Medycyna Wet. 2008, 64 (3)

332

Praca oryginalna

Original paper

Do wykrywania wirusa pryszczycy (FMDV) w ma-

teriale biologicznym stosowane s¹ zarówno nowe tech-

niki molekularne (PCR), jak i klasyczne metody, które

dotychczas zachowa³y swoj¹ wartoœæ – izolacja wirusa

w hodowlach komórkowych oraz test ELISA. Niew¹t-

pliwym postêpem w wirusologicznej diagnostyce labo-

ratoryjnej by³o wprowadzenie na prze³omie lat 50. ho-

dowli komórek zwierzêcych in vitro. Sta³o siê to mo¿-

liwe dziêki zastosowaniu przez Endersa (12) trawienia

trypsyn¹ tkanek zwierzêcych oraz pracom Yougnera

(17) i Dulbecco (11), które przyczyni³y siê do uzyska-

nia hodowli jednowarstwowej. W 1955 r. Sellers (16)

oraz Bachrach, Hess i Callis (8) namno¿yli po raz pierw-

szy FMDV w hodowli pierwotnej komórek nerki œwini

i cielêcia. Hodowle komórek okaza³y siê doskona³ym

pod³o¿em badawczym do namna¿ania wirusów.

Wra¿liwoœæ komórek na zaka¿enie FMDV zale¿y od

obecnoœci na ich powierzchni specjalnych receptorów

(13). Do izolacji wirusa pryszczycy zalecane s¹ hodowle

pierwotne komórek tarczycy bydlêcej, nerki cielêcia,

œwini, jagniêcia. Mog¹ byæ tak¿e stosowane hodowle

komórek linii ci¹g³ych IB-RS-2 oraz BHK-21 (4).

Celem badañ by³o opracowanie metody zak³adania

hodowli pierwotnej komórek nerki jagniêcia typu mo-

nolayer (jednowarstwowej) oraz okreœlenie jej przydat-

noœci w diagnostyce pryszczycy.

Materia³ i metody

Badania przeprowadzono na nerkach 2-4-tygodniowych

jagni¹t. Do badañ u¿yto po¿ywki Eagle’a (MEM), surowicy

bydlêcej p³odowej, antybiotyków (penicylina, streptomycy-

na, amfoterycyna), PBS, 0,25% roztworu trypsyny w PBS bez

jonów Ca

2+

i Mg

2+

, roztworu b³êkitu trypanu.

Przy zak³adaniu hodowli pierwotnej wszystkie czynnoœci

wykonywano w warunkach œciœle aseptycznych. Postêpowa-

no zgodnie z obowi¹zuj¹cym w Zak³adzie Pryszczycy syste-

mem zarz¹dzania jakoœci¹ oraz zasadami Dobrej Praktyki

Laboratoryjnej w Hodowli Komórek (14).

Pobrane nerki umieszczano w naczyniu zawieraj¹cym zim-

ny PBS z dodatkiem antybiotyków i jak najszybciej dostar-

czano do laboratorium. Trypsynizacjê prowadzono dwiema

metodami.

Metoda I. Nerkê jagniêcia wyk³adano na szalkê Petriego.

Po zdjêciu torebki nerkowej wycinano kawa³ki kory i przeno-

szono do zlewki. Tkankê przep³ukiwano buforem PBS z do-

datkiem antybiotyków i ciêto no¿yczkami na ma³e kawa³ki,

unikaj¹c mia¿d¿enia. Rozdrobnion¹ tkankê po przep³ukaniu

3 × w PBS z dodatkiem antybiotyków przenoszono do kolbki

Erlenmayera. Dodawano 0,25% roztwór trypsyny w propor-

cji 1 objêtoœæ tkanki : 3 objêtoœci trypsyny. Proces trypsyno-

wania prowadzono w 37°C na mieszadle magnetycznym. Co

15 min. zlewano nads¹cz z uwolnionymi komórkami do zlewki

i wstawiano do lodówki (pierwsz¹ zawiesinê komórek odrzu-

cano). Do pozosta³ej niestrawionej tkanki nalewano now¹

porcjê trypsyny i poddawano dalszemu trawieniu. Trypsyno-

wanie powtarzano kilkakrotnie, w zale¿noœci od wymaganej

iloœci komórek. Zawiesinê uwolnionych w trawieniach ko-

mórek s¹czono przez siatkê nylonow¹ w celu oddzielenia agre-

gatów i resztek tkanki. Przes¹cz wirowano przy 400 × g przez

10 minut. Do peletki komórek powsta³ej na dnie probówki

wirowniczej dodawano PBS, zawieszaj¹c w nim komórki przez

energiczne wci¹ganie pipet¹ i ponownie wirowano. P³ukanie

powtarzano trzykrotnie. Uzyskany osad komórek zawieszano

w po¿ywce hodowlanej (MEM z dodatkiem 10% surowicy

oraz antybiotyków). W celu okreœlenia iloœci komórek uszko-

dzonych 50 µl zawiesiny komórek mieszano z 50 µl 0,4%

roztworu b³êkitu trypanu. Kroplê otrzymanej zawiesiny wpro-

wadzano do komory Bürkera. Okreœlano ca³kowit¹ liczbê ko-

mórek i osobno liczbê komórek zabarwionych. Komórki mar-

Zastosowanie hodowli pierwotnej komórek nerki

jagniêcia w diagnostyce pryszczycy

GRA¯YNA PAPROCKA

Zak³ad Pryszczycy Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego – Pañstwowego Instytutu Badawczego w Pu³awach,

ul. Wodna 7, 98-220 Zduñska Wola

Paprocka G.

Applying primary lamb kidney cell culture in diagnosing foot-and-mouth disease

Summary

Sensitive cell cultures, such as primary bovine thyroid cells and primary pig, calf or lamb kidney cells can

be used for isolating foot-and-mouth disease virus (FMDV). Established cell lines IB-RS-2 and BHK-21 may

also be applied for this purpose. The aim of this study was to assess the efficacy of primary lamb kidney cell

culture for detecting FMDV in biological materials. The results of the study demonstrate that this cell culture

may be a useful tool in diagnostic studies of FMD.

Keywords: FMDV, primary lamb kidney cell culture

Medycyna Wet. 2008, 64 (3)

333

twe wybarwiaj¹ siê na kolor niebieski. Otrzyman¹ w procesie

trypsynowania zawiesinê komórek dzielono na dwie czêœci;

jedn¹ rozcieñczano po¿ywk¹ hodowlan¹ do iloœci 3-5 × 10

5

komórek/ml i zak³adano hodowle w probówkach (tubes nunc-

lon), drug¹ czêœæ, przeznaczon¹ do zamro¿enia w ciek³ym azo-

cie zawieszano w medium krioprotekcyjnym, tak aby uzyskaæ

oko³o 3 × 10

7

komórek/ml. Hodowle inkubowano w tempera-

turze 37°C, kontrolowano pod mikroskopem, zwracano uwa-

gê na gêstoœæ hodowli, pH po¿ywki. W razie potrzeby po¿yw-

kê hodowlan¹ zmieniano.

Metoda II. Do zak³adania hodowli u¿ywano drugiej nerki

jagniêcia. Pierwsze trawienie rozdrobnionej tkanki wykony-

wano przy u¿yciu 0,25% roztworu trypsyny w 37°C, przez

20 min., uzyskan¹ zawiesinê odrzucano. Nastêpnie dodawa-

no nowy roztwór trypsyny i trawienie odbywa³o siê przez noc,

w 4°C, na wolnych obrotach mieszad³a magnetycznego. Dal-

sze czynnoœci prowadzono zgodnie z metod¹ I.

Przy przechowywaniu komórek nerki jagniêcia w ciek³ym

azocie wzorowano siê na instrukcji nr I-09/ZPr/KJZ (1).

Przy zak³adaniu hodowli komórek nerki jagniêcia z udzia-

³em komórek przechowywanych w ciek³ym azocie postêpo-

wano wg instrukcji nr I-10/ZPr/KJZ (2). Komórki liczono,

rozcieñczano w po¿ywce i wysiewano do naczyñ hodowla-

nych w sposób opisany powy¿ej.

Do wykrywania wirusa pryszczycy (test izolacji) u¿yto

materia³u biologicznego otrzymanego z World Reference La-

boratory w Pirbright w ramach miêdzylaboratoryjnych porów-

nañ metod diagnostycznych. Badania wykonywano w opar-

ciu o procedurê badawcz¹ nr ZPr/PB-01 (5). Wyniki porów-

nywano z uzyskanymi w hodowli komórek linii ci¹g³ej

IB-RS-2, przygotowanej wg instrukcji nr I-02/ZPr/PB-01,03,04

(3).

Po¿ywkê z hodowli, w której wyst¹pi³ efekt cytopatyczny

badano na obecnoϾ wirusa pryszczycy testem ELISA zgod-

nie z procedur¹ badawcz¹ nr ZPr/PB-02 (6). Wymienione pro-

cedury i instrukcje zosta³y opracowane w oparciu o zalecenia

OIE (4).

Wyniki i omówienie

Trypsynowanie tkanki nerki jagniêcia wykonywano

dwiema metodami, w 37°C (metoda I) oraz przez noc

w 4°C (metoda II uproszczona). Przed za³o¿eniem ho-

dowli oraz zamro¿eniem komórek w ciek³ym azocie

okreœlano ich ¿ywotnoœæ. Odsetek komórek uszkodzo-

nych by³ niski, w zawiesinie otrzymanej metod¹ I wy-

nosi³ 2,5-2,9%, metod¹ II 3,2-3,5% (tab. 1, 2). Dla uzys-

kania dobrego wzrostu hodowli wymagana by³a gêstoœæ

zawiesiny 3-5 × 10

5

komórek/ml pod³o¿a. Zawiesiny

o wy¿szej gêstoœci powodowa³y szybkie odklejanie siê

hodowli i jej degeneracjê. U¿ycie zawiesin o ni¿szej

koncentracji komórek nie zapewnia³o uzyskania hodow-

li konfluentnej.

Nastêpnie oceniano ¿ywotnoœæ i zdol-

noœæ do wzrostu komórek przechowywa-

nych w okresie 1-8 miesiêcy w ciek³ym

azocie (tab. 1, 2). Po o¿ywieniu komó-

rek nerki jagniêcia po 8 miesi¹cach, od-

setek komórek uszkodzonych waha³ siê

od 4,0% do 6,9% (metoda I) oraz od

5,1% do 7,2% (metoda II). Wzrost ko-

mórek uzyskanych poprzez trypsynowa-

nie tkanki nerki jagniêcia w 37°C oraz

w 4°C by³ porównywalny. Komórki za-

równo bezpoœrednio po trypsynizacji, jak

i przetrzymywane w g³êbokim zamro¿e-

niu szybko podejmowa³y wzrost ocenio-

ny jako bardzo dobry. Po przyczepieniu

siê do dna probówki tworzy³y ró¿nej

wielkoœci kolonie, które proliferuj¹c, po-

wiêksza³y siê i tworzy³y jedn¹ warstwê

(monolayer) po 48-72 godzinach. Ko-

mórki nie wymaga³y z³o¿onych po¿ywek

hodowlanych, stosowano medium

Eagle’a MEM z dodatkiem 10% surowi-

cy bydlêcej p³odowej. House i House

(15) przedstawili po raz pierwszy pozy-

tywne rezultaty przechowywania komó-

rek pierwotnych w zamro¿eniu.

W dalszych badaniach okreœlano wra¿-

liwoœæ na zaka¿enie wirusem pryszczy-

cy hodowli przygotowanej z udzia³em

komórek nerki jagniêcia przechowywa-

nych w ciek³ym azocie 8 miesiêcy,

w porównaniu z aktualnie u¿ywan¹ do

testu izolacji hodowl¹ komórek linii ci¹g-

³ej IB-RS-2. Jak wynika z tab. 3, wyst¹-

k

e

r

ó

m

o

k

%

h

c

y

n

o

z

d

o

k

z

s

u

a

n

e

c

O

u

t

s

o

r

z

w

k

e

r

ó

m

o

k

s

e

r

k

O

a

i

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

m

y

³

k

e

i

c

w

k

e

r

ó

m

o

k

).

s

e

i

m

(

e

i

c

o

z

a

k

e

r

ó

m

o

k

%

h

c

y

n

o

z

d

o

k

z

s

u

h

c

y

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

e

i

c

o

z

a

m

y

³

k

e

i

c

w

u

t

s

o

r

z

w

a

n

e

c

O

k

e

r

ó

m

o

k

h

c

y

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

e

i

c

o

z

a

m

y

³

k

e

i

c

w

5

,

3

-

2

,

3

+

+

+

1

5

,

3

-

2

,

3

+

+

+

2

5

,

3

-

2

,

3

+

+

+

3

0

,

4

-

3

,

3

+

+

+

4

0

,

4

-

5

,

3

+

+

+

5

0

,

5

-

0

,

4

+

+

+

6

0

,

6

-

0

,

4

+

+

+

7

0

,

6

-

5

,

4

+

+

+

8

2

,

7

-

1

,

5

+

+

+

Tab. 2. Charakterystyka komórek nerki jagniêcia (metoda II)

Objaœnienia: jak w tab. 1.

k

e

r

ó

m

o

k

%

h

c

y

n

o

z

d

o

k

z

s

u

a

n

e

c

O

u

t

s

o

r

z

w

k

e

r

ó

m

o

k

s

e

r

k

O

a

i

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

m

y

³

k

e

i

c

w

k

e

r

ó

m

o

k

).

s

e

i

m

(

e

i

c

o

z

a

k

e

r

ó

m

o

k

%

h

c

y

n

o

z

d

o

k

z

s

u

h

c

y

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

e

i

c

o

z

a

m

y

³

k

e

i

c

w

u

t

s

o

r

z

w

a

n

e

c

O

k

e

r

ó

m

o

k

h

c

y

n

a

w

y

w

o

h

c

e

z

r

p

e

i

c

o

z

a

m

y

³

k

e

i

c

w

9

,

2

-

5

,

2

+

+

+

1

9

,

2

-

6

,

2

+

+

+

2

9

,

2

-

6

,

2

+

+

+

3

0

,

3

-

7

,

2

+

+

+

4

0

,

4

-

7

,

2

+

+

+

5

5

,

4

-

8

,

2

+

+

+

6

5

,

4

-

8

,

2

+

+

+

7

0

,

6

-

6

,

3

+

+

+

8

9

,

6

-

0

,

4

+

+

+

Tab. 1. Charakterystyka komórek nerki jagniêcia (metoda I)

Objaœnienia: +++ – wzrost bardzo dobry, monolayer po 48-72 godz.

Medycyna Wet. 2008, 64 (3)

334

pienie CPE (wynik dodatni) stwierdzono w obu hodow-

lach inokulowanych próbkami P328 i P337. Jednak

zmiany cytopatyczne w hodowli komórek nerki jagniê-

cia pojawi³y siê wczeœniej, po 18 i 24 godz. kolejno

w próbce P328 i P337, natomiast w hodowli komórek

linii ci¹g³ej IB-RS-2 dopiero po 40 godz. w próbce P328

i po 42 godz. w P337 (ryc. 1, 2). ObecnoϾ wirusa prysz-

czycy w wymienionych próbkach potwierdzono testem

ELISA.

£atwe w u¿yciu hodowle komórek linii ci¹g³ych IB-

RS-2 oraz BHK-21 s¹ powszechnie stosowane do ruty-

nowych badañ rozpoznawczych. Ocena ich wra¿liwoœ-

ci jest sta³ym tematem dyskusji na sympozjach, na któ-

rych omawiane s¹ problemy zwi¹zane ze standaryzacj¹

metod diagnostycznych. Wa¿ne s¹ doniesienia wielu

autorów, którzy wykazali zró¿nicowan¹ wra¿liwoœæ na

zaka¿enie FMDV klonów komórek linii BHK-21 u¿y-

wanych w ró¿nych laboratoriach (7, 9, 10). Wyniki

wczeœniejszych badañ w³asnych oraz przedstawionych

w publikacjach wskazuj¹ na potrzebê dokonywania

okresowej oceny posiadanych linii komórkowych pod

wzglêdem ich przydatnoœci do diagnozowania prysz-

czycy. Z innych badañ wynika, ¿e hodowle komórek

linii ci¹g³ych s¹ mniej wra¿liwe na zaka¿enie ni¿ ko-

mórki pierwotne, zw³aszcza przy niskim

mianie infekcyjnym FMDV (4, 9). Powy¿-

sze dane motywuj¹ do wprowadzenia do

izolacji wirusa hodowli komórek nerki jag-

niêcia.

Podsumowuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e za-

stosowanie uproszczonej metody trypsyno-

wania oraz korzystanie z o¿ywionych ko-

mórek o sprawdzonym potencjale wzrosto-

wym i wra¿liwoœci na zaka¿enie FMDV,

eliminuje wiele niedogodnoœci i trudnoœci

organizacyjnych zwi¹zanych z zak³ada-

niem hodowli pierwotnej komórek nerki

jagniêcia. Otrzymane wyniki jednoznacz-

nie wskazuj¹ na u¿ytecznoœæ tej hodowli

do wykrywania wirusa pryszczycy.

Piœmiennictwo

1.Anon.: Instrukcja nr I-09/ZPr/KJZ Przygotowanie komórek BHK-21 oraz

IB-RS-2 do zamro¿enia w ciek³ym azocie. PIWet-PIB Zak³ad Pryszczycy, Zduñ-

ska Wola 2006.

2.Anon.: Instrukcja nr I-10/ZPr/KJZ Rozmra¿anie komórek BHK-21, IB-RS-2

przechowywanych w ciek³ym azocie oraz ich o¿ywianie. PIWet-PIB Zak³ad

Pryszczycy, Zduñska Wola 2006.

3.Anon.: Instrukcja nr I-02/ZPr/PB-01,03,04 Prowadzenie hodowli komórek linii

ci¹g³ych. PIWet-PIB Zak³ad Pryszczycy, Zduñska Wola 2006.

4.Anon.: OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals

(mammals, birds and bees), Fifth Edition 2004, 111-128.

5.Anon.: Procedura badawcza nr ZPr/PB-01 Wykrywanie wirusa pryszczycy i wi-

rusa choroby pêcherzykowej œwiñ w materiale biologicznym – test izolacji

wirusa. PIWet-PIB Zak³ad Pryszczycy, Zduñska Wola 2006.

6.Anon.: Procedura badawcza nr ZPr/PB-02 Wykrywanie antygenu wirusa prysz-

czycy i wirusa choroby pêcherzykowej œwiñ – test ELISA (indirect sandwich

ELISA). PIWet-PIB Zak³ad Pryszczycy, Zduñska Wola 2006.

7.Ahl R., Keller B.: Zur Diagnose der Maul-und-Klauenseuche und zur Stamm-

identifizierung von Maul-und-Klauenseuche- Virusisolaten. Arch. Exp. Vet. Med.

1987, 41, 784-790.

8.Bachrach H. L., Hess W. R., Callis J. J.: Foot-and-mouth disease virus: Its growth

and cytopathogenicity in tissue culture. Science. 1955, 122, 1269-1275.

9.Clarke J. B., Spier R. E.: Variation in the susceptibility of BHK populations and

cloned cell lines to three strains of foot-and-mouth disease virus. Arch. Virol.

1980, 63, 1-9.

10.Czelleng F., Zsitvay K., Egyhazi Zs., Baranyi M., Fazekas A.: Comparative

analysis of BHK-21 cell lines of virus strains of foot-and-mouth disease. Arch.

Exper. Vet. Med. 1987, 41, 791-796.

11.Dulbecco R.: Production of plaques in monolayer tissue cultures by single

particles of an animal virus. Proc. Natl Acad. Sci. 1952, 38, 747-752.

12.Enders J. F., Wellers T. H., Robbins F. C.: Cultivation of the lansing strain of

poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science 1949,

109, 85-90.

13.Fry E. E., Lea S. M., Jackson T.: The structure and function of a foot-and-mouth

disease virus-oligosaccharide receptor complex. EMBO J. 1999, 18, 543-554.

14.Hartung T.: Good Cell Culture Practi-

ce. Altern. Lab. Anim. (ATLA) 2002,

30, 407-414.

15.House C., House J. A.: Evaluation of

techniques to demonstrate FMDV in

bovine tongue epithelium: comparison

of the sensitivity of cattle, mice, pri-

mary cell cultures, cryopreserved cell

cultures and established cell lines. Vet.

Microbiol. 1989, 20, 99-109.

16.Sellers R. F.: Growth and titration of

the viruses of foot-and-mouth disease

and vesicular stomatitis in kidney

monolayer tissue cultures. Nature 1955,

176, 547-550.

17.Yougner J. S.: Monolayer tissue cultu-

res. Preparation and standardization of

suspensions of trypsin-dispersed mon-

key kidney cells. Proc. Soc. Exp. Biol.

Med. 1954, 85, 202-210.

Adres autora: doc. dr hab. Gra¿yna

Paprocka, ul. Wodna 7, 98-220 Zduñska

Wola; e-mail: [e-mail].

net.pl

e

i

n

e

z

c

a

n

z

O

i

k

b

ó

r

p

a

n

t

o

w

r

e

i

p

a

l

w

o

d

o

H

a

i

c

ê

i

n

g

a

j

i

k

r

e

n

k

e

r

ó

m

o

k

k

e

r

ó

m

o

k

a

l

w

o

d

o

H

2

-

S

R

-

B

I

j

e

³

g

¹

i

c

ii

n

il

u

t

s

e

t

k

i

n

y

W

A

S

I

L

E

I

¿

a

s

a

P

II

¿

a

s

a

P

I

¿

a

s

a

P

II

¿

a

s

a

P

E

P

C

E

P

C

E

P

C

E

P

C

1

2

3

P

–

–

–

–

b

n

8

2

3

P

.

z

d

o

g

8

1

o

p

E

P

C

b

n

.

z

d

o

g

0

4

o

p

E

P

C

b

n

O

p

y

t

o

r

e

s

5

3

3

P

–

–

–

–

b

n

6

3

3

P

–

–

–

–

b

n

7

3

3

P

.

z

d

o

g

4

2

o

p

E

P

C

b

n

.

z

d

o

g

2

4

o

p

E

P

C

b

n

A

p

y

t

o

r

e

s

8

3

3

P

–

–

–

–

b

n

0

4

3

P

–

–

–

–

b

n

Tab. 3. Ocena wra¿liwoœci hodowli pierwotnej komórek nerki jagniêcia na

zaka¿enie FMDV

Objaœnienia: – brak CPE; nb – nie badano

Ryc. 2. Hodowla komórek nerki jagniêcia

zaka¿ona wirusem pryszczycy (próbka P337)

Ryc. 1. Hodowla komórek nerki jagniêcia

(kontrola)