DNA jest komórkową tarczą
dla promieniowania jonizującego
aparat
błona
Golgiego
komórkowa
6%
lizosom
jądro
1%
6%
siateczka
śródplazmatyczna
endosom
9%
1%
rybosom
cytoplasma
54%
mitochondrium
22%
Częstości popromiennych i spontanicznych uszkodzeń DNA
Dawka 1 Gy wywołuje ~100,000 jonizacji w komórce
uszkodzenia spontaniczne
uszkodzenia w komórce
rodzaj uszkodzenia
w komórce na godzinę
na 1 Gy
< 1
40
pęknięcie podwójnoniciowe
5000
1000
pęknięcie pojedynczoniciowe
1500
950
utrata zasady
1250
950
uszkodzenie zasady
popromienne uszkodzenia DNA
promienie X, gamma, beta neutrony, protony, ciężkie jony
pojedynczoniciowe
Einzelstrangbruch
Doppelstrangbruch
pęknięcie DNA
podwójnoniciowe
uszkodzenie
pęknięcie DNA
Basenschaden
zasady DNA
Einzelstrangbruch
pojedynczoniciowe
Indirekte Wirkung
O tlen potęguje efekt pośredni:
pęknięcie DNA
.
OH
(OH Radikal)
H
rodnik
H. + O2 HO2.
H O
2
2 HO2. H2O2 + O2
.
Radiolyse H
rodnik
radioliza
(hydratisierter Wasserstoff) 2 HO2. + H. H2O2
Ciąg zdarzeń w napromienionej komórce
" Uszkodzenia pośrednie i bezpośrednie
" Wychwyt wolnych rodników przez zmiatacze
" Rozpoznanie uszkodzeń DNA
" Zatrzymanie cyklu i naprawa uszkodzeń DNA
lub skierowanie komórki na drogę apoptozy
Radioochraniacze, czyli zmiatacze wolnych rodników
glutation atak przez rodnik .OH powstaje disulfid glutationu
Glu Cys Gly
GSH + .OH H2O + GS. GS. + GS. GSSG
SH
grupa tiolowa
GS.
H2O
H2O2
RH
elektrofilowe
ksenobiotyki
R.
Q-X
GSOH
HX
peroksydaza
GSH
glutationowa
transferaza
GS-Q
reduktaza
glutationowa
glutationowa
NADP+ + H+
NADPH
GSSG
ADP + P
ATP
Pierwszy krok w naprawie DNA: rozpoznanie uszkodzenia
(mocno uproszczone!)
białka genów supresorowych
białka onkogenów
aktywacja
supresja
Atm
Mdm2
p53
Rb
Puma Noxa Bax Waf1
zatrzymanie w cyklu
zatrzymanie w cyklu
Bcl2
śmierć naprawa DNA
śmierćapoptotyczna naprawa DNA
apoptotyczna
Drugi krok w naprawie DNA:
mechanizmy naprawy
ale najpierw trochę o
cyklu komórkowym...
Chromatyna ulega Chromatyna Chromatyna ulega
Chromatyna
dekondensacji rozluz
niona kondensacji
spakowana
+
G1 S G2 M
Naprawa DNA: schemat głównych szlaków
bd
ssb
ssb - single strand break
bd - base damage
rodzaje uszkodzeń DNA:
dsb - double strand break
ssb bd dsb
uszkodzenie w
uszkodzenie w
G1
S / G2
naprawa z wycięciem
przy użyciu
komplementarnej
nici DNA jako matrycy
naprawa szybka i wierna
naprawa rekombinacyjna
naprawa przez sklejenie
BER - base excision repair
przy użyciu chromatydy
wolnych końców DNA
NER - nucleotide excision repair
siostrzanej jako matrycy
NMR - nucleotide mismatch repair
po ich nadtrawieniu
naprawa stosunkowo
naprawa stosunkowo
ssb i bd powstają w komórkach
powolna ale wierna
powolna i błędna
spontanicznie z częstością
około 8000 / komórkę / godzinę
HRR - homologous
NHEJ - non homologous
recombination repair
end joining
Pomiar naprawy DNA - test kometowy
(elektroforeza pojedynczych komórek)
0 min
15 min
20
kinetyka naprawy w czasie
30 min
10
0
180 min
0 180
czas naprawy (min)
głowa
ogon
długość ogona
Naprawa DNA jest przestrzennie uporządkowana
"ogniska" z udziałem białka Rad51 (białko naprawy HRR)
B.C. Godthelp, M. Zdzienicka i wsp., Nucleic Acid Research 30, 2002
traktowane traktowane
bez
mitomycyną C promieniami X
traktowania
komórki V79B
(dzikie - wt)
ogniska
komórki CL-V4B
brak
mutanty rad51c
ognisk
komórki CL-V4B z
ogniska
skomplementowanym
genem rad51c
Poziom podwójnoniciowych
pęknięć DNA można mierzyć
badając ogniska gamma-H2AX
M. L�brich et al.
Kinetyka powstawania ognisk w jądrze komórki
napromienionej światłem laserowym
Naprawa DNA nie zawsze przebiega w sposób
bezbłędny...
schemat powstawania popromiennych aberracji chromosomowych
może prowadzić
do procesu
nowotworzenia
fragmenty
translokacja
prowadzi do śmierci
dicentryk acentryczne
komórki
Komórka z chromosomem dicentrycznym
ace
dic
Jeszcze trochę o cyklu i podziale mitotycznym...
Podział chromosomu podczas mitozy
podział chromosomu
na dwie chromatydy
M
G0
G1
G2
cytoplazma
jądro
S
wrzeciona
mitotyczne
Schemat powstawania mikrojąder popromiennych
wrzeciono mitotyczne
fragment acentryczny
mikrojądro
mikrojądra są przyczynąśmierci mitotycznej komórki
Komórki dwujądrzaste z mikrojądrami
Mn
Mn
Rzut oka na całość: los komórki napromienionej
Gy
po wysokiej dawce
śmierć
nekrotyczna
efekt
somatyczny
komórka z uszkodzonym DNA
komórka zdrowa
stabilne
niestabilne
aberracje
aberracje
brak
chromosomowe,
chromosomowe
mutacje
efektu
śmierć apoptotyczna
tor
mikrojądra mutacyjny
brak efektu
efekt
somatyczny
śmierć mitotyczna
nowotwór w komórkach
rozrodczych
efekt
efekt efekt
somatyczny
kancerogenny genetyczny
n
a
A
p
N
r
D
a
a
w
w
a
a
r
b
a
p
D
n
ł
ę
a
d
n
N
d
ę
ł
n
A
b
z
a
e
b
Dlaczego i w jaki sposób umierają
komórki z uszkodzonym DNA?
śmierć mitotyczna śmierć interfazalna
śmierć jest konsekwencją błędów komórka umiera zanim zdoła
podczas podziału komórkowego się podzielić
śmierć apoptotyczna komórka umiera ponieważ włącza
program autodestrukcji
śmierć nekrotyczna komórka umiera ponieważ traci zdolność
do zachowania równowagi
wodno-elektrolitowej
Ważny punkt końcowy w radiobiologii: ocena przeżywalności komórek
Test przeżywalności - schemat eksperymentu
komórki w hodowli
trypsyna
2 Gy
0 Gy 1 Gy 3 Gy
rozsianie
zawiesina
komórek
200 300 400
100
inkubacja: 1 - 2 tygodnie
frakcja przeżywalności (SF)
liczba kolonii
SF =
liczba komórek x PE/100
PE = wydajność klonowania
70 60
40
liczba kolonii: 50
70% -
-
wydajność klonowania: -
1 0,42
0,14
frakcja przeżywalności: 0,23
Pierwsza krzywa przeżywalności
Puck i Markus, 1956
ramię krzywej (shoulder)
eksponencjalna
część krzywej
skala log
krzywa przeżywalności
DQ = miara szerokości ramienia
DQ
1
D0 = miara promieniowrażliwości
= dawka, która powoduje obniżenie
przeżywalności do e-1
= do 37% mierzonej na prostej
krzywa 1
= 0,6 Gy
D0
krzywa 2
D0 = 1,5 Gy
0,1
duże D0
0,037
D0
D0
04,0 5,0
1,0 2,0 3,0
małe D0
Dawka (Gy)
Przeżywalność
Jak wytłumaczyć eksponencjalną
część krzywej?
Prawdopodobieństwo przeżycia komórek nie
trafionych jako funkcja średniej liczby trafień
na komórkę
Według równania Poissona:
P(0) = e-
( = średnia trafień na komórkę)
liczba trafień w komórkę
zależność dawka-efekt
liczba trafień w komórkę
liczba trafień w komórkę
Modele wyjaśniające przebieg krzywej
Model wysyconej naprawy (repair saturation model)
DQ = miarą zdolności naprawy uszkodzeń subletalnych
naprawa sprawna
naprawa
ale nie w 100%
=> część komórek ginie
naprawa
naprawa wysycona
=> przeżywalność zależy
od liczby trafień
Modele wyjaśniające przebieg krzywej
Model liniowo-kwadratowy (LQ model, Douglas and Fowler 1976)
(-ąD - �D2)
P(0) = e
uszkodzenia typu one-hit (zależność liniowa)
 prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D
uszkodzenia typu two-hit (zależność liniowo-kwadratowa)
 prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D2
Dose (Gy)