komórek wyizolowanych
z organizmu
2. hodowle ciągłe - hodowle unieśmiertelnione i
transformowane nowotworowo
B) podział ze względu na typ hodowli:
1. hodowle w zawiesinie
2. hodowle komórek przylegających
3. hodowle na mikronośnikach
4. hodowle przestrzenne
TYPY HODOWLI
A) HODOWLE PIERWOTNE
Hodowle pierwotne zakładane są z pojedynczych komórek świeżo
wyizolowanych z organizmu. Mogą to być zarówno komórki bezpośrednio
izolowane z organizmu np. komórki krwi lub uzyskane po działaniu enzymów
na pobrany fragment tkanki. Komórki te proliferują i tworzą skupiska (klony) w
zawiesinie lub jednolitą warstwę na podłożu. Po pierwszym pasażu, czyli
rozdzieleniu i przeniesieniu do nowego naczynia komórek z konfluntej hodowli
(zbyt duża ilość komórek na powierzchnię podłoża prowadzi do zjawiska
kontaktowego zahamowania wzrostu, starzenia się hodowli i obumierania) staje
się linią komórkową.
W immunologii bardzo często wykorzystuje się hodowle pierwotne do
oceny morfologii i funkcji komórek układu odpornościowego. Z krwi żylnej
izoluje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC; ang. peripheral
blood mononuclear cells), które stanowią podstawową bazę do zakładana
stymulacji. Wykorzystuje się też poszczególne subpopulacje komórek tj.
monocyty, limfocyty, komórki dendrytyczne. wymagają one specyficznych
warunków hodowli i odpowiednich suplementów.
B) LINIE KOMÓRKOWE. HODOWLE UNIEŚMIERTELNIONE
Linia komórkowa powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu.
Wyróżniamy dwa typy linii: linia o określonej długości życia (najczęściej
wywodzi się z linii komórek diploidalnych, po kilku pasażach zamiera) oraz tzw.
linia komórkowa ciągła. Linia ta powstaje albo w wyniku unieśmiertelnienia
16
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
komórek na skutek transfekcji lub transformacji spontanicznej. Mogą to być
również komórki nowotworowe. Linie komórkowe mają tą przewagę nad
hodowlą pierwotną, że są bardziej homogenną populacją i zapewniają tym
samym lepszą powtarzalność wyników.
Spośród wielu rodzajów linii komórkowych, w immunologii najczęściej
wykorzystuje się komórki:
WEHI 164 linia komórek nowotworowych wyizolowanych z mysiego
fibrosarcoma (włókniakomięsak). Są wrażliwe na
działanie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF).
Wykorzystywane do testów biologicznych w celu
oznaczenia aktywności biologicznej tej cytokiny w
surowicy krwi czy w nadsączach znad hodowli
(supernatantach).
B9 hybrydoma powstała po fuzji komórek mysiej śledziony z
komórkami szpiczaka. Jest to linia, która potrzebuje do wzrostu
interleukiny 6 (IL-6), stąd wykorzystuje się ją do oznaczeń jej aktyw
biologicznej.
K562 linia nowotworowa wywodząca się z komórek przewlekłej
białaczki szpikowej pobranych w fazie przełomu blastycznego.
Wykorzystywane są w testach określających aktywność
cytotoksyczną komórek NK, ze względu na brak ekspresji
częsteczek MHC kl. I.
U937 monocyt arna linia białaczkowa naśladująca hodowle pierwotne
monocytów.
17
Aleksandra Rutkowska
C) HODOWLE W ZAWIESINIE
`
Ryc1.2. Komórki nieprzylegające (limfocyty), rosnące w zawiesinie
Są to hodowle, w których komórki, aby proliferować nie muszą mieć
kontaktu z podłożem. Tworzą się klony (grona) komórek. Najczęściej prowadzi
się je w butelkach hodowlanych, czasem w specjalnych naczyniach z
wbudowanym mieszadełkiem, które zapewnia stały ruch pożywki i chroni przed
opadaniem na dno, a na skalę przemysłową w bioreaktorach.
W immunologii takimi nieprzylegającymi komórkami są: limfocyty,
komórki NK, linie komórkowe B9 i K562.
D) HODOWLE KOMÓREK PRZYLEGAJCYCH
Ryc1.3. Komórki
przylegające. Zdjęcie
przedstawia 5 -
dniową hodowlę PBMC w
obecności czynników
stymulujących.
18
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
Komórki przylegające potrzebują kontaktu z podłożem do proliferacji. W
takich warunkach interakcje między komórkami sprzyjają wzajemnym
korzystnym oddziaływaniom. Utrata zdolności przylegania komórek lub nie
sprzyjające warunki hodowlane przyczyniają się do obumierania hodowli.
Komórki przylegające; monocyty, komórki dendrytyczne, WEHI 164, linia U937
E) HODOWLE NA MIKRONOŚNIKACH
Dodanie do hodowli mikronośników w postaci kuleczek (plastikowych,
szklanych, czy z dekstranu) zwiększa kilkukrotnie powierzchnię hodowlaną przy
zastosowaniu małej objętości pożywki.
F) HODOWLE PRZESTRZENNE
Wykorzystywane są w hodowlach narządowych. Dzięki próbom stworzenia
przestrzennego układu (trójwymiarowe rusztowania) naśladującego interakcje
między komórkami zachodzące in vitro stanowią obecnie najlepszy model
doświadczalny.
1.2.3 Zalety i wady hodowli komórkowych
A. ZALETY
1. Badacz ma możliwości prowadzenia doświadczeń (np. testowania leków)
na wybranej linii komórek. Dzięki temu mona ocenić wpływ badanej
substancji (np. leku) na przeżywalność, metabolizm, fenotyp, czy
odpowiedz określonej komórki.
2. Hodowle komórkowe są modelem odzwierciedlającym patologiczne
zmiany in vivo.
3. Ścisła kontrola parametrów środowiska, stosowanie gotowych podłóż
hodowlanych i suplementów zapewnia powtarzalność eksperymentu i
wiarygodne wyniki
4. Hodowle komórkowe w zdefiniowanych warunkach umożliwiają
badanie interakcji komórka-komórka
5. Koszt prowadzenia linii komórkowej jest niższy niż prowadzenie
doświadczeń na zwierzętach (nie dotyczy to jednak hodowli
przemysłowych)
19
Aleksandra Rutkowska
B. WADY
1. Mimo wielu zalet hodowle komórkowe nadal są tylko modelami in vitro,
które tylko naśladują systemy in vivo.
2. Wyizolowanie komórek z trójwymiarowych układów, jakimi są narządy
i przeniesienie ich do płaskich naczyń hodowlanych może zmienić
zarówno ich fenotyp jak i metabolizm.
3. Monokultury pozbawione są wielu niezbędnych bodzców generowanych
przez inne komórki
4. Hodowle komórkowe (zwłaszcza linie ciągłe, po wielu pasażach) są
niestabilne genetycznie, co może wpływać na ich heterogenność
5. Hodowle komórkowe są bardzo podatne na zakażenia, które mogą
zakłócać wiarygodność wyników
6. Nie wszystkie komórki są nadal możliwe do hodowania
7. Problem starzenia się hodowli (zwłaszcza diploidalnych komórek w
hodowlach pierwotnych)
1.2.4 Zastosowanie hodowli komórkowych
Ryc1.4. Przykładowe zastosowanie hodowli komórkowych
20
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
PRZYKAADOWE ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH
1. testowanie toksyczności leków
2. produkcja szczepionek
3. hodowanie tkanek do przeszczepów
4. badanie odpowiedzi immunologicznej
5. badanie interakcji komórka-komórka
6. produkcja rekombinowanych białek
7. produkcja przeciwciał monoklonalnych
8. baza do hodowli wirusów
9. ... i wiele innych zastosowań... :)
1.2.5 Metody hodowli komórkowej
1.2.5.1 Metody izolacji komórek układu immunologicznego
Zakładanie hodowli pierwotnych komórek układu immunologicznego
wymaga ich izolacji z organizmu. U zwierząt laboratoryjnych najczęściej pobiera
się śledzionę, grasicę czy obwodowe węzły chłonne, szpik kostny lub makrofagi
z otrzewnej. U ludzi pobranie takich narządów wiąże się z zabiegami
chirurgicznymi, stąd najlepszym i najłatwiej dostępnym zródłem komórek
immunologicznych jest krew obwodowa.
1.2.5.1.1 Metody izolacji ludzkich jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej.
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izoluje się metodą wirowania w
gradiencie gęstości. Wykorzystuje się Fikol, złożony, hydrofilowy polisacharyd,
który charakteryzuje się wyższą gęstością właściwą niż limfocyty i niższą od
erytrocytów i granulocytów. Pozwala więc na rozdział komórek na poszczególne
frakcje. Rozcieńczoną krew nawarstwia się na mieszaninę Fikol-Paque lub Fikol-
Uropolina. Wirowanie probówki przy odpowiedniej ilości obrotów powoduje
separację PBMC na poszczególne frakcje komórek. Erytrocyty i granulocyty
przechodzą przez warstwę Fikolu i osiadają na dnie probówki, natomiast
limfocyty i monocyty tworzą kożuszek komórek na granicy warstw Fikolu i
21
Aleksandra Rutkowska
osocza. Należy delikatnie zebrać warstwę komórek z kożuszka a następnie
kilkukrotnie przepłukać buforem PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+ w celu
odpłukania niepotrzebnych elementów. Istnieją komercyjne zestawy do izolacji
PBMC z pełnej krwi, które znacznie skracają czas procedury. Przykładowo
probówki CPT, dzięki unikalnemu, żelowemu wypełnieniu rozdzielają frakcje
powyżej żelowej bariery znajduje się warstwa surowicy oraz obłoczek
limfocytów i monocytów, poniżej warstwa neutrofili i erytrocytów.
Jednojądrzaste komórki krwi można rozseparować na poszczególne frakcje
komórek. Wykorzystując zdolność przylegania monocytów do podłoża, można je
oddzielić poprzez 2h inkubację PBMC sterylnej płytce Petriego w cieplarce
(37�C, 5%CO2, 100% wilgotności). Zebrany nadsącz stanowią komórki
nieprzylegające (limfocyty). Komórki przylegające (monocyty) przepłukuje się
lodowatym buforem PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+, który ułatwia
odklejanie się komórek. Do rozdziału komórek na poszczególne subpopulacje
najczęściej wykorzystuje się cytometr przepływowy z przystawką sortującą
FACS, który pozwala na rozdział np. na subpopulacje limfocytów T i B. Zasady
działania cytometru przepływowego omówione będą szerzej w ćwiczeniu 4.
Ryc1.5. Rozdział komórek krwi po wirowaniu w gradiencie gęstości
Fikol-Uropolina
22
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
1.2.5.1.2 Metody izolacji komórek mysich na przykładzie osteoklastów
Po uśpieniu i przerwaniu rdzenia kręgowego myszy linii C57b2 pobiera
się dwie długie kości kończyn - kość udową i piszczelową. Kości oczyszcza się
z mięśni i umieszcza się w buforze PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+.
Następnie sterylizuje się je w 70% roztworze etanolu i przemywa na płytce
Petriego sterylnym buforem PBS, w celu odpłukania alkoholu. Kości umieszcza
się w medium dla osteoklastów (OCM) i odcina końcówki. Świeżym OCM
wypłukuje się szpik kostny i przenosi do jałowego Corninga. Agregaty
komórkowe rozbija się przez stanowcze rozpipetowanie pożywki. Komórki
wiruje się (1000 obr/min; 10 min.). Do peletu komórek dodaje się świeżego
OCM i inkubuje się na płytce ok. 2h. Nieprzylegające komórki zbiera się i
nakłada na płytkę wołową. Pożywkę suplementuje się czynnikami stymulującymi
różnicowanie się osteoklastów: RANKL, M-CSF.
1.2.6 Naczynia hodowlane, pożywki
1.2.6.1.1 Naczynia hodowlane
Do hodowli komórkowych (tkankowych) używa się przede wszystkim
sterylnych, szklanych lub plastikowych (obecnie najczęściej) naczyń
płaskodennych:
" butelki hodowlane - ze specjalnymi zatyczkami, które umożliwiają
swobodną wymianę gazową, ale zapobiegają zakażeniu hodowli.
Wykorzystywane są do hodowli komórek w większej ilości pożywki.
23
Aleksandra Rutkowska
" Płytki (szalki) Petriego wykorzystywane do hodowli komórek
przylegających
" Płytki do hodowli - 4-, 6-, 24- lub 96-dołkowe. Im więcej dołków, tym
mniejsza ich średnica i tym samym mniejsza objętość pożywki
hodowlanej. Przykrywka ogranicza parowanie pożywki, ale umożliwia
wymianę gazową.
Aby poprawić warunki hodowli podłoże w naczyniach hodowlanych można
pokrywać kolagenem, czy fibronektyną, które ułatwiają adhezję i wzrost
komórek przylegających lub hodowlą fibroblastów, które dostarczają
niezbędnych czynników wzrostowych.
24
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
1.2.6.1.2 Pożywki
Pożywki do hodowli różnią się w zależności od typu hodowanych
komórek, jednak istnieją podstawowe zasady komponowania składu. Przede
wszystkim w składzie każdego medium musi się znalezć zródło energii w postaci
węglowodanów (najczęściej glukoza lub galaktoza), aminokwasy, kwasy
tłuszczowe, lipidy, cholesterol. Bardzo ważny jest dodatek soli nieorganicznych,
które utrzymują ciśnienie osmotyczne, pH, czy potencjał błonowy. Pełnią one
również kluczową rolę jako kofaktory reakcji enzymatycznych. Do pożywki
dodaje się także związki buforujące pod postacią NaHCO3, który wraz z
gazowym CO2 w inkubatorze (5-10% atmosferze) utrzymują odpowiednie pH.
Markerem właściwego pH jest czerwień fenolowa. Dodatkowo pożywki
suplementuje się witaminami (ryboflawina, tiamina, biotyna), mikroelementami
(cynk, miedz, selen), hormonami, czynnikami wzrostu. Dodaje się również
antybiotyki (penicylina, streptomycyna), które zmniejszają ryzyko zakażenia
hodowli komórkowej. Kluczowym suplementem pożywki hodowlanej jest
bydlęca (FBS) lub cielęca (FCS) surowica płodowa. Stanowi ona cenne zródło
białek (m.in. albumin), witamin, hormonów, czynników wzrostowych,
adhezyjnych etc. Zwykle dodaje się jej do pożywki w ilości 5-10% części
objętościowych. Mimo wielu zalet, suplementowanie pożywek surowicą niesie
za sobą pewne ryzyko. Przede wszystkim istnieje ryzyko zakażenia wirusowego
hodowli. Poza tym składniki surowicy nie mają ustalonego stężenia, każda
kolejna partia może różnić się między sobą dając odmienne wyniki.
1.2.6.2 Zakładanie hodowli, zmiana pożywek, pasażowanie
25
Aleksandra Rutkowska
1.2.6.2.1 Zakładanie hodowli komórkowej
Po izolacji komórek zawieszamy je w ogrzanej do temperatury 37�C
pożywce i nakładamy w odpowiedniej ilości do naczynia hodowlanego.
Otrzymanie odpowiedniego stężenia komórek w zawiesinie ułatwia liczenie ich
w hemocytometrze (komora Fuchsa-Rosenthala, Bqrkera). Jest to grube szkiełko
podstawowe, pokryte siatką prostopadłych do siebie linii (kształt litery H),
przykryte szkiełkiem nakrywkowym, położonym dokładnie na wysokość 0,1 nm
od szkiełka podstawowego. Linie tworzą siatkę Thoma, która składa się z 16
kwadratów, rozdzielanych potrójnymi liniami. Całkowita powierzchnia siatki
wynosi 1 mm2. Określoną objętość wybarwionych (płyn Tqrka) komórek
nakłada się pod szkiełko nakrywkowe a następnie zlicza się pojedyncze komórki
w poszczególnych kratkach. Aby uniknąć błędu w obliczeniach, nie liczy się
komórek na lewych i górnych liniach ograniczających. Ilość wyizolowanych
komórek wylicza się z matematycznego wzoru, uwzględniającego parametry
kamery, rozcieńczenie.
Ryc1.6. Schemat kamery Fuchsa-Rosenthala
26
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
LAMINAR CIEPLARKA
Ryc1.7. Niezbędny sprzęt laboratoryjny do prowadzenia hodowli
komórkowych: laminar i cieplarka
1.2.6.2.2 Zmiana pożywek hodowlanych
Hodowla komórek w warunkach in vitro powoduje nagromadzenie się
metabolitów (często toksycznych) w pożywce. Wpływają one negatywnie na stan
komórek, które przestają się dzielić, zmieniają fenotyp i w końcu zaczynają
27
Aleksandra Rutkowska
obumierać. Im wyższa gęstość hodowli tym szybszy spadek składników
odżywczych i wzrost metabolitów w pożywce, a więc i częstsza potrzeba zmiany
medium hodowlanego. Bardzo przydatnym indykatorem zmian jest czerwień
fenolowa, która zmienia barwę na żółtą pod wpływem zmian pH. Istnieje kilka
podstawowych zasad prawidłowej zmiany medium hodowlanego. Po pierwsze
wymianę pożywki wykonujemy w sterylnych warunkach. Świeżą pożywkę
zawsze podgrzewamy do temperatury 37�C, aby komórki nie przeżyły szoku
termicznego. Zużytą pożywkę usuwa się z naczynia hodowlanego za pomocą
jednorazowej pipety pasterowskiej lub pipety automatycznej, pozostawiając
jednak pewną jej objętość, aby nie pozbawić komórek wyprodukowanych już
czynników wzrostowych. Butelkę ze świeżą pożywką dezynfekuje się 70%
etanolem, opala nad palnikiem gazowym. Pożywkę pobieramy jednorazową
strzykawką i dodajemy do komórek.
1.2.6.2.3 Pasażowanie komórek
Aby zapobiec odróżnicowaniu się komórek oraz zjawisku kontaktowego
zahamowania wzrostu w konfluentnej hodowli należy wykonać pasażowanie,
czyli przeniesienie części komórek. W przypadku hodowli komórek w zawiesinie
procedura jest prostsza, ponieważ wystarczy przenieść część zawiesiny komórek
do nowego naczynia i uzupełnić świeżym medium. Komórki przylegające należy
najpierw mechanicznie oderwać od podłoża przy pomocy sterylnej drapaczki,
delikatnie rozpipetować, aby rozbić zlepki komórek i równomiernie
rozprowadzić w zawiesinie, a następnie można przenieść do nowego naczynia.
1.2.6.2.4 Mrożenie, bankowanie i rozmrażanie komórek
Komórki, które nie są w danym momencie wykorzystywane, mogą być
przetrzymywane zamrożone nawet przez wiele lat w ciekłym azocie. Zamrażane
komórki muszą być w fazie log wzrostu oraz być w dobrej kondycji, aby uniknąć
strat w czasie przechowywania. Do krioampułki zawierającej komórki dodaje się
znacznie wyższe stężenie surowicy min. 20% oraz DMSO (dimetylosulfotlenek)
lub glicerol (10%), które chronią przed powstającymi kryształkami lodu. Proces
zamrażania przeprowadza się stopniowo, obniżając temperaturę o 1�C na minutę.
Po zamrożeniu komórki umieszcza się w ciekłym azocie (-196�C).
Komórki rozmraża się w możliwie jak najkrótszym czasie, aby
uniknąć toksycznego działania DMSO. Krioampułkę umieszcza się w łazni
wodnej w temperaturze 37�C i w momencie rozpuszczenia zawartości, przenosi
się komórki do dużej objętości ogrzanej pożywki, wiruje (1100 obr./min, 5 min) i
odpłukuje toksyczne związki.
28
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
1.3 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest stworzenie modelu in vitro odpowiedzi
immunologicznej na antygeny bakteryjne.
UWAGA: Założone hodowle i stymulacje jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej posłużą za bazę do kolejnych ćwiczeń!
1.4 MATERIAAY
1.4.1 Materiał biologiczny
" PBMC (peripheral blood mononuclear cells) jednojądrzaste komórki
krwi obwodowej
" PBL (peripheral blood lymphocytes) limfocyty krwi obwodowej:
limfocyty T, limfocyty B, komórki NK
" monocyty
1.4.2 Stymulanty:
CpG ODN oligodeoksynukleotyd syntetyzowany na wzorze genomu bakterii
Chlamydophila pneumoniae AR39 ( omp4/omp5 - geny, kodujące białka błony
zewnętrznej)
LPS lipopolisacharyd (endotoksyna) silny aktywator reakcji zapalnej,
rozpoznawany przez kompleks receptorów CD14/TLR2
GM-CSF czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów,
prozapalna cytokina, wykorzystywany w generacji komórek dendrytycznych
TNF - czynnik martwicy nowotworu, najsilniejsza prozapalna cytokina, silny
aktywator apoptozy
29
Aleksandra Rutkowska
1.4.3 Sprzęt laboratoryjny, odczynniki
" Mieszanina Ficoll/ " Sterylne probówki typu
Uropolina (gęstość 1,007 eppendorf
g/cm3)
" Sterylne tipsy
"
bufor PBS, pozbawiony
" Pipetki pasterowskie
jonów Mg2+ i Ca2+
" Sterylne płytki hodowlane:
" RPMI 1640 z dodatkiem 5%
24-dołkowa, 96-dołkowa
płodowej surowicy bydlęcej
(FCS) oraz antybiotyków:
" Sterylna płytka Petriego
penicyliny (10000U/ml),
streptomycyny (1mg/ml)
" Kamera Fuchsa-Rosenthala
" Płyn Tqrka
" Pipety automatyczne
" Błękit trypanu
" SPRZT
LABORATORYJNY:
" Probówki
komora laminarna,
z antykoagulantem
wirówka, mikroskop
świetlny, cieplarka
" Strzykawki
" Jałowe szklane probówki
30
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
1.4.4 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZENIA
1.4.4.1 Izolacja PBMC z krwi żylnej metodą wirowania w
gradiencie gęstości Ficoll/Uropolina
1. Pobrać 20 ml krwi żylnej do sterylnych probówek zawierających
antykoagulant (EDTA).
2. Krew rozcieńczyć buforem PBS, pozbawionym jonów Mg2+ i Ca2+ w
stosunku 1:1 i nawarstwić na ok. 2,5 ml mieszaniny
Ficoll/Uropolina w szklanej probówce.
3. Wirować 15 minut (2500 obr/min.) w celu rozdzielenia frakcji
komórek.
4. Zebrać obłoczek limfocytów do nowej, sterylnej probówki.
5. Zebrane komórki dwukrotnie przepłukać buforem PBS,
pozbawionym jonów Mg2+ i Ca2+, (wirowanie - 8 minut; 1500
obr/min.)
6. Komórki zawiesić w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640 z
dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz
antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml).
1.4.4.2 Liczenie komórek z wykorzystaniem kamery Fuchsa-
Rosenthala
1. Przygotować kamerę Fuchsa-Rosenthala. Nałożyć szczelnie szkiełko
nakrywkowe.
2. Z zawiesiny komórek w pożywce hodowlanej pobrać 10�l i dodać do
90�l płynu T�rka.
3. Po dwóch minutach inkubacji (czas potrzebny, aby doszło do lizy
erytrocytów i wybarwienia się błon żywych komórek) mieszaninę
nałożyć na kamerę. Pobrać 17�l i delikatnie wpuścić ją od góry pod
szkiełko nakrywkowe, uważając aby do nie przesunąć.
4. Komórki zliczyć pod mikroskopem świetlnym w 8 kolejnych,
kwadratowych polach (trzykrotnie powtarzając pomiar).
5. Całkowitą ilość wyizolowanych komórek oszacować na podstawie
wzoru:
31
Aleksandra Rutkowska
A = 80 000 x B x C x D
A całkowita ilość wyizolowanych PBMC
80 000 współczynnik przeliczeniowy dla kamery
Fuchsa-Rosenthala, uwzględniający jej parametry budowy
B średnia ilość komórek przypadająca na 1 pole
C rozcieńczenie komórek po przygotowaniu mieszaniny z
płynem T�rka ( C = 10 )
D całkowita objętość zawiesiny komórek w medium
hodowlanym
1.4.4.3 Ocena żywotności wyizolowanych komórek z
wykorzystaniem błękitu trypanu
1. Z zawiesiny wyizolowanych komórek pobrać 10 �l i zmieszać z błękitem
trypanu (4mg/ml) w stosunku 1:1. Nałożyć na kamerę Fuchsa-
Rosenthala.
2. Komórki ocenić pod mikroskopem świetlnym. Komórki o ciemnych,
okrągłych symetrycznych brzegach i jasnym środku uznaje się za żywe,
a ciemno zabarwione, o nierównych, postrzępionych brzegach za
martwe.
3. Żywotność komórek przedstawić procentowo jako stosunek ilości
żywych komórek do całkowitej ilości zliczonych PBMC przemnożony
przez 100.
4. UWAGA !!! Hodowlę można założyć, jeśli żywotność świeżo
wyizolowanych komórek wynosiła powyżej 80%.
32
Ćwiczenie 1. Hodowla komórkowa.
1.4.4.4 Przygotowanie zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640
w stężeniu 1 mln komórek na 1 ml pożywki
Wyizolowane komórki rozcieńczyć do stężenia 1 mln/ml odpowiednią
ilością pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy
bydlęcej (FCS) oraz antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny
(1mg/ml).
1.4.4.5 Zakładanie hodowli komórek
a. Płytka 24-dołkowa hodowle PBMC, PBL, monocytów do
oznaczania profilu cytokin, do generacji komórek
dendrytycznych, analizy cyklu komórkowego i apoptozy
1. Aby otrzymać osobne populacje PBL i monocytów należy PBMC
inkubować min. 1 h na sterylnej szalce Petriego w cieplarce w
odpowiednich warunkach
2. Świeżo wyizolowane PBMC metodą wirowania w gradiencie
gęstości mieszaniny Ficoll/Uropolina hodowano na 24-dołkowej
sterylnej płytce w ilości 1 miliona komórek na 1 ml pożywki RPMI
1640 wzbogaconej 5% FCS i antybiotykami P/S na dołek
Ryc1.5. Przykładowy schemat stymulacji płytki 24-dołkowej
33
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 2. MONOCYTY - JAKO KOMÓRKI
ODPOWIEDZI ZAPALNEJ
2.1 WSTP TEORETYCZNY
2.1.1 Reakcja zapalna. Udział monocytów w zapaleniu.
Zapalenie, reakcja zapalna jest odpowiedzią organizmu na lokalne
uszkodzenie lub infekcję i ma na celu napływ komórek układu
immunologicznego w celu zahamowania jego rozprzestrzeniania się i usunięcia
przyczyny. Główne cechy reakcji zapalnej to wzmożony dopływ krwi
(umożliwiający dopływ kluczowych elementów układu odpornościowego),
zwiększenie przepuszczalności naczyń (umożliwiający przedostawanie się tych
elementów do miejsca zapalenia), nasilona migracja leukocytów,
zaczerwienienie, obrzęk, ból, podwyższenie temperatury, utrata funkcji. Każda
reakcja zapalna składa się z kilku charakterystycznych etapów: marginacji,
toczenia się, aktywacji, ścisłego przylegania i diapedezy, które zostaną
przedstawione tu na przykładzie monocytów. Pełnią one kluczową rolę w
inicjacji i regulacji reakcji zapalnej. Pojawiają się niemal natychmiast (tuż po
neutrofilach) po zadziałaniu czynników chemotaktycznych wydzielanych przez
śródbłonek tj. składowej dopełniacza C5a, chemokiny IL-8 (wolnej i
preformowanej), czy białka chemotaktycznego dla monocytów (MCP, ang.
monocyte chemotactic factor). Początkowo ulega on wypchnięciu z głównego
strumienia krwi w kierunku ściany naczynia krwionośnego (MARGINACJA),
co ułatwia mu TOCZENIE (rolling) się po komórkach śródbłonka. Proces ten
zależy od interakcji między cząsteczkami na śródbłonku i monocycie (CD62 P-
selektyna płytkowa na śródbłonku i CD62 L- selektyna leukocytarna) i polega na
przesuwaniu się wzdłuż komórek śródbłonka, aż do momentu kiedy napotka na
sygnał AKTYWACJI (związanie przez receptor monocyta właściwej,
stymulującej chemokiny, cytokiny etc.). Zaktywowany monocyt ściśle przylega
do komórek śródbłonka poprzez interakcje odpowiednich cząsteczek
adhezyjnych np. �1-integryna VLA4 - VCAM1, wypuszcza wypustki i
przygotowuje się do wniknięcia do tkanki na drodze DIAPEDEZY.
Aktywowany monocyt produkuje enzymy, które trawią komponenty błony
podstawnej (w tym kolagen) i umożliwiają wniknięcie komórki do tkanek.
Reakcja zapalna jest bardzo ściśle regulowana przez wydzielane przez
monocyta cytokiny i chemokiny prozapalne tj. IL-1�, IL-6, IL-8, IL-12, TNFą .
W zależności od siły aktywacji komórki i ilości wyprodukowanych cytokin, IL-
1�, IL-6, TNFą mogą wykazywać działanie lokalne (wzrost przepuszczalności
naczyń, chemotaksja i aktywacja komórek układu immunologicznego) lub
systemowe (wzrost aktywności metabolicznej organizmu, gorączka, produkcja
białek ostrej fazy, a nawet wstrząs).
34
Ćwiczenie 2. Monocyty.
Ryc2.1. Schemat przenikania monocyta ze światła naczynia do tkanek
2.1.2 Rola monocytów w odpowiedzi immunologicznej
2.1.2.1 Monocyty jako główne komórki fagocytujące układu
odpornościowego
Monocyty i powstające z nich makrofagi tkankowe są jednymi z
najważniejszych komórek odpowiedzi nieswoistej (wrodzonej), które odgrywają
jednak również istotną rolę w odpowiedzi swoistej (nabytej). Stanowią one od 2
do 4% leukocytów krwi obwodowej. Ze względu na swoją morfologię i funkcje
należą do układu fagocytów jednojądrzastych. Są to stosunkowo duże komórki
(10-18�m). Ich cechą charakterystyczną jest duże jądro o kształcie fasoli i wiele
lizosomów, które wspomagają proces niszczenia sfagocytowanych
mikroorganizmów. Na swojej powierzchni wykazują ekspresję wielu
antygenów powierzchniowych, których odpowiednia kombinacja ułatwia
fenotypowanie monocytów w cytometrze przepływowym. Takimi najbardziej
charakterystycznymi cząsteczkami są CD14 (receptor dla lipopolisacharydu,
LPS, bakterii gram-ujemnych) oraz CD16 (FcłRIII,). Monocyty wykazują
również ekspresję receptorów średniego (FcłRII, CD32) i wysokiego (FcłRI,
CD64) powinowactwa dla fragmentu Fc IgG, receptory dla składowych
dopełniacza, a także CD11a, CD11b, CD11c i CD25. Posiadają
charakterystyczne receptory MFR (mannozylo-fukozylowe), które pełnią istotną
rolę w wiązaniu się z cukrami na powierzchni drobnoustrojów, receptory
fosfatydyloserynowe i receptory zmiatacze a także MHC klasy. Różnice w
ekspresji poszczególnych antygenów powierzchniowych wpływają na
35
Aleksandra Rutkowska
heterogenność populacji i zróżnicowaną zdolność do modulowania odpowiedzi
immunologicznej. Przykładowo, wykazano, że monocyty z ekspresją CD64
miały niższą zdolność prezentacji antygenu, a komórki o fenotypie
CD14+CD16+ stanowiły populację komórek prozapalnych o wybitnych
zdolnościach do sekrecji cytokin prozapalnych.
W układzie immunologicznym monocyty pełnią wiele różnych
kluczowych funkcji. Spośród nich warto wymienić takie mechanizmy obronne
jak fagocytoza, zabijanie drobnoustrojów z wykorzystaniem mechanizmów
tlenowych i beztlenowych, generacja wolnych rodników, produkcja cytokin pro-
i anty-zapalnych, prezentacja antygenów limfocytom T, modulowanie właściwej
odpowiedzi immunologicznej i wiele innych.
Jedną z głównych funkcji monocytów jest udział w fagocytozie
patogenów, martwych komórek, ciałek apoptotycznych, organelli etc. Wiele z
tych wymienionych elementów (np. komponent bakteryjny: f-Met-Leu-Phe)
działa chemotaktycznie na monocyt. Następnie są one wiązane z powierzchnią
błony komórkowej przy udziale m.in. takich cząstek jak lektyny bakteryjne,
lektyny komórki żernej, receptory dla fragmentów Fc przeciwciał
opłaszczających patogena, czy receptora dla składowych dopełniacza, które
tworzą złogi na mikroorganizmach. Jeżeli dojdzie do pobudzenia fagocytozy to
kompleks zostanie zinternalizowany. Wewnątrz komórki pęcherzyk
endosomalny (fagosom) łączy się z lizosomem i sfagocytowany element ulega
degradacji. W fagolizosomie dochodzi do obniżenia wartości pH, które wzmaga
aktywność enzymów lizosomalnych. Działa tu również lizozym. Dochodzi
również do aktywacji wielu innych mechanizmów bakteriobójczych. Pierwszy z
nich jest zależny od tlenu i polega na generacji reaktywnych form tlenu
redukcji tlenu cząsteczkowego do toksycznego anionu ponadtlenkowego, a
następnie rodników hydroksylowych, nadtlenku wodoru, tlenu singletowego. Z
drugiej strony tworzą się reaktywne formy azotu (głównie tlenek azotu), które
niszczą drobnoustroje. W tym mechanizmie bardzo istotna jest aktywacja
komórki żernej przez prozapalne cytokiny tkj. TNF i IFNł.
2.1.2.2 Modulacja odpowiedzi zapalnej
Jak już było wspominane, monocyty poprzez sekrecję odpowiednich cytokin
mogą modulować odpowiedz zapalną i jej efekty zarówno na poziomie lokalnym
i systemowym. Reakcję zapalną wzmagają silnie działając cytokiny prozapalne:
IL-1�, IL-6, TNFą, które mogą lokalnie aktywować leukocyty (wzrost produkcji
cytokin), fibroblasty (wzrost proliferacji, produkcji kolagenu) czy komórki
śródbłonka (wzrost produkcji cytokin prozapalnych będących czynnikami
chemotaktycznymi dla leukocytów, wzrost ekspresji cząsteczek adhezyjnych,
wzrost aktywności prokoagulacyjnej). Ogólnoustrojowy efekt działania tych
cytokin objawia się przede wszystkim gorączką, sennością, brakiem apetytu,
zwiększoną produkcją białek ostrej fazy. Przeciwny efekt wywołują cytokiny
antyzapalne (IL-10, TGF�), które wydzielane są pod koniec reakcji zapalnej w
celu jej wygaszenia.
36
Ćwiczenie 2. Monocyty.
2.2 Metody pomiaru stężenia cytokin
2.2.1 Testy immunoenzymatyczne (ELISA)
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) test
immunoenzymatyczny, który pozwala na wykrywanie w materiale biologicznym
białek przy wykorzystaniu swoistych przeciwciał monoklonalnych lub
poliklonalnych sprzęgniętych z enzymem.
Płytka 96-dołkowa opłaszczona jest przeciwciałami, które wychwytują
określony antygen. Niezwiązane białko jest odpłukiwane. Unieruchomione
białko jest znakowane przeciwciałami skoniugowanymi z enzymem np. to
fosfatazą alkaliczną, peroksydazą chrzanową oraz oksydazą glukozową.
Następnie dodaje się odpowiednich substratów dla enzymów (fosforan p-
nitrofenolu, tetrametylobenzydyna, kwas 5-aminosalicylowy), które zostaną
zamienione w barwne produkty. Natężenie barwy mierzy się w
spektrofotometrze przy określonej długości fali. Wartość absorbancji jest
proporcjonalna do ilości związanych przeciwciał, a więc do ilości
poszukiwanego białka w materiale. Istnieje wiele odmian standardowego testu
ELISA. Przykładowo wyróżniamy test bezpośredni i pośredni. Test bezpośredni,
wykorzystywany zwykle w laboratoriach, opiera się na wykorzystaniu tylko
pierwszorzędowych przeciwciał wyznakowanych enzymem. Test pośredni
wykorzystuje przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą się z białkiem i
przeciwciała drugorzędowe, które są wyznakowane enzymem i rozpoznają
przeciwciała pierwszorzędowe. Jeżeli przeciwciało monoklonalne
wykorzystywane do wykrywania białka zostanie połączone z radioizotopem to
powstanie test RIA, natomiast odmiana filtracyjna testu ELISA zwana jest
testem ELIFA (filtracja znacznie skraca czas reakcji).
2.2.2 Testy biologiczne z wykorzystaniem linii komórkowych
wrażliwych na cytokiny
Testy biologiczne z wykorzystaniem linii komórkowych wrażliwych na
cytokiny są mniej dokładne w pomiarze stężenia białka niż tradycyjne testy
immunoenzymatyczne (ELISA). Oznaczają one bardziej aktywność biologiczną
cytokiny. Są dużo tańsze, ale ich wynik zależy w dużej mierze od kondycji
komórek, stąd mogą być rozbieżności pomiędzy kolejnymi seriami pomiarów.
Testy biologiczne są przydatne w laboratorium do oszacowania aktywności
cytokin w supernatantach po stymulacji różnymi czynnikami. Komórki wybranej
linii inkubuje się z nadsączami znad stymulowanej hodowli. Kontrolę stanowią
komórki niestymulowane i stymulowane rekombinowaną cytokiną (szeroki
zakres stężeń) Jednymi z najpowszechniej wykorzystywanych linii jest linia B9
i WEHI164. Komórki B9 (podarowane przez Dr L. Aarden, Holenderski
Czerwony Krzyż, Amsterdam, Holandia) wymagają IL-6 do wzrostu i
37
Aleksandra Rutkowska
proliferacji in vitro. Dzięki tej unikalnej cesze, linia jest wykorzystywana w
testach biologicznych do wykrywania IL-6 w nadsączach znad hodowli
komórkowych i surowicach, gdyż nawet niskie stężenia cytokiny (ludzkiej,
mysiej, szczurzej, końskiej, ale nie bydlęcej) stymulują komórki B9 do
proliferacji. Do oceny aktywności biologicznej TNF-alfa wykorzystuje się
wybiórczą wrażliwość komórek WEHI 164 (podarowanych przez Dr T.
Espevick, Institute of Cancer Research, University of Trondheim, Trondheim,
Norway) na cytotoksyczne działanie cytokiny.
2.2.3 Oznaczanie cytokin z wykorzystaniem cytometrii
przepływowej
Cytometria przepływowa pozwala na jednoczesną detekcję wielu cytokin w
materiale biologicznym (próbkach surowicy, osocza, nadsączy znad hodowli
tkankowych). Metoda jest oparta na technologii polistyrenowych, znakowanych
kolorem mikrokuleczek, do których kowalentnie przyłączono przeciwciała
skierowane przeciwko jednej z cytokin. Mogą one reagować zarówno z próbkami
zawierającymi nieznane ilości cytokiny, jak i roztworami standardów o znanym
stężeniu. Po odpłukaniu niezwiązanego białka dodawane są biotynylowane
przeciwciała skierowane przeciwko różnym epitopom cytokin związanych przez
kuleczki. W ten sposób powstaje swoistego rodzaju kanapka przeciwciał wokół
poszukiwanego białka. Wykrywa się ją przez dodanie kompleksu streptawidyny-
fikoerytryny, reagującego z biotynylowanymi przeciwciałami.
Oparty na cytometrii przepływowej system wykrywa i szacuje ilościowo
zawartość cytokiny w badanej próbce. Nieznane stężenia są automatycznie
przeliczane na podstawie krzywych wzorcowych (sporządzonych z
wykorzystaniem rekombinowanych standardów). Z wykorzystaniem
cytometrii przepływowej można również oznaczać cytokiny
wewnątrzplazmatyczne. W tym celu przed inkubacją komórek z przeciwciałami
skierowanymi przeciw wybranym cytokinom należy dokonać permeabilizacji
błon komórkowych, aby ułatwić ich penetrację.
2.3 Metody określania aktywności fagocytarnej monocytów i
oceny zdolności monocytów do generacji wybuchu
tlenowego
Jedną z metod służącą do oceny generacji wybuchu tlenowego jest test
pozwalający na ilościową ocenę indukowanych przez leukocyty reaktywnych
form tlenu. Metoda opiera się na inkubacji heparynizowanej pełnej krwi ze
znanymi czynnikami stymulującymi wybuch tlenowy tkj. opsonizowane bakterie
38
Ćwiczenie 2. Monocyty.
E. coli, 12-mirystynian 13 octan forbolu (PMA), fMet-Leu-Phe oraz czynnik
fluoroscencyjny dehydrorodaminę 123 (DHR 123). Czynniki stymulujące
aktywują generację wolnych rodników, które mają na celu zabicie
sfagocytowanych bakterii. Powstające reaktywne formy tlenu utleniają DHR 123,
co można określić na podstawie cytometrycznej analizy. Wartość średniej
intensywności fluorescencji (MFI) koreluje z ilością wygenerowanych rodników.
Dla monocytów, u zdrowych osób, stymulowanych bakteriami E.coli wartość
MFI wynosi 50-200 (70-100% komórek generuje reaktywne formy tlenu).
Natomiast ocena zdolności fagocytarnej oceniana jest testem
określającym zdolności komórek fagocytujących do pochłaniania bakterii. Jest to
metoda ilościowa, która szacuje odsetek fagocytów zdolnych do pochłonięcia
patogenów oraz efektywność tego procesu (na podstawie ilości pochłoniętych
mikroorganizmów). Podobnie jak w BURSTTEST inkubuje się heparynizowaną
krew ze znakowanymi fluoresceiną E.coli. Po zatrzymaniu procesu fagocytozy
próbki analizuje się w cytometrze przepływowym. Wartości MFI korelują z
intensywnością fagocytozy. Dla monocytów zdrowych osób wartości MFI
wynoszą 300-900. Wpływ na wynik testu ma wiele czynników: wydajność
opsonizacji bakterii, temperatura reakcji, czas inkubacji czy stosunek ilości
bakterii do leukocytów.
2.4 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest ocena odpowiedzi komórek immunologicznych na
czynniki generujące reakcję zapalną. Aktywacja odpowiedzi zapalnej będzie
określana na podstawie poziomu cytokin prozapalnych w nadsączach
zebranych z prowadzonych hodowli oraz zdolności monocytów do generacji
wybuchu tlenowego oraz fagocytozy.
2.5 MATERIAA
" Hodowla komórek B9 " Rekombinowany ludzki
TNFą
" Hodowla komórek
WEHI164 " RPMI 1640 + 5% FCS
+ antybiotyki
" Rekombinowana ludzka
interleukina 6 (IL-6) " Aktynomycyna D
39
Aleksandra Rutkowska
" Komercyjny zestaw do " Tipsy
oceny zdolności
" Pipetki pasterowskie
fagocytarnej komórek
" Jałowa drapaczka
PHAGOTEST �
" Kamera Fuchsa-
" Komercyjny zestaw do
Rosenthala
oceny zdolności
generacji reaktywnych
" Pipety automatyczne
form tlenu
BURSTTEST �
" Probówki typu Corning
" SPRZT
" Probówki typu
LABORATORYJNY:
Eppendorf
komora laminarna,
wirówka, mikroskop
" Probówki
świetlny, cieplarka,
cytometryczne
Cytometr przepływowy,
" 96-dołkowe sterylne worteks
płytki
2.6 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC
2.6.1 Określenie aktywności biologicznej IL-6 z wykorzystaniem
komórek B9
1. Przygotować komórki B9. Ocenić kondycje komórek. Zebrać je wraz z
pożywką do 50 ml probówki typu Corning, odwirować (1100 obrotów/min.
przez 5 minut). Supernatant zlać.
2. Komórki zawiesić w 2 ml świeżej pożywki RPMI 1640. Pobrać 10 �l do
policzenia w komorze Fuchsa-Rosenthala.
3. Przygotować sterylną 96-dołkową płytkę. Przygotować rozcieńczenie
komórek B9, tak by uzyskać stężenie 10 000 komórek na 50�l pożywki
40
Ćwiczenie 2. Monocyty.
RPMI 1640. Nałożyć komórki na płytkę. UWAGA !! Do dwóch pierwszych
dołków nałożyć TYLKO 100 �l pożywki.
4. Do pierwszych rzędów dołków dodać rekombinowaną ludzką IL-6 o
specyficznej aktywności: 78 1250 pg/ml (połówkowe rozcieńczenia) w
podwójnych powtórzeniach. Komórki niestymulowane stanowić będą
kontrolę. Do pozostałych dołków dodać po 10�l rozcieńczonych
analizowanych nadsączy.
5. Płytki inkubować 48h (37�C, 5%CO2, 100% wilgotności).
6. Poziom proliferacji komórek B9, a następnie aktywność biologiczną IL-6
określić poprzez różnice w zmierzonej absorbancji w teście MTT (OD=570
nm) oraz z wykorzystaniem komputerowego programu KC4.
2.6.2 Określenie aktywności biologicznej TNF z wykorzystaniem
komórek WEHI164
1. Przygotować komórki WEHI164. Delikatnie, mechanicznie oderwać je od
podłoża, zebrać je wraz z pożywką do 50 ml probówki typu Corning,
odwirować (1100 obrotów/min. przez 5 minut). Supernatant zlać.
2. Komórki zawiesić w 2 ml świeżej pożywki RPMI 1640. Pobrać 10 �l do
policzenia w komorze Fuchsa-Rosenthala.
3. Przygotować sterylną 96-dołkową płytkę. Przygotować rozcieńczenie
komórek WEHI164, tak by uzyskać stężenie 20 000 komórek na 50�l
pożywki RPMI 1640 z aktynomycyną D (1,0 �g/ml) Nałożyć komórki na
płytkę. UWAGA !! Do dwóch pierwszych dołków nałożyć TYLKO 100 �l
pożywki.
4. Do pierwszych rzędów dołków dodać rekombinowany ludzki TNF ą o
specyficznej aktywności 20 0,002 pg/ml w podwójnych powtórzeniach.
Komórki niestymulowane stanowić będą kontrolę. Do pozostałych dołków
dodać po 10�l rozcieńczonych analizowanych nadsączy.
5. Płytki inkubować 24h (37�C, 5%CO2, 100% wilgotności).
6. Cytotoksyczność cytokiny w stosunku do komórek WEHI 164 określić przy
użyciu testu MTT. Absorbancję odczytać przy długości fali 570 nm. Do
oszacowania aktywności biologicznej TNF ą wykorzystać program
komputerowy KC4.
41
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 3. Komórki NK
3.1 WSTP TEORETYCZNY
3.1.1 Komórki NK
3.1.1.1 Morfologia, antygeny powierzchniowe komórek NK
Komórki NK (ang. natural killers), naturalni zabójcy, to komórki
przypominające morfologią duże ziarniste limfocyty (LGL, ang. large granular
lymphocytes). Stanowią one około 15% populacji limfocytów.
Fenotypowanie komórek NK niesie ze sobą niewielkie utrudnienia ze
względu na fakt, iż większość ich antygenów powierzchniowych jest obecnych
również na innych komórkach układu immunologicznego (głownie limfocytach
T i monocytach). Ich cechą charakterystyczną jest ekspresja cząsteczek CD16 i
CD56 (różna w zależności od subpopulacji), receptorów KIR i KAR oraz brak
ekspresji cząsteczek CD3 oraz receptorów TCR. Spośród markerów
wykorzystywanych do fenotypowania komórek warto wymienić również
antygeny powierzchniowe tkj. CD7, CD11b, CD57 i składową receptora dla IL-2
(łańcuch �). Komórki NK wykazują ekspresję trzech nadrodzin receptorów
receptory lektynowe cytotoksyczności naturalnej (NCR), receptory lektynowe
typu C (KLR), receptory immunoglobulino podobne (KIR).
3.1.1.2 Subpopulacje komórek NK
Komórki NK można podzielić na dwie subpopulacje ze względu na ekspresję
dwóch głównych antygenów CD56 i CD16.
" SUBPOPULACJA CD56bright są to komórki NK
immunoregulatorowe. Charakteryzują się wysoką ekspresją cząsteczek
CD56 i niską ekspresją cząsteczek CD16. Mają na swojej powierzchni
również cząsteczkę CD62L. Stanowią ok. 10% populacji komórek NK.
Występują głównie w węzłach chłonnych. Ich podstawową funkcją jest
produkcja cytokin (IL-10, TNFą, IFNł) oraz modulacja funkcji
limfocytów T i komórek dendrytycznych.
" SUBPOPULACJA CD56dim są to komórki NK cytotoksyczne.
Wykazują niską ekspresję cząsteczki CD56 i wysoką ekspresję antygenu
CD16. Posiadają receptor KIR oraz receptory dla IL-2 (CD25). Stanowią
około 90% populacji komórek NK. Wykazują niższą produkcję cytokin,
ale mają wysokie zdolności cytotoksyczne.
42
Ćwiczenie 3. Komórki NK.
3.1.1.3 Fizjologiczna rola komórek NK
Komórki NK są jednymi z głównych komórek odpowiedzi nieswoistej to
stanowią również łącznik pomiędzy odpowiedzią nieswoistą i swoistą, głównie
poprzez oddziaływanie z komórkami dendrytycznymi. Głównym zadaniem
komórek NK jest rozpoznawanie i zabijanie komórek docelowych m.in.
zmienionych nowotworowo bądz zakażonych wirusem (pojawiają się już w ciągu
dwóch dni od infekcji). Istnieją dwa mechanizmy regulacji takiej odpowiedzi.
Pierwszy wynika z obecności na powierzchni komórki NK receptorów KIR,
które hamują cytotoksyczne właściwości NK. W przypadku ich interakcji z
cząsteczką MHC kl. I (obecnych na każdej zdrowej, jądrzastej komórce
organizmu) hamują aktywność NK. Natomiast brak ekspresji MHC kl. I jest
sygnałem dla komórki NK do zniszczenia komórki docelowej (niektóre wirusy
próbują w ten sposób uniknąć odpowiedzi immunologicznej). Efekt
cytotoksyczny jest spowodowany przede wszystkim wydzieleniem zawartości
ziarnistości (perforyny, granzymy), które powodują zaburzenia w strukturze
błony komórkowej. Dodatkowo efekt ten wzmagany jest przez wydzielane
cytokiny prozapalne: IFNł i TNF ą. Wydzielenie zawartości
ziarnistości jest również charakterystyczne dla drugiego mechanizmu
regulującego odpowiedz komórek NK, który polega na rozpoznawaniu przez
cząsteczkę CD16 (FcłRIII) fragmentu Fc przeciwciał opłaszczających komórkę
docelową. Jest to tzw. reakcja ADCC, czyli cytotoksyczność zależna od
przeciwciał (ang. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity).
3.2 Metody określania aktywności cytotoksycznej komórek NK
Aktywność cytotoksyczną komórek NK można określić na podstawie
kolorymetrycznego testu wykorzystującego zdolność komórek NK do zabijania
komórek linii K562. Zabite komórki uwalniają enzym dehydrogenazę
mleczanową (LDH), której stopień uwolnienia do supernatantu jest mierzony w
wykorzystaniem komercyjnych zestawów i pomiaru absorbancji. Kontrolę
stanowią komórki K562 nie inkubowane z komórkami NK (spontaniczne
wydzielanie LDH) oraz komórki K562 inkubowane z Triton X-100 (maksymalne
wydzielanie LDH).
Cytotoksyczną aktywność komórek NK oblicza się ze wzoru
Aktywność NK = (A-B) / (C-B) x 100%
A wartość absorbancji zmierzona dla analizowanych próbek
B wartość absorbancji zmierzona dla spontanicznego wydzielania LDH
C wartość absorbancji zmierzona dla maksymalnego wydzielania LDH
43
Aleksandra Rutkowska
Aktywność komórek NK można również określać z wykorzystaniem cytometrii
przepływowej. Wówczas bramkując komórki NK (wybarwione np.
przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD56) można analizować wewnątrzkomórkowo
zawartość białek cytotoksycznych.
3.3 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest określenie aktywności komórek NK
z wykorzystaniem linii komórkowej K562
3.4 MATERIAA DO ĆWICZEC
" Limfocyty krwi
obwodowej (PBL)
" Kamera Fuchsa-
" Komórki linii K562
Rosenthala
" RPMI 1640 + 5% FCS
" Pipety pasterowskie
+ antybiotyki
" Tipsy
" RPMI 1640 +1% FCS
" Pipety automatyczne
" Triton X-100
" SPRZT
" Płyn Tqrka
LABORATORYJNY:
" Komercyjny zestaw do
wirówka, mikroskop
oznaczania poziomu
świetlny, cieplarka,
dehydrogenazy
spektrofotometr
mleczanowej
" Sterylne płytki 96-
dołkowe
44
Ćwiczenie 3. Komórki NK.
3.5 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC
3.5.1 Określenie aktywności cytotoksycznej komórek NK z
wykorzystaniem linii komórkowej K562
1. Przygotować komórki K562 w pożywce RPMI 1640 +5% FCS +
antybiotyki (100 �g/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny), aby
otrzymać stężenie 2x104 komórek na ml pożywki.
2. Przygotować PBL w pożywce RPMI 1640 +1% FCS, aby otrzymać
stężenie 2 x10 5 komórek na ml pożywki
3. Na sterylnej 96-dołkowej płytce umieścić po 100 �l PBL i 100 �l
komórek K562 na dołek (stosunek komórek 10:1). Najlepiej w
trzykrotnych powtórzeniach
4. Przygotować kontrolę : 100 �l komórek K562 z 100 �l pożywki i
100 �l komórek K562 z 1% Triton X-100
5. Płytkę inkubować 4h w cieplarce
6. Płytkę zwirować (10 min, 250 g)
7. Zebrać po 100 �l nadsączy znad osadu komórek
8. Oznaczyć poziom LDH w nadsączach z wykorzystaniem
komercyjnego zestawu
9. Zmierzyć wartości absorbancji w spektrofotometrze przy długości
fali =492nm
10. Aktywność cytotoksyczną komórek NK obliczyć ze wzoru.
45
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 4. ANALIZA LIMFOCYTÓW Z
WYKORZYSTANIEM CYTOMETRII PRZEPAYWOWEJ
5.1 WSTP TEORETYCZNY
5.1.1 Limfocyty T
Limfocyty T stanowią 80% limfocytów krwi obwodowej. Są komórkami
odpowiedzi swoistej, które determinują swoistość reakcji odpornościowej i
warunkują pamięć immunologiczną. W zależności od subpopulacji pełnią
głównie funkcje regulatorowe i efektorowe.
Prekursory limfocytów wędrują ze szpiku kostnego do grasicy. W
grasicy pod wpływem kontaktu z komórkami tworzącymi jej zrąb (komórki
nabłonkowe, makrofagi, komórki dendrytyczne), cytokin (np. IL-1ą, TNF-ą, IL-
2), chemokin (SDF-1, TECK, MDC) przekształcają się w dojrzałe formy, które
biorą aktywny udział w odpowiedzi immunologicznej. Podczas kolejnych
etapów dojrzewania około 90% limfocytów ulega eliminacji na drodze selekcji �
(przeżywają komórki, które mają prawidłowo zrearanżowane geny kodujące
łańcuch � receptora limfocyta T TCR), selekcji pozytywnej (przeżywają
komórki, które mają kompletny receptor TCR i mogą rozpoznawać peptydy
prezentowane w kontekście MHC) oraz selekcji negatywnej (giną komórki, które
zbyt silnie rozpoznają własne antygeny prezentowane w kontekście MHC
mogłyby bowiem stanowić ryzyko rozwoju chorób autoimmunologicznych).
Część komórek może dojrzewać także pozagrasiczo np. w obrębie blaszki
właściwej błony śluzowej przewodu pokarmowego. Dotyczy to przede
wszystkim limfocytów o receptorze TCRł�. Cechą charakterystyczną
limfocytów T jest obecność na powierzchni swoistego receptora TCR (T Cell
Receptor). Rozpoznaje on, wiąże i odpowiada na antygen peptydowy
prezentowany przez komórki APC (APC, ang. antygen presenting cells) w
kontekście cząsteczek MHC (ang. major histocompatibility complex).
Zbudowany jest z 3 części: części zewnątrzkomórkowej (fragmenty stałe i
fragmenty zmienne, warunkujące wiązanie różnych antygenów), części
śródbłonowej oraz części wewnątrzkomórkowej. Receptor TCR zbudowany jest
z dwóch łańcuchów: ą� (90% limfocytów T we krwi) lub ł� (1-10% limfocytów
T we krwi). W kompleksie z receptorem występuje cząsteczka CD3.
Wykorzystuje się ją do fenotypowania limfocytów T w analizach
cytometrycznych. Inne ważne cząsteczki występujące na limfocytach T to CD4
(limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T cytotoksyczne), CD2 ,CD5, CD7,
CD28, CD40L (CD154). Ich dokładna funkcja przedstawiona jest w tabeli 4.1.
46
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
Ze względu na fenotyp i funkcje efektorowe limfocyty T można
podzielić na kilka subpopulacji:
" LIMFOCYTY T POMOCNICZE (TH , helper) komórki o fenotypie
CD3+CD4+, które rozpoznają antygeny peptydowe w kontekście
cząsteczek MHC kl. II. Ich główną funkcja jest stymulacja i regulacja
odpowiedzi immunologicznej, a główną cechą zdolność do produkcji
szerokiego wachlarza cytokin.
Ze względu na profil wydzielanych cytokin oraz udział
w specyficznej odpowiedzi immunologicznej wyróżniamy:
" LIMFOCYTY TH1 limfocyty pomocnicze, które produkują
cytokiny tj. IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IFNł, stymulujące
odpowiedz komórkową w odpowiedzi przeciw patogenom
wewnątrzkomórkowym, przeciwwirusowej czy
przeciwnowotworowej.
" LIMFOCYTY TH2 limfocyty pomocnicze, które produkują
cytokiny tj. IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, aktywujące odpowiedz
humoralną w odpowiedzi przeciw patogenom
zewnątrzkomórkowym
LIMFOCYTY T CYTOTOKSYCZNE (TC, cytotoxic) komórki o
fenotypie CD3+CD8+, które rozpoznają antygeny w kontekście MHC kl. I.
Niszczą komórki docelowe (zainfekowane, nowotworowe) poprzez interakcje
Fas-FasL oraz wydzielanie zawartości ziarnistości (perforyny, granzymy) etc.
LIMFOCYTY T REGULATOROWE (Treg) komórki
CD3+CD4+CD25+, subpopulacja limfocytów pomocniczych, która odgrywa
istotną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu tolerancji immunologicznej.
Mimo, iż stanowią niewielki odsetek (5-10%) pełnią kluczową rolę w
ochronie przed rozwojem chorób autoimmunologicznych, GVHD (graft
versus host disease) poprzez produkcję cytokin wybitnie antyzapalnych:
IL-10, TGF�. Zbyt silna indukcja tolerancji może jednak zaburzać ochronę
przeciwnowotworową.
LIMFOCYTY NKT (ang. natural killing T cells) komórki o fenotypie
CD3+CD56+, a więc posiadające antygeny charakterystyczne dla limfocytów
T jak i komórek NK. Obecnie identyfikuje się je na podstawie ekspresji
łańcuchów beta receptora TCR. Biorą udział w odpowiedzi nieswoistej.
Wykazują działanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i
przeciwnowotworowe. Produkują cytokiny IL-4 i IFNł.
47
Aleksandra Rutkowska
Tabela 4.1. Główne antygeny powierzchniowe limfocytów T
ANTYGEN ROLA W UKAADZIE IMMUNOLOGICZNYM
POWIERZCHNIOWY
TCR Receptor limfocyta T. Rozpoznaje antygeny peptydowe
prezentowane przez komórki APC w kontekście
cząsteczek MHC i bierze udział w aktywacji odpowiedzi
immunologicznej.
(I SYGNAA AKTYWACJI LIMFOCYTA T)
CD2 Aączy się z LFA-3. Ułatwia interakcje limfocytów T z
innymi komórkami układu immunologicznego. Jest
receptorem dla krwinek barana (wykorzystywany do
eliminacji limfocytów T w teście rozetkowym).
CD3 Składa się z łańcuchów: ł, �, �, ś, które tworzą
kompleks z receptorem TCR. Pośredniczy w
przekazywaniu sygnałów aktywacyjnych z receptora
TCR do wnętrza komórki.
CD4 Antygen powierzchniowy, który występuje na
limfocytach pomocniczych. Determinuje łączenie się
receptora TCR z cząsteczkami MHC kl. II.
CD8 Antygen powierzchniowy, który występuje na
limfocytach cytotoksycznych. .Determinuje łączenie się
receptora TCR z cząsteczkami MHC kl. I.
CD25 Składowa receptora dla interleukiny-2 (łańcuch ą),
cytokiny, która jest tzw. III SYGNAAEM
AKTYWACJI LIMFOCYTA T.
CZSTECZKI KOSTYMULACYJNE niezbędne do
aktywacji limfocytów (II SYGNAA AKTYWACJI)
CD28
Interakcje z cząsteczkami CD80, CD86 (B.7-1, B.7-2)
na limfocycie B
CD40L (CD154)
Interakcje z cząsteczkami CD40 na powierzchni
limfocytów B
CD45RA Limfocyty T dziewicze
CD45RO Limfocyty T pamięci
Pośredniczą w transdukcji sygnałów
48
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
5.1.2 Limfocyty B
Limfocyty B, to druga subpopulacja limfocytów, która warunkuje swoistość
odpowiedzi immunologicznej poprzez produkcję przeciwciał (immunoglobulin),
dostarczanie sygnałów kostymulujących dla limfocytów T i prezentację
antygenów w kontekście MHC. Stanowią on ok. 5-15% limfocytów krwi
obwodowej. Ich cechą charakterystyczną jest obecność na powierzchni
przeciwciał klasy IgM i IgD, które stanowią receptor limfocyta (BCR)
rozpoznający wolne antygeny. Innymi charakterystycznymi antygenami
powierzchniowymi są cząsteczki CD19, CD20, CD21, CD40 czy CD72. Ich
funkcje przedstawia tabela 4.2. Limfocyty B powstają i
podlegają selekcji najpierw w wątrobie płodowej, a po narodzinach w szpiku
kostnym. Proces powstawania komórek trwa całe życie. Następnie migrują do
obwodowych narządów limfatycznych, gdzie tworzą ośrodki rozmnażania
grudek chłonnych. Są to miejsca, gdzie pod wpływem antygenów dochodzi do
indukcji proliferacji limfocytów B, zmiany klas przeciwciał, ich dojrzewania
powinowactwa etc. W wyniku stymulacji antygenem powstają tu zarówno
komórki plazmatyczne (CD20-) o morfologii komórek ukierunkowanych na
produkcję białek oraz komórki pamięci zaangażowane w odpowiedz wtórną.
Ze względu na fenotyp i funkcje limfocyty B możemy podzielić na dwie
subpopulacje.
" LIMFOCYTY B.1 nieklasyczne limfocyty B; komórki o fenotypie
Mac-1+CD23-, które dodatkowo można podzielić na komórki B.1.a
(CD5+) i B.1.b (CD5-). U dorosłych stanowią one zaledwie 20%
limfocytów B krwi obwodowej i śledziony, u noworodków jest ich 2-3
razy więcej. Ich funkcja nie jest jeszcze dokładnie poznana. Wydaje się,
że mogą brać udział w usuwaniu pozostałości po apoptozie.
Odpowiadają na antygeny grasiczoniezależne. Nie różnicują się jednak w
komórki pamięci. Produkują małe ilości IgD, natomiast wydzielają
przede wszystkim IgM o niskim powinowactwie do antygenu.
Spontanicznie produkują naturalne przeciwciała przeciw autoantygenom
i niektórym bakteriom. Wydaje się, że mogą stanowić pierwszą linię
obrony przeciwbakteryjnej. Ich ciągła stymulacja może prowadzić do
rozwoju choroby autoimmunologicznej.
" LIMFOCYTY B.2 konwencjonalne limfocyty B; komórki o fenotypie
Mac-1-CD23+. Stanowią one podstawową pulę limfocytów B. Biorą
one czynny udział w odpowiedzi immunologicznej zarówno pierwotnej
jak i wtórnej. Produkują wysokie miano przeciwciał IgD i IgM.
Limfocyty B grudek limfatycznych odpowiadają na antygeny
grasiczozależne, a limfocyty B strefy brzeżnej na antygeny
grasiczoniezależne.
49
Aleksandra Rutkowska
Tabela 4.2. Główne antygeny powierzchniowe limfocyta B
ANTYGEN ROLA W UKAADZIE
POWIERZCHNIOWY IMMUNOLOGICZNYM
CD19 Podjednostka koreceptora limfocyta
B
CD20 Kanał Ca2+
CD21 Podjednostka koreceptora limfocyta
B
CD22 Cząsteczka adhezyjna
CD40 Cząsteczka kostymulująca. Wiąże
się z CD40L (CD154)
CD72 Funkcja nieznana
CD78 Funkcja nieznana
5.1.3 Przeciwciała mono- i poliklonalne biotechnologiczne i
kliniczne zastosowanie
Limfocyty B są zdolne do produkcji 5 klas przeciwciał: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG.
Każde przeciwciało zbudowane jest z dwóch łańcuchów ciężkich, które
determinują klasę przeciwciała (ą,�,�,�,ł) oraz dwóch lekkich, determinujące typ
przeciwciała (�, ). Funkcjonalnie wyróżniamy część stałą przeciwciała Fc, która
zbudowana jest z dwóch fragmentów łańcuchów ciężkich i część wiążącą
antygen Fab, która składa się z fragmentów łańcucha ciężkiego i lekkiego oraz
zawiera części hiperzmienne. Unikalna zdolność przeciwciał do wiązania
wolnych antygenów (nie prezentowanych w kontekście MHC), ich nieoceniona
rola w odpowiedzi przeciwbakteryjnej (neutralizacja toksyn, blokowanie
cząsteczek adhezyjnych i receptorów, aktywacja reakcji ADCC, aktywacja lizy
zależnej od dopełniacza etc.), przeciwwirusowej (neutralizacja wirusa,
blokowanie receptorów dla wirusa, blokowanie replikacji wirusa etc.) czy
przeciwnowotworowej (aktywacja reakcji ADCC, lizy zależnej od dopełniacza,
blokowanie receptorów komórek nowotworowych etc.) zachęciły naukowców do
prób wykorzystania przeciwciał w diagnostyce i terapii. Obecnie wykorzystuje
się przeciwciała mono- i poliklonalne. Przeciwciała monoklonalne to
przeciwciała produkowane przez jeden klon limfocytów B o jednakowej
specyficzności. Przeciwciała poliklonalne (najczęściej w surowicy) to
mieszanina przeciwciał monoklonalnych. Te ostatnie wykorzystywane są jako
50
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
surowice odpornościowe np. do neutralizacji toksyn, w tzw. biernych
szczepieniach, diagnostyki np. szczepów bakterii Salmonella. Nie są one jednak
tak specyficzne jak przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają ten jeden
charakterystyczny antygen na wybranej przez badacza komórce i mogą ją
wyznakować lub skierować na nią właściwą odpowiedz immunologiczną.
Obecnie wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne w diagnostyce
(testy ELISA, RIA, cytometria przepływowa), terapii chorób
autoimmunologicznych (np. w łuszczycy- Infliksymab � - przeciwciała anty-
TNFą czy Alefacept� - przeciwciało, które hamuje aktywność i proliferację
limfocytów T), w generacji immunosupresji po przeszczepach. Największą
nadzieję budzi zastosowanie przeciwciał w terapii przeciwnowotworowej. Aby
wzmocnić działanie przeciwciał sprzęga je się z toksynami,
chemioterapeutykami, izotopami. Tworzy się też przeciwciała o podwójnej
swoistości. Jeden fragment jest swoisty względem komórki nowotworowej, drugi
względem toksyny lub limfocyta T cytotoksycznego, które będą mogły
precyzyjnie niszczyć docelową komórkę. Aby zmniejszyć ryzyko powikłań
można modyfikować przeciwciała dodając komponent ludzkiego białka
(przeciwciała chimeryczne). Metody otrzymywania przeciwciał monoklonalnych
przedstawione są w podrozdziale 4.3.
5.2 Cytometria przepływowa
5.2.1 Ogólny schemat budowy i zasada działania cytometru
przepływowego
Ryc4.1. Cytometr przepływowy
51
Aleksandra Rutkowska
Cytometr przepływowy jest wykorzystywany do oceny pojedynczych,
wyznakowanych komórek płynących w cieczy. Na strumień komórek skierowana
jest zogniskowana wiązka laserowa o określonej długości fali, która wzbudza
fluor ochrom sprzęgnięty z komórką przy pomocy specyficznego przeciwciała
monoklonalnego. Natężenie emitowanego światła przez wzbudzony fluorochrom
jest mierzone przez odpowiednie detektory, a następnie dane przesyłane są do
komputera i analizowane. Najczęściej używa się dwóch typów laserów
argonowego lub kryptonowego (układ optyczny cytometru przepływowego).
Laser argonowy emituje spójną wiązkę monochromatycznego światła o długości
fali =488 nm.
Istnieje osiem podstawowych fluorochromów, które sprzęga się z
przeciwciałami. Między nimi istnieją różnice w widmach wzbudzenia i
fluorescencji, dzięki czemu można przeprowadzać jednoczesną analizę
cytometryczną kilku parametrów. Przeciwciała ze sprzęgniętymi fluorochromami
wiążą się ilościowo z dana strukturą (antygenem powierzchniowym, receptorem
etc.), dlatego natężenie fluorescencji będzie proporcjonalne do ilości danej
struktury. W tabeli 4.3. podane są podane podstawowe rodzaje znaczników
fluorescencyjnych oraz długości ich fal wzbudzenia i emisji.
Tabela 4.3. Rodzaje fluorochromów wykorzystywanych w cytometrii
przepływowej
RODZAJ WIDMA
FLUOROCHROMU WZBUDZENIA/FLUORESCENCJI
[nm]
Fluoresceina (FITC) 530/30
Fikoerytryna (PE) 575/25
Cy5-PE 682/33
Cy7-PE 785/50
Allofikocyjanina (APC) 660/20
PerCP 630/22
Czerwień teksasu 630/22
Cy7-APC 785/50
52
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
Ryc4.2. Uproszczony schemat budowy cytometru przepływowego
53
Aleksandra Rutkowska
5.2.2 Zalety wykorzystania cytometrii przepływowej
Cytometria przepływowa ma zastosowanie nie tylko w badaniach
naukowych, ale jest już coraz powszechniej wykorzystywana w klinikach przede
wszystkim w diagnostyce chorób nowotworowych (białaczki !!!), zaburzeń
układu immunologicznego (niedobory immunologiczne, HIV, choroby
autoimmunizacyjne), czy monitorowaniu chorych po przeszczepie.
Z wykorzystaniem cytometru można określić odsetek danej populacji
komórek, ocenić fenotyp pojedynczej komórki (kształt, wielkość, ziarnistość,
ekspresję antygenów powierzchniowych, receptorów etc.) czy nawet jej
własności strukturalnych (organizacja cytoszkieletu, struktura chromatyny, ilość
materiału genetycznego etc.). Cytometrię wykorzystuje się również do oceny
potencjału czynnościowego komórek np. poprzez analizę potencjału błonowego,
przepuszczalności błony komórkowej, wewnątrzkomórkowego stężenia jonów
czy pH. Można też badać zdolność komórki do fagocytozy, endocytozy czy
generacji wolnych rodników.
Zastosowanie cytometrii przepływowej w badaniach naukowych i
diagnostycznych przyniosło wiele udogodnień. Umożliwiła ona jednoczesną
analizę wielu parametrów komórki. Co więcej, w krótkim czasie można dokonać
pomiaru ilościowego bardzo wielu tysięcy komórek, które dodatkowo posiadając
odpowiednią przystawkę do cytometru (sorter) można rozdzielić na poszczególne
subpopulacje.
Ryc4.3. Sorter komórek
54
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
5.2.3 Materiał do analizy metodą cytometrii przepływowej
Jedną z niedogodności cytometrii przepływowej jest wymaganie, aby
materiał do analizy był w postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
Wykorzystując enzymatyczne lub mechaniczne techniki rozdziału można
przygotować do analizy niemal każdą tkankę. W immunologii najczęściej
materiał do badań stanowi krew obwodowa pobrana do probówki z
antykoagulantem oraz szpik kostny.
Materiał należy analizować w możliwie jak najkrótszym czasie od
pobrania. Wszystkie etapy znakowania przeciwciałami wykonuje się zgodnie z
zasadami bezpieczeństwa pracy z materiałem biologicznym w komorze
laminarnej. Przed analizą cytometryczną lizuje się erytrocyty, a przepłukane
leukocyty utrwala się w buforze PBS zawierającym formaldehyd. Tak
utrwalone komórki mogą być poddane analizie albo przechowywane w
lodówce (+4�C) przez około dwóch dni.
5.2.4 Analiza cytometryczna
Wyniki pomiarów przedstawiane są za pomocą HISTOGRAMÓW.
Poszczególne analizowane parametry wizualizowane są w postaci wykresów
kropkowych (dot-plot) lub np. trójwymiarowych.
Poniższy schemat przedstawia typowy obraz cytometrycznej analizy
ludzkich leukocytów. Padająca na pojedynczą komórkę wiązka lasera ulega
zjawisku ugięcia i rozproszenia. Stopień ugięcia wiązki (mierzony w osi wiązki)
jest proporcjonalny do wielkości komórki. Jest to tzw. parametr FSC (forward
scatter). Stopień rozproszenia światła (mierzony prostopadle do osi wiązki) jest
proporcjonalny do struktury komórki (ziarnistości, ukształtowania powierzchni
etc.). Jest to tzw. parametr SSC (side scatter). Analiza tych dwóch parametrów
nie wymaga znakowania komórki fluorochromami i daje charakterystyczny obraz
w postaci dot-plot, który pozwala na podstawie położenia danej grupy komórek
ocenić rodzaj subpopulacji.
Na poniższym histogramie wartości FSC i SSC rosną zgodnie z
kierunkiem osi X i Y. Większość limfocytów ma niskie wartości FSC i SSC, stąd
populacja ta lokuje się w lewym dolnym rogu. Jak widać na dot-plocie, neutrofile
charakteryzuje największe parametry FSC i SSC. Eozynofile zlokalizowane są w
górnej części grupy neutrofilów. Natomiast bazofile lokalizują się w okolicy
populacji limfocytów.
55
Aleksandra Rutkowska
Rysc4.4. Histogram pokazujący rozkład subpopulacji PBMC w
zależności od parametrów FSC i SSC
Aby precyzyjniej rozdzielić subpopulacje leukocytów stosuje się
barwienie przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami np. anty-CD45
FITC (charakterystyczne dla limfocytów) i anty-CD14-PE
(charakterystyczne dla monocytów). Do dalszej analizy cytometrycznej
wybiera się z reguły określoną subopulacją komórek. W tym celu na
wykresie dot-plot zaznacza się tzw. bramkę (gate), która flankuje wybrane
komórki. W ten sposób uzyskuje się czystą populację do dalszej analizy
interesujących parametrów. Zwykle ustawia się ją trochę szerzej, aby objąć
możliwie wszystkie niezbędne komórki.
56
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
Ryc4.5. Histogram ukazujący komórki wybarwione przeciwciałami
anty-CD4i anty CD-8.
W badaniach cytometrycznych bardzo ważne jest użycie kontroli
izotypowej. Są to komórki wybarwione przeciwciałem tej samej klasy, ale
nie wiąże się z leukocytem, ponieważ mimo, że jest skierowane przeciw tym
samym antygenom, to występującym na komórkach innych niż ludzkie
(mysie, kozie, szczurze etc.). Pozwala to uniknąć zafałszowania wyników,
które może być spowodowane nieswoistym wiązaniem się przeciwciał lub
autofluorescencją komórek.
5.3 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych jest procesem bardzo
czasochłonnym i wymaga nakładu dużych środków finansowych. Metoda
polega na wyselekcjonowaniu i unieśmiertelnieniu limfocyta B, z którego
powstanie klon komórek produkujący przeciwciała o ściśle określonej
swoistości. Selekcja wybranych komórek B, jest o tyle istotna, iż umożliwia
57
Aleksandra Rutkowska
powstawanie przeciwciał, które będą skierowane przeciwko interesującym
antygenom. Zapewnienie nieśmiertelności jest niezbędne, aby uzyskać stałą
produkcję immunoglobulin. Można ją uzyskać na drodze transformacji
limfocyta B wirusem albo poprzez jego fuzję z komórką nowotworową
(najczęściej- komórką szpiczaka, ze względu na jego pochodzenie i zdolność
do syntezy przeciwciał). Proces produkcji przeciwciał monoklonalnych
składa się z kilku etapów. Rys 4.4. przedstawia uproszczony schemat
postępowania.
Ryc4.6. Uproszczony schemat otrzymywania przeciwciał
monoklonalnych
5.3.1 Immunizacja zwierząt
Proces immunizacji zwierząt jest wieloetapowy. Zakłada on podawanie kilku
dawek antygenu, przeciwko któremu mają powstać przeciwciała monoklonalne,
w różnych odstępach czasu przez okres nawet do kilku miesięcy. Najczęściej do
szczepień wykorzystuje się myszy, wyjątkowo szczury, jeśli mają zostać
wyprodukowane przeciwciała monoklonalne wykrywające mysie antygeny.
Wielokrotne podawanie dawek antygenu, często wzmacniane również dodatkiem
adiuwantów (np. Freunda) powoduje wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej
i zwiększenie ilości specyficznych limfocytów B wydajnie produkujących
interesujących nas przeciwciał. W przypadku myszy najczęstszą drogą podania
antygenu jest szczepienie dootrzewnowe, a tuż przed samą izolacją komórek
dożylne, co powoduje zwiększenie odsetka komórek w fazie limfoblastów.
58
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
5.3.2 Hodowla szpiczaka
Komórki szpiczaka mnogiego, które zostaną wykorzystane do fuzji z
limfocytami B i ich unieśmiertelnienia, muszą spełniać kilka kluczowych
warunków. Po pierwsze, aby nie zakłócić procesu produkcji pożądanych
przeciwciał monoklonalnych, nie powinny syntetyzować własnych
immunoglobulin. Najczęściej wybiera się komórki, które mają defekt jakiegoś
kluczowego enzymu np. HPRT (fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-
guaninowej. Dzięki temu można wyeliminować komórki szpiczaka, które nie
uległy fuzji (w hybrydomie limfocyt B dostarcza prawidłowy enzym,
umożliwiając jej przeżycie). Bardzo ważne jest, aby do fuzji były wykorzystane
komórki w bardzo dobrej kondycji, co zapewni odpowiednią wydajność procesu
i zagwarantuje powstanie stabilnych, żywotnych hybrydom zdolnych do
wydajnej produkcji przeciwciał monoklonalnych. Z tego względu hodowlę
szpiczaka warto rozpocząć na około 2-3 tygodnie przed planowanym
doświadczeniem. Taki okres czasu pozwoli na odzyskanie odpowiedniej
aktywności metabolicznej komórek po rozmrożeniu z banku komórkowego, da
czas badaczowi na sprawdzenie występowania defektu genetycznego i
ewentualnych rewertantów. Jednocześnie jest to na tyle krótki odstęp czasu, że
ryzyko jakichkolwiek zmian metabolicznych w komórkach, wynikających z
długiego czasu prowadzenia hodowli, jest niewielkie. Na dzień przed planowaną
fuzją zalecana jest zmiana pożywki na świeżą, aby komórki szpiczaka były w
fazie logarytmicznej wzrostu (optymalna do fuzji).
5.3.3 Fuzja komórkowa tworzenie hybrydom
Proces fuzji limfocytów B z komórkami szpiczaka jest najważniejszym i
zarazem najtrudniejszym etapem procesu otrzymywania przeciwciał
monoklonalnych. Wymaga on sporego doświadczenia i precyzji, by wykonać
wszystkie jego etapy w ściśle określonych ramach czasowych. Tak więc
kluczowa jest odpowiednia organizacja pracy i wcześniejsze przygotowanie
sprzętu laboratoryjnego i odczynników (np. pożywki selekcyjnej). Zakłada się
także hodowlę makrofagów (dopuszczalne jest to również w dniu fuzji), która
dostarczy składników odżywczych dla hybrydom i wyeliminuje (na drodze
fagocytozy) martwe elementy z hodowli. Fuzje komórek najczęściej wykonuje
się przy użyciu PEG (glikolu polietylenowego), który umożliwia zlanie się błon
komórkowych. W dniu fuzji pobiera się jałowo śledzionę z immunizowanej
myszki (po uprzednim uśpieniu). Izoluje się splenocyty (średnio 4x107-2x108
komórek), płucze się kilkakrotnie i zawiesza się w odpowiedniej ilości pożywki,
tak by ilość wyizolowanych komórek była równa ilości komórek szpiczaka.
Następnie obie zawiesiny komórek miesza się ze sobą w jałowej probówce (typu
Corning), wiruje się i usuwa nadsącz. Do peletu wymieszanych komórek dodaje
się kroplami, bardzo powoli, w ciągu 1 minuty glikol polietylenowy (PEG) a
następnie całość delikatnie się miesza, aby ułatwić prawidłową fuzję komórek.
59
Aleksandra Rutkowska
Następnie w kolejnych, ściśle określonych odstępach czasu, dodaje się porcjami
pożywkę (ogrzaną do temp. 37�C, bez dodatku surowicy !!) i ciągle bardzo
delikatnie miesza. Komórki wiruje się, supernatant jest usuwany a do osadu
dodaje się ok. 1 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS).
Po przeprowadzeniu fuzji komórek otrzymujemy mieszaninę, w
której znajdują się prawidłowe hybrydomy, ale także komórki, które nie uległy
fuzji, bądz uległy nieprawidłowej fuzji np. hybrydy limfocyt B - limfocyt T, czy
limfocyt B - limfocyt B. Niestety nadal trudno ocenić jest z jaką wydajnością
zaszła prawidłowa fuzja i ile otrzymano prawidłowych hybryd.
Aby wyeliminować nieprawidłowości (zwłaszcza komórki
szpiczaka, których niekontrolowany wzrost mógłby zakłócić produkcję
przeciwciał), komórki wysiewa się na sterylną płytkę 96-dołkową pokrytą
uprzednio założoną hodowlę makrofagów z dodatkiem tzw. pożywki selekcyjnej
HAT. Zawiera ona aminopterynę, która hamuje podstawowe szlaki syntezy
nukleotydów oraz hipoksantynę i tymidynę, które stanowią substraty dla enzymu
HPRT (szlak ratunkowy). Komórki szpiczaka, które mają defekt enzymu nie są
w stanie przeżyć w takich warunkach, w przeciwieństwie do prawidłowych
hybrydom, w których zródłem enzymu jest limfocyt B. Brzeżne dołki wypełnia
się sterylną wodą, aby ograniczyć parowanie pożywki z płytki.
5.3.4 Hodowla hybrydom
Hodowla hybrydom różni się nieznacznie od tradycyjnych metod hodowli
komórek. Prowadzi się ją w cieplarce, w standardowej temperaturze 37�C i
wilgotności, ale przy podwyższonym stężeniu dwutlenku węgla (7%). Przez trzy
dni nie powinno się otwierać cieplarki, aby w żaden sposób nie zakłócić
warunków inkubacji i zmniejszyć ryzyko zainfekowania hodowli. Dopiero po
tym okresie można analizować płytkę w poszukiwaniu kilkukomórkowego
klonu. Jeżeli istnieje potrzeba można zmienić część pożywki na świeżą. Taka
hodowla może trwać nawet do dwóch tygodni zanim nie osiągnie się
zadawalających rezultatów. Jeżeli w którymś z dołków płytki pojawi się
zadawalający klon komórek, należy przetestować go pod kątem produkcji
właściwych przeciwciał monoklonalnych z wykorzystaniem testu ELISA (z
zaadsorbowanym antygenem) oraz testu wykorzystującego zdolność przeciwciał
do hamowania aktywności biologicznej antygenu. Klon, który przejdzie
pozytywnie oba testy, stanowi bazę do klonowania komórek w celu uzyskania
jak najczystszej linii hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne. W
tym celu najpierw namnaża się komórki danego klonu zwiększając im
powierzchnię wzrostu a następnie komórki rozdziela się stosując metodę
seryjnych rozcieńczeń. Proces taki przeprowadza się z reguły kilkakrotnie.
Wybrane klony ponownie się namnaża i rozdziela się metodą seryjnych
rozcieńczeń. Jednocześnie zmienia się powoli pożywkę z selekcyjnej HAT, przez
pożywkę HT (pozbawiona aminopteryny), aż do standardowej pożywki RPMI
1640 wzbogaconej 10% surowicą płodową (FCS) i antybiotykami. Do dalszych
etapów oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wybiera się te przeciwciała,
60
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
które zostały wydzielone przez klony powstałe z największego rozcieńczenia
komórek.
5.3.5 Oczyszczanie, testowanie przeciwciał monoklonalnych
W niektórych badaniach naukowych można wykorzystać przeciwciała
monoklonalne, które występują w nadsączach znad hodowli hybrydom. Jednak
przy dokładniejszych analizach, w diagnostyce, ważne jest ich wyizolowanie.
Metody oczyszczania są różne w zależności od technik otrzymania przeciwciał
oraz ich wykorzystania. Wykorzystuje się metody wysalania, precypitacji, ale
przede wszystkim chromatografię jonowymienną i chromatografię
powinowactwa. Przed oczyszczaniem warto przeprowadzić izotypowanie
przeciwciał z wykorzystaniem np. testu ELISA. Oczyszczone przeciwciała
można sprzęgać z barwnikami fluorescencyjnymi, toksynami czy lekami.
5.4 TEST MTT- BADANIE AKTYWNOŚCI METABOLICZNEJ I
ŻYWOTNOŚCI KOMÓREK
Test MTT jest wykorzystywany jest w wielu badaniach in vitro do oceny
wpływu różnych czynników na przeżywalność i wzrost komórek w hodowli pod
wpływem różnych czynników (np. potencjalnych leków). Służy on również do
oceny cytotoksycznych właściwości testowanych substancji. Wykorzystuje on
zdolność żywych komórek do konwersji żółtej soli tetrazolowej MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) do fioletowych
kryształów formazanu dzięki aktywnym enzymom mitochondrialnym
(dehydrogenazom). Kryształki rozpuszcza się przez dodanie kwaśnego
izopropanolu (pH=4) a absorbancję powstałej cieczy mierzy się w
spektrofotometrze przy odpowiedniej długości fali. Wyniki pomiarów
absorbancji odnosi się do wyników uzyskanych dla kontroli (komórek
niestymulowanych) Istnieje silna dodatnia korelacja między ilością żywych,
aktywnie metabolizujących komórek a wartością absorbancji.
5.5 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest poznanie zasad działania cytometru
przepływowego na podstawie fenotypowania limfocytów T oraz
zapoznanie się z testem MTT wykorzystywanym do oceny żywotności
komórek
61
Aleksandra Rutkowska
5.6 MATERIAA DO ĆWICZEC
cytometryczne
" Sól tetrazolowa (MTT)
" Probówki typu corning
" Kwaśny izopropanol
(pH=4) " Szklane probówki
" PBS z 1% FCS " Pipety automatyczne
" PBS z 2% para " SPRZT
formaldehydem LABORATORYJNY:
wirówka,
" Wybrane przeciwciała
spektrofotometr,
monoklonalne i kontrole
cieplarka, cytometr
izotypowe
przepływowy
" Tipsy
" Probówki
5.7 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC
5.7.1 Test MTT
1. Do dołków na płytce zawierających komórki jak i do kontrolnych
zawierających tylko pożywkę dodać z przygotowanego stocku 20�l soli
MTT i inkubować w ciemności 2,5 h (37�C, 5%CO2, 100% wilgotności).
2. Dodać po 100 �l kwaśnego izopropanolu (pH=4) i intensywnie
rozpipetować w celu dokładnego rozpuszczenia kryształków.
3. Inkubować pół godziny w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem !!!)
4. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali OD = 570
nm.
5. Porównać wyniki absorbancji pomiędzy komórkami analizowanymi a
kontrolą
5.7.2 Analiza cytometryczna limfocytów T:
5.7.2.1 Określenie subpopulacji komórek krwi. Określenie wielkości i
ziarnistości komórek. Analiza antygenów powierzchniowych
limfocytów T: CD3, CD4, CD8, HLA-DR
1. Pelet komórek zawiesić w określonej objętości buforu PBS i rozdzielić do
odpowiedniej ilości probówek cytometrycznych, w zależności od
przeprowadzonej analizy.
62
Ćwiczenie 4. Limfocyty. Cytometria przepływowa.
2. Probówki wirować (5 min. 1200 obr/min), a do osadu PBMC dodać
odpowiednie kombinacje przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla
różnych cząsteczek powierzchniowych: CD3, CD4, CD8, HLA-DR z
odpowiednimi fluorochromami.
3. Kontrolę stanowią komórki nie inkubowane z przeciwciałami (unstained) i
kontrole izotypowe.
4. Próbki inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności
5. Przepłukać jednokrotnie zimnym buforem PBS z dodatkiem 1% FCS w celu
odpłukania niezwiązanych przeciwciał.
6. PBMC zawiesić w 300�l buforu PBS z dodatkiem 2% formaldehydu i
umieścić w cytometrze przepływowym.
7. Na histogramach ocenić subpopulacje komórek krwi, wielkość (parametr
FSC) i ziarnistość (SSC) komórek oraz odsetek komórek CD4+, CD8+
63
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 5. KOMÓRKI DENDRYTYCZNE- NOWA ERA
TERAPII?
6.1 WSTP TEORETYCZNY
6.1.1 Charakterystyka komórek dendrytycznych (DC), udział w
odpowiedzi immunologicznej
Komórki dendrytyczne to heterogenna grupa leukocytów wywodząca się
z prekursorów pochodzenia szpikowego, należących do układu komórek
prezentujących antygen (APC, ang. antigen presenting cells). Zostały odkryte w
1972 r. przez Ralpha Steinmana i wsp. Charakterystycznymi cechami tych
komórek są dendrytyczne wypustki i obecność ziaren Birbecka w cytoplazmie.
Jak dotąd nie zidentyfikowano pojedynczego markera, który byłby tylko obecny
na powierzchni komórek dendrytycznych. Wykazano wysoką ekspresję
cząsteczek MHC kl. I i II, cząsteczek adhezyjnych: CD11a (LFA-1), CD11c,
CD50 (ICAM-2), CD54 (ICAM-1), cząsteczek kostymulujących: CD80 (marker
dojrzałych DC), CD86 (marker wczesnego dojrzewania DC). Nie wykazują one
jednak ekspresji markerów innych komórek krwi: limfocytów T (CD3), B
(CD19), monocytów (CD14), komórek NK (CD56), granulocytów (CD66b).
Pula niedojrzałych komórek dendrytycznych zlokalizowana jest w
obwodowych tkankach, gdzie mają kontakt z patogennymi mikroorganizmami.
Mają one zdolność do efektywnego pochłaniania antygenów zarówno
pochodzenia egzogennego (fragmenty drobnoustrojów) jak i endogennego
(ciałka apoptotyczne) na drodze endocytozy, makropinocytozy, fagocytozy a
następnie ich obróbki. Niedojrzałe komórki dendrytyczne są zdolne do produkcji
ogromnej ilości kompleksów cząsteczek MHC kl. II peptyd, dzięki obecności
wyspecjalizowanych przedziałów (MIIC), ale nie wykazują ekspresji cząsteczek
kostymulujących tj. CD40, CD54, CD80, CD86, dlatego nie mają zdolności
aktywacji limfocytów T.
Dzięki obecności receptorów Toll-podobnych (TLR, ang. toll-like
receptors) rozpoznają wiele składników mikroorganizmów takich jak
lipopolisacharyd bakterii gram-ujemnych (TLR4), peptydoglikany (TLR2), kwas
lipotejchojowy bakterii gram-dodatnich (TLR2, TLR4) czy bakteryjne DNA
(TLR9) i podlegają procesowi różnicowania w kierunku dojrzałych form.
Ulegają one mobilizacji w lokalnych tkankach i wędrują do drugorzędowych
narządów limfatycznych (węzły chłonne), gdzie dzięki wysokiej ekspresji
cząsteczek MHC kl. I i II oraz cząsteczek kostymulujących mogą aktywować
naiwne limfocyty T. Prezentując antygeny w kontekście cząsteczki MHC kl. II
stymulują komórki CD4+, które różnicują się w limfocyty T pomocnicze,
wspomagające różnicowanie cytotoksycznych limfocytów T (CD8+, CTL ang.
cytotoxic T lymphocytes) i limfocytów B. Co więcej, dzięki ekspresji receptorów
TLR i rozpoznaniu klasy patogena, komórki dendrytyczne mogą modulować
64
Ćwiczenie 5. Komórki dendrytyczne.
indukcję odpowiedzi immunologicznej. W przypadku mikroorganizmów
wewnątrzkomórkowych aktywowane są limfocyty CD4+ typu 1 (Th1), dzięki
produkcji przez komórki dendrytyczne IL-12, przy infekcji patogenami
zewnątrzkomórkowymi odpowiedz typu Th2. Wiadome jest, że dojrzewanie
komórek dendrytycznych jest niezbędne do prawidłowej inicjacji odporności.
Ekspresja cząsteczek sygnałowych CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) jest niezbędna do
aktywacji limfocytów T (poprzez cząsteczkę CD28) i produkcji IL-2. Dojrzałe
komórki dendrytyczne nie proliferują, po pewnym czasie ulegają apoptozie i są
zastępowane nową pulą. Komórki dendrytyczne
pełnią również bardzo ważną rolę w odpowiedzi nieswoistej. Są zródłem wielu
cytokin modulujących odpowiedz immunologiczną tj.: IL-1, IL-6, IL-12, IL-15,
IFN-ł. Mogą aktywować komórki NK i NKT do błyskawicznego niszczenia
zainfekowanych obiektów docelowych.
6.1.2 Subpopulacje komórek dendrytycznych
6.1.2.1 linia limfoidalna (komórki plazmacytoidalne)
Komórki linii limfoidalnej charakteryzują się brakiem ekspresji
cząsteczki CD11c, CD13, CD33 i wysoką ekspresją łańcucha ą receptora dla IL-
3 (CD123) oraz CD4. Komórki te prawdopodobnie powstają z prekursora
wspólnego także dla limfocytów T i komórek NK pod wpływem IL-3 lub
oddziaływań z cząsteczką CD40L, ale nie odpowiadają na czynnik stymulujący
kolonie granulocytów i makrofagów - GM-CSF (brak receptora).
Plazmacytoidalnym komórkom dendrytycznym przypisuje się wiele
ważnych funkcji w układzie immunologicznym, w tym między innymi udział w
negatywnej selekcji w grasicy (prawdopodobnie poprzez Fas-indukowaną
apoptozę) oraz dostarczanie kostymulujących sygnałów dla CD4+ i CD8+
limfocytów T. Mogą indukować tolerancję limfocytów T na własne antygeny,
przez co zmniejszają ryzyko reakcji autoimmunologicznych. Wydaje się, że
mogą one stymulować naiwne komórki T do produkcji cytokin typu Th2 (IL-4,
IL-10). Są też najprawdopodobniej głównymi producentami IFN-ą w odpowiedzi
na stymulację patogenami, głównie podczas infekcji wirusowych.
6.1.2.2 linia mieloidalna
Komórki dendrytyczne linii mieloidalnej charakteryzują się wysoką
ekspresją cząsteczki CD11c, a także CD13 i CD33. Nie wykazują natomiast
ekspresji cząsteczki CD4. Do przeżycia in vitro wymagają GM-CSF, który
wydaje się nie być wymagany in vivo. Występują głównie w obwodowych
tkankach i na błonach śluzowych, gdzie mają bezpośredni kontakt z patogenami
lub innymi czynnikami stymulującymi. Po pochłonięciu antygenów wędrują do
węzłów limfatycznych, gdzie inicjują właściwą reakcję immunologiczną i
indukują różnicowanie się naiwnych limfocytów T w kierunku linii Th1. Są
głównym producentem IL-12, która dodatkowo ułatwia polaryzację odpowiedzi
65
Aleksandra Rutkowska
immunologicznej, w kierunku eliminacji zakażeń patogenami
wewnątrzkomórkowymi.
6.1.2.3 komórki pochodzenia monocytarnego
Komórki dendrytyczne pochodzenia monocytarnego są obecnie
najłatwiej uzyskiwanymi komórkami tej linii. Są one generowane podczas 6
dniowej hodowli monocytów w obecności GM-CSF i IL-4. Po tym czasie
monocyty różnicują się w kierunku niedojrzałych komórek dendrytycznych, tracą
marker powierzchniowy CD14 i nabywają CD1a.. W celu uzyskania dojrzałych
form wykorzystuje się m.in. lipopolisacharyd (klasyczna cząstka PAMP). Tak
uzyskane komórki mają zdolność produkcji szerokiego profilu cytokin m.in.: IL-
6, IL-8, IL-12 (p40, p70).
6.1.3 terapeutyczne wykorzystanie komórek dendrytycznych
Unikalne właściwości komórek dendrytycznych do obróbki i prezentacji
antygenów naiwnym limfocytom T w obwodowych węzłach chłonnych,
indukcja właściwej odpowiedzi immunologicznej bądz immunotolerancji
sprawiły, że są one w centrum zainteresowań terapeutycznych. Przyczyniło się
do tego również odkrycie możliwości generacji komórek dendrytycznych z
monocytów z wykorzystaniem GM-CSF i IL-4.
Badanie kliniczne pokazują, że szczepionki oparte na komórkach
dendrytycznych są bezpieczne w użyciu i praktycznie nie wywołują efektów
ubocznych. Ex vivo generowane komórki dendrytyczne mogą być podawane
zarówno dożylnie, podskórnie, śródskórnie bądz dowęzłowo. Szczepionki oparte
na komórkach dendrytycznych są testowane klinicznie w celu wykorzystania ich
w szczepieniach przeciwwirusowych (HIV, Herpes simplex, papillomawirus), w
terapii nowotworów, wydają się być także szansą w leczeniu miażdżycy.
Istnieje bardzo wiele metod otrzymywania takich szczepionek. Głównym
zródłem komórek dendrytycznych dla celów klinicznych są prekursorowe
komórki CD34+, komórki dendrytyczne krwi, monocyty. Te ostatnie, ze
względów na łatwość uzyskania, są wykorzystywane najczęściej. Jednakże sama
ich hodowla w obecności IL-4 i GM-CSF generuje niedojrzałe postacie komórek,
które nie prezentują jeszcze efektywnie antygenów. W próbach klinicznych
wykorzystuje się tak zwany złoty standard (IL-1�, IL-6, TNF-ą, PGE2) w celu
generacji dojrzałych form. Ma on jednak sporo wad gdyż tak otrzymane dojrzałe
komórki dendrytyczne produkują bardzo niewielkie lub praktycznie w ogóle IL-
12. Istnieją także pewne obawy, że takie komórki są zbyt dojrzałe i w ten
sposób będą niezdolne do właściwej aktywacji odpowiedzi limfocytów T.Trwają
poszukiwania związków, który stymulowałby efektywnie dojrzewanie komórek
dendrytycznych ex vivo i właściwą odpowiedz immunologiczną, ale bez
wywoływania efektów ubocznych. Muszą one być także w miarę tanie, by mogły
być powszechnie stosowane. Takie cechy wykazują ligandy receptorów Toll-
66
Ćwiczenie 5. Komórki dendrytyczne.
podobnych (TLR), które mają zdolność indukowania optymalnych warunków dla
dojrzewania komórek dendrytycznych i zwiększania zdolności ich migracji.
Jednym z takich receptorów jest receptor TLR9, rozpoznający DNA
mikroorganizmów i syntetyczne oligodeoksynukleotydy zawierające
niemetylowany motyw CpG.
6.2 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest cytometryczna analiza fenotypu komórek
dendrytycznych z wykorzystaniem oligodeoksynukleotydów z
nieetylowanym motywem CpG.
6.3 MATERIAA
" PBS z 1% FCS " Pipety automatyczne
" PBS z 2%
formaldehydem
" Wybrane przeciwciała
" SPRZT
monoklonalne+
LABORATORYNY:
kontrole izotopowe
laminar, wirówka,
" Probówki szklane
mikroskop świetlny,
Cytometr
" Probówki
przepływowy
cytometryczne
" Tipsy
67
Aleksandra Rutkowska
6.4 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC
6.4.1 Analiza fenotypu wygenerowanych komórek
dendrytycznych
6.4.1.1 Analiza zmian fenotypu komórek dendrytycznych pod
mikroskopem świetlnym
Komórki niestymulowane
I.
Komórki stymulowane oligonukleotydem
(powiększenie 100x)
II.
Komórki stymulowane
oligonukleotydem
(powiększenie 200x)
III.
Ryc5.1 Zmiana fenotypu jednojądrzastych komórek krwi obwodowej w 6-
dniowej hodowli stymulowanej oligonukleotydami. Górne zdjęcie
przedstawia komórki kontrolne (niestymulowane). Analiza mikroskopowa
wykazała potencjalne różnicowanie się komórek w kierunku fenotypu
podobnego do komórek dendrytycznych, co zostało pózniej potwierdzone
analizą cytometryczną.
68
Ćwiczenie 5. Komórki dendrytyczne.
6.4.1.2 Analiza zmian fenotypu komórek dendrytycznych za pomocą
cytometrii przepływowej: FSC, SSC, CD11c, CD14, CD40, CD80,
CD83, CD86
1. Po 6-dniowych stymulacjach kombinacją cytokin (GM-CSF, IL-4) i
oligonukleotydów zebrać jednojądrzaste komórki krwi (komórki
nieprzylegające wraz z pożywką, przylegające oderwać od podłoża poprzez
intensywne pipetowanie i przepłukiwanie zimnym PBS wzbogaconym 1%
FCS).
2. PBMC przepłukać dwukrotnie zimnym buforem PBS z dodatkiem 1% FCS,
wirować (5 min. 1200 obr/min)
3. Pelet komórek zawiesić w określonej objętości buforu PBS i rozdzielić
do odpowiedniej ilości probówek cytometrycznych, w zależności od
przeprowadzonej analizy.
4. Probówki wirować (5 min. 1200 obr/min), a do osadu PBMC dodać
odpowiednie kombinacje przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla
różnych cząsteczek powierzchniowych:
PRZYKAADOWA KOMBINACJA:
anty-CD11c-APC (2 �l) / anty-CD14-FITC (2 �l) / anty-CD86-PE (5 �l)
anty-CD11c-APC (2 �l) / anty-CD40-FITC (5 �l) / anty-CD123w-PC5 (5 �l)
anty-CD11c-APC (2 �l) / anty-HLA-DR-FITC (5 �l)
Kontrolę stanowią komórki nie inkubowane z przeciwciałami (unstained) i kontrole
izotypowe.
5. Próbki inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności
6. Przepłukać jednokrotnie zimnym buforem PBS z dodatkiem 1% FCS w celu
odpłukania niezwiązanych przeciwciał.
7. PBMC zawiesić w 300�l buforu PBS z dodatkiem 2% formaldehydu i umieścić
w cytometrze przepływowym.
69
Aleksandra Rutkowska
ĆWICZENIE 6. ANALIZA FAZ CYKLU KOMÓRKOWEGO I
APOPTOZY Z WYKORZYSTANIEM CYTOMETRII
PRZEPAYWOWEJ
7.1 WSTP TEORETYCZNY
7.1.1 Apoptoza
Apoptoza, czyli z greckiego opadanie liści to programowana śmierć
komórki, mająca na celu jej wyeliminowanie, gdy nie spełnia ona prawidłowych
funkcji lub staje się niepotrzebna dla organizmu. Zapewnia homeostazę organizmu i
eliminuje niebezpieczne komórki (zmienione nowotworowo, zainfekowane
wirusem). Jest to kaskada procesów fizjologicznych, które prowadzą do powstania
ciałek apoptotycznych, fagocytowanych natychmiastowo przez makrofagi. Nie
powoduje to jednak ani aktywacji enzymów proteolitycznych, ani produkcji tlenu
singletowego, dzięki czemu nie jest indukowany stan zapalny (w przeciwieństwie do
nekrozy). Podczas apoptozy dochodzi do szeregu zmian metabolicznych w komórce.
W pierwszym etapie w wielu typach komórek dochodzi do wzrostu stężenia wapnia.
Może on aktywować jądrowe endonukleazy zależne od wapnia, które w dalszych
etapach degradują DNA czy transglutaminazy, które wiążą białka cytozolowe jak
również enzymy proteolityczne (np. kalpaina), które degradują cytoszkielet. Proces
apoptozy wymaga nakładu energetycznego w postaci ATP. Można zaobserwować
szereg zmian morfologicznych. Komórki tracą wodę, kurczą się i zmieniają swój
kształt. Cytoplazma ulega kondensacji, a DNA zostaje pocięte przez endonukleazy
(fragmenty wielkości nukleosomu ok.180 pz). Otoczka jądrowa zanika i jądro ulega
fragmentacji. Zmienia się układ błony komórkowej w zewnętrznej warstwie
pojawia się fosfatydyloseryna.
Ćwiczenie 6. Apoptoza i cykl komórkowy.
Ryc6.1 Zmiany metaboliczne w komórce zachodzące pod wpływem różnych
czynników zewnętrznych prowadzących do apoptozy komórki
Istnieje wiele różnych czynników, które mogą indukować proces apoptozy:
cytokiny prozapalne (TNF, IFN), interakcje miedzy cząsteczkami np. Fas-FasL,
działanie cytotoksycznych limfocytów T, promieniowanie (UV, gamma), leki
przeciwnowotworowe, wirusy etc. Proces apoptozy jest bardzo
skomplikowany. Zaangażowanych jest bardzo wiele białek spełniających rolę
mediatorów kaskady reakcji niemal w każdym z poszczególnych etapów począwszy
od powierzchni komórki, gdzie pełnią rolę receptorów, a skończywszy na enzymach
proteolitycznych niszczących strukturę cytoszkieletu. Istnieją dwa podstawowe
szlaki aktywacji procesu apoptozy. Pierwszy, tzw. szlak zewnętrzny
spowodowany jest oddziaływaniem czynników śmierci z receptorami śmierci ,
czyli wiązaniem się ligandów z receptorami należącymi do nadrodziny receptorów
dla TNF (TNFR1, TNFR2, TRAIL-R1 R4). Takie interakcje zachodzą m.in. w
układzie immunologicznym podczas działania cytotoksycznego aktywowanych
limfocytów T (CD8+) i komórek NK. Mają one na swojej powierzchni cząsteczkę
Fas ligand (FasL, ~40 kDa), która łączy się z receptorem Fas (CD95) na
powierzchni komórki docelowej (zainfekowanej wirusem) i indukuje kaskadę
procesów prowadzących do programowanej śmierci.
71
Aleksandra Rutkowska
Kluczową rolę odgrywają tu cysteinowe białka proteolityczne kaspazy.
Tną one polipepeptydy w miejscu zlokalizowanym po reszcie kwasu
asparaginowego. Złożone są one z dwóch podjednostek dużej (17-20 kDa) i małej
(10-12 kDa). Syntetyzowane są w postaci nieaktywnych proenzymów (pro-kaspazy,
zymogeny, ~30-55 kDa), które są aktywowane dopiero w momencie dostarczenia
właściwego sygnału. Mogą wówczas podlegać autoaktywacji (autoproteolizie) bądz
ciąć inne białka. Kaspazy możemy podzielić na grupy pod względem budowy
(homologia struktury) na podrodzinę kaspazy-1 (kaspazy-1,-4,-5,-11,-12),
podrodzinę kaspazy-3 (kaspazy-3,-6,-7,-8,-9,-10) oraz podrodzinę kaspazy-2. Ze
względu na funkcje można je zaliczyć do kaspaz inicjujących (kaspazy-2,-8,-9,-10,-
12), których zadaniem jest cięcie i aktywacja białek (m.in. enzymatycznych) oraz
kaspaz efektorowych (kaspazy-3,-6,-7), które niszczą komponenty komórkowe.
Drugi szlak- wewnętrzny spowodowany jest najczęściej zaburzeniem
homeostazy komórki, które związane jest z uszkodzeniem organelli (lizosomów,
aparatu Golgiego, mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej). Inicjowany jest w
czasie reakcji stresowej komórki na czynniki zewnętrzne np. promieniowanie, leki,
niedobór hormonów etc. Prowadzi on do wzrostu przepuszczalności błony
mitochondrialnej i w konsekwencji do zaburzeń potencjału błonowego i uwolnienia
cytochromu c (cyt c), białka transportującego elektrony, które bierze udział w
fosforylacji oksydacyjnej i produkcji ATP. W normalnych warunkach
zlokalizowany jest w przestrzeni międzybłonowej mitochondriom, skąd jest
uwalniany do cytozolu po stymulacji czynnikami proapoptotycznymi. W cytozolu
łączy się z białkiem adaptorowym Apaf-1 (ang. apoptotic pro tease activating factor)
a następnie z kaspazą-9 i dATP. Aktywuje to kaspaz efektorowych i prowadzi do
apoptozy.
Ryc6.2 Dwie drogi sygnałowe w apoptozie
Ćwiczenie 6. Apoptoza i cykl komórkowy.
Spośród białek zangażowanych w kaskadę procesów apoptotycznych warto
też wspomnieć o rodzinie Bcl-2, które mogą pełnić funkcje antyapoptotyczne (m.in.
Bcl-2, Bcl-w, Boo) i pro-apoptotyczne (Bak, Bid, Bik, Bod, Bok etc.).
7.1.2 Rola apoptozy w układzie immunologiczny. Aspekty
kliniczne.
Apoptoza pełni kluczową rolę w układzie immunologicznym. Przede
wszystkim bierze udział w dojrzewaniu limfocytów T w grasicy. Komórki, które
mają zbyt duże lub zbyt małe powinowactwo do własnych cząsteczek MHC
ulegają programowanej śmierci. Jest to zjawisko tzw. selekcji pozytywnej. Dzięki
temu nie dochodzi do powstania dojrzałych limfocytów z upośledzoną
odpowiedzią na antygeny. Natomiast podczas selekcji negatywnej, również na
drodze apoptozy, giną te komórki, które rozpoznają nie tylko własne MHC, ale i
własne antygeny. Proces ten jest również często aktywowany podczas odpowiedzi
immunologicznej gospodarza, zwłaszcza podczas aktywacji limfocytów T i
komórek NK. W reakcji cytotoksycznej wydzielane są zawartości ziarnistości:
granzymy i perforyny, które indukują apoptozę poprzez aktywację kaspaz.
Dodatkowo mamy do czynienia z oddziaływaniem między receptorem Fas
(CD95) a FasL. Receptor Fas występuje na aktywowanych limfocytach T i B,
komórkach zainfekowanych wirusem, komórkach mieloidalnych. Jego ekspresja
rośnie pod wpływem cytokin prozapalnych: TNF-ą, IFN-ł. Interakcje Fas-FasL
powodują aktywację kaskady sygnałów prowadzących do śmierci komórki.
Oddziaływania te odgrywają kluczową rolę w cytotoksycznym działaniu
limfocytów T, ale także w ochronie niektórych narządów (szczególnie tych, które
są także chronione przez sekwestracje anatomiczną) np., oko czy jajniki przed
działaniem komórek immunologicznych. Zaburzenia procesu apoptozy prowadzi
do wielu poważnych schorzeń związanych przede wszystkim z występowaniem
autoreaktywnych komórek. Najczęściej wiążą się one z mutacją genów dla
pojedynczych białek, biorących udział w kaskadzie sygnałów. Przykładowo defekt
białka Bim z rodziny Bcl-2, które jest bardzo istotne w rozwoju zarodkowym,
sprzyja rozwijaniu się objawów podobnych jak w toczniu rumieniowatym oraz
powoduje uszkodzenie nerek. Objawy tocznia występują także podczas defektów
cząsteczek Fas/FasL. Defekt ten leży również u podłoża zespołu Canale-Smitha
(ALPS, ang. Autoimmune lymphoproliferative syndrom), który często prowadzi
do rozwoju nowotworów i przedwczesnej śmierci. Obniżony proces apoptozy
wśród takich komórek jak eozynofile, komórki tuczne, monocyty prowadzi do
nasilenia objawów reakcji alergicznej. Natomiast nasilony proces apoptozy
odgrywa kluczową rolę w spadku komórek CD4+ w AIDS.
73
Aleksandra Rutkowska
7.2 CYKL KOMÓRKOWY
Ryc6.3. Schemat kołowy cyklu komórkowego
CYKL KOMÓRKOWY obejmuje podział komórki (mitoza, mejoza)
oraz czas pomiędzy tymi podziałami (interfaza), w czasie którego komórka
replikuje swój materiał genetyczny i przygotowuje się do kolejnej kario- i
cytokinezy.
W interfazie wyróżniamy trzy podstawowe fazy cyklu komórkowego:
FAZA G1 najbardziej zróżnicowana faza pod względem czasu trwania w
różnych komórkach. Wzrost biosyntezy białek, przede wszystkim syntezy
różnych enzymów potrzebnych głównie do replikacji DNA w fazie S.
FAZA S czas trwania jest względnie stały u różnych komórek. Faza, w której
komórka podwaja ilość materiału genetycznego. Natomiast spada proces
biosyntezy (poza syntezą histonów).
FAZA G2 przygotowanie komórki do podziału. Wzrost syntezy tubuliny,
kluczowej w tworzeniu wrzeciona kariokinetycznego.
Ćwiczenie 6. Apoptoza i cykl komórkowy.
7.3 METODY OCENY APOPTOZY I FAZ CYKLU
7.3.1 Ocena degradacji DNA elucja niskocząsteczkowego (LMW)
DNA
Jest to metoda jakościowa pozwalająca stwierdzić wystąpienie procesu
apoptozy na podstawie degradacji materiału genetycznego. Opiera się ona na
ekstrakcji i rozdziale elektroforetycznym niskocząsteczkowego DNA, które
powstaje w wyniku cięcia genomu przez aktywowane endonukleazy. Długość
wyizolowanych fragmentów materiału genetycznego będzie wielokrotnością
wielkości nici DNA nawiniętych na oktamer histonów, która jest bardziej chroniona
przed działaniem enzymów (ok. 180 pz). Na żelu elektroforetycznym otrzymamy
charakterystyczny obraz drabinki apoptotycznej
Ryc6.4. Drabinka apoptotyczna uwidoczniona podczas rozdziału
elektroforetycznego. Jako kontrolę użyto marker (zawierający
fragmenty DNA o różnej długości) oraz niepocięte, prawidłowe DNA.
75
Aleksandra Rutkowska
7.3.2 Znakowanie wolnych końców 3 OH DNA (TUNEL)
W procesie apoptozy dochodzi do aktywacji nukleaz zależnych od jonów
Ca2+, które tną genomowe DNA pozostawiając wolne (tępe) końce 3 OH. Można je
wyznakować modyfikowanymi nukleotydami (znakowanymi dioksygeniną,
biotynylowanymi) a następnie wykrywać za pomocą specyficznych przeciwciał
sprzęgniętych z fluorochromem bądz po dodaniu streptowidynoperoksydazy i jej
substratu w mikroskopie jasnego pola.
7.3.3 Barwienie Aneksyną V- FITC
Metoda wykorzystuje zjawisko translokacji fosfatydyloseryny z
wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony komórkowej we wczesnym etapie
apoptozy. Aneksyna V (anchoryna CII) jest białkiem wiążącym fosfolipidy,
zależnym od jonów Ca2+ . Połączona z odpowiednim fluorochromem np. FITC
(zielona fluorescencja) znakuje błony komórek apoptotycznych.
7.3.4 Barwienie jodkiem propidyny (PI)
Jodek propidyny jest barwnikiem, który interkaluje DNA i wzbudzony
odpowiednią długością fali wydajnie świeci (czerwona fluorescencja). Jego
dodatkową zaletą jest brak zdolności do przechodzenia przez nieuszkodzoną błonę
komórkową żywych komórek. Po permeabilizacji błon komórkowych i barwieniu
jodkiem propidyny możemy określić w cytometrze przepływowym natężenie światła
fluorescencji i na tej podstawie zdefiniować, w której fazie cyklu komórkowego
znajdowały się dane komórki. Komórki w fazie apoptozy będą tworzyły pik sub-G1
w histogramie. Oznacza to, że zawartość DNA (wysokocząsteczkowego, ponieważ
niskocząsteczkowe zostało wcześniej podczas barwienia usunięte i wykorzystane do
rozdziału elektroforetycznego) w jądrze jest niższa niż w komórkach w fazie G1.
Ćwiczenie 6. Apoptoza i cykl komórkowy.
Ryc6.5. Histogram ukazujący odsetek komórek w różnych fazach cyklu
komórkowego i apoptozie. Najwyższy odsetek komórek jest w fazie G1 cyklu
(2n DNA), po lewej stronie od sub-piku G1 znajdują się komórki w fazie
apoptozy (ilość DNA < 2n)
Stosując kombinację jodku propidyny (PI) i aneksyny V możemy
zróżnicować fazy apoptozy na wczesną (Aneksyna V (+), PI (-)) i pózną (Aneksyna
V (+), PI (+)). Komórki żywe nie barwią się.
7.4 CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest określenie odsetka komórek w fazie apoptozy i
poszczególnych fazach cyklu komórkowego w hodowli pod długotrwałej
stymulacji oligonukleotydami metodą cytometrii przepływowej
77
Aleksandra Rutkowska
7.5 MATERIAA DO ĆWICZEC
" 80% alkohol etylowy " Bufor TBE
"
PBS pozbawiony jonów " Probówki typu Eppendorf
Ca2+ i Mg 2+
" Tipsy
" Bufor fosforanowo-
" Probówki cytometryczne
cytrynianowy
" Pipety automatyczne
" Jodek propidyny (0,5
" SPRZT
mg/ml)
LABORATORYJNY:
" RNaza A (1 mg/ml)
wytrząsarka, termoblok,
" 0,25% Nonidet NP.-24 aparat do elektroforezy,
cytometr przepływowy
" Proteinaza K (1 mg/ml)
" Agaroza
" Bromek etydyny
" Bufor obciążający DNA
7.6 PROTOKOAY DO WYKONANIA ĆWICZEC
7.6.1 Określenie poziomu apoptozy i odsetka komórek w
poszczególnych fazach cyklu komórkowego
7.6.1.1 cytometria przepływowa barwienie jodkiem propidyny
1. Komórki do oznaczenia apoptozy i faz cyklu komórkowego zawiesza się w 1 ml
mieszaniny 80% alkoholu etylowego i buforu PBS, pozbawionego jonów Ca2+ i
Mg 2+ (900 �l 80% EtOH + 100 �l PBS). Materiał przechowuje się w jałowych
probówkach Eppendorfa w temperaturze -20�C min. przez 3 4 doby.
2. Do analizy cytometrycznej usunąć alkohol etylowy poprzez pięciominutowe
wirowanie (800 x g), zlanie nadsączu i suszenie na bibule pozostałej zawartości
probówki.
3. Pelet zawiesić w 60 �l buforu fosforanowo-cytrynianowego (PC), delikatnie
rozpipetować
4. Zawiesinę komórek wytrząsać około godziny w temperaturze pokojowej.
5. Próbki wirować 5 minut (1000xg)
6. Supernatant przenoszono do nowych probówek Eppendorfa (zawiera
niskocząsteczkowe DNA wykorzystać do analizy elektroforetycznej)
Ćwiczenie 6. Apoptoza i cykl komórkowy.
2+
7. Do osadu dodać 940�l buforu PBS, pozbawionego jonów Ca2+ i Mg , 10�l
roztworu jodku propidyny (PI, 0,5 mg/ml), 50 �l roztworu RNazy A (1mg/ml).
8. Komórki barwić 1h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed dostępem
światła.
9. Przed analizą cytometryczną próbki wirować 5 minut (800xg), zlać nadsącz
i dodać 0,5 ml buforu PBS, pozbawionego jonów Ca2+ i Mg 2+.
7.6.1.2 elektroforeza agarozowa ocena drabinki apoptotycznej
1. Supernatant zagęścić w wirówce próżniowej przez 20-30 minut (objętość
powinna się zmniejszyć z 40�l do 20�l)
2. Przygotować 1% żel agarozowy z bromkiem etydyny. Włączyć termoblok na
temperaturę 37�C.
3. Do zagęszczonej próbki dodać 5 �l 0,25% Nonidet NP.-40, 5 �l RNazy A
(1mg/ml). Inkubować 15 minut w 37�C.
4. Dodać 5 �l proteinazy K (1mg/ml). Inkubować 15 minut w 37�C.
5. Dodać 4 �l buforu obciążającego i nakładać do studzienek żelu
elektroforetycznego.
6. Rozdział przeprowadzić przez 1,5 2h (50V)
79
Aleksandra Rutkowska
ANEKS
ZASADY BEZPIECZECSTWA PRACY Z MATERIAAEM
BIOLOGICZNYM:
1. W laboratorium obowiązuje całkowity zakaz spożywania pokarmów i
napojów
2. Każdy materiał biologiczny powinien być uznany za potencjalnie
zakazny
3. Wszelkie prace z materiałem biologicznym wykonuje się zgodnie z
przepisami BHP (ubiór ochronny, rękawiczki, okulary, laminar)
4. Odpady biologiczne należy sortować i przechowywać w odpowiednio
oznakowanych pojemnikach
5. Materiał biologiczny, który pozostaje po wykonaniu eksperymentu
należy zutylizować (podlega spaleniu)
6. Nie wolno przenosić niezabezpieczonego materiału biologicznego
(wyjmować spod laminaru)
7. Personel pracujący z materiałem biologicznym podlega obowiązkowym
szczepieniom

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
algebra skrypt dla studentów UW
@Nowotwory dla studentów podstawy leczenia druk
Podstawy brydża towarzyskiego dla studentów medycyny
Matuszewski W Wybrane zagadnienia ekonomii dla studentów prawa i administracji Skrypt
[Bańkowski E ] Biochemia Podręcznik dla studentów uczelni medycznych (Elsevier 2009) Witaminy (frag
wyklad z analizy matematycznej dla studentow na kierunku automatyka i robotyka agh
Toksygologia skrypt dla techników BHP
Dla studentów administracji
notatek pl materiały dla studentów (repetytorium) sem1

więcej podobnych podstron