Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str. 651–659

PRACA POGLĄDOWA – Review Article

ANNA GESE, KATARZYNA ROSZEK

Metody wydajnej izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzy-
stych z krwi pępowinowej

Methods of efficient isolation and culture of umbilical cord blood mesenchymal
stem cells

Zakład Biochemii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Zakładu: Dr hab. Michał Komoszyński, prof. UMK

STRESZCZENIE

Krew pępowinowa jest jednym z najważniejszych i najłatwiej dostępnych źródeł mezenchymalnych komórek macie-
rzystych (MSC, ang. mesenchymal stem cells). Może być wykorzystywana w terapii wielu chorób, jednak jej zasto-
sowanie jest ograniczone głównie do dzieci. Wynika to z mniejszej ilości komórek macierzystych w porównaniu na
przykład ze szpikiem kostnym. Z tego względu niezwykle istotne jest poznanie biologii komórek MSC, identyfikacja
czynników pozwalających na ich efektywną izolację z krwi pępowinowej oraz hodowlę i namnażanie tych komórek
w warunkach in vitro.

SŁOWA KLUCZOWE: Mezenchymalne komórki macierzyste – Krew pępowinowa

SUMMARY

Umbilical cord blood is one of the most important and most readily available source of mesenchymal stem cells
(MSC). It can be used in the treatment of many diseases, although its application is restricted mainly to children. This
is caused by the lower availability of stem cells in this particular type of body fluid (that is umbilical cord blood) in
comparison with other sources of MSC, such as bone marrow. Therefore, it is crucial to understand the biology of
MSC in order to identify the factors enabling their effective isolation from cord blood as well as the culture and proli-
feration of these cells in vitro.

KEY WORDS: Mesenchymal stem cells – Umbilical cord blood

WSTĘP

Dużym zainteresowaniem badaczy w ostatnich latach cieszą się multipotencjalne mezenchymalne

komórki macierzyste (MSC, ang. mesenchymal stem cells). W terminologii naukowej nazywa się je
także komórkami mezenchymalnymi stromy (MSC, ang. mesenchymal stromal cells) [1]. Określa się je
jako niehematopoetyczne [2, 5], niezróżnicowane [6, 7], mononuklearne [8, 9] komórki zdolne do ad-
hezji do plastiku [2-5, 8, 10-15]. W warunkach in vitro dzielą się z dużą szybkością [4, 9], tworząc ko-
lonie wydłużonych komórek wrzecionowatych o morfologii zbliżonej do fibroblastów [2, 9, 12-16]
o długości 0,1-0,7 mm [17].

MSC występują w tkankach większości narządów dorosłych osobników, w których są różnorodnie

rozmieszczone [15]. Do roku 2007 udało się je zlokalizować we wszystkich analizowanych tkankach,
zarówno pochodzących od myszy jak i od człowieka [9, 18]. Najwcześniej odkrytym, a zarazem głów-
nym ich źródłem jest jednak szpik kostny [3-5, 12, 15, 18-20]. Pierwsza udana izolacja MSC z tego
ź

ródła miała miejsce w 1976 roku i przeprowadził ją Friedenstein i wsp. [4].

MSC cechuje ogólna multipotencja [4, 10, 15]. Niezależnie od rodzaju subpopulacji, komórki te

wykazują zdolność do różnicowania w komórki pochodzenia mezodermalnego, takie jak: osteocyty,

A. GESE, K. ROSZEK

652

chondrocyty oraz adipocyty [2-6, 8-10, 13-17, 19, 21]. Zmiana fenotypu na bardziej wyspecjalizowany
zachodzi w specyficznych warunkach in vitro i in vivo [3, 14, 15]. Ponadto różne grupy badawcze po-
twierdziły zdolność MSC do różnicowania w kierunku innych tkanek pochodzenia mezodermalnego
(np. komórki mięśniowe, kardiomiocyty, ścięgna, więzadła, komórki stromy), ektodermalnego (np.
neurony, oligodendrocyty, astrocyty, komórki glejowe) oraz endodermalnego (np. hepatocyty) [9, 13,
16, 22].

Określenie warunków efektywnej izolacji, hodowli i kontrolowanego różnicowania niezróżnicowa-

nych komórek jest kwestią kluczową dla rozwinięcia przyszłych zastosowań klinicznych w sferze na-
prawy i regeneracji tkanek łącznych. Wyzwaniem jest także utrzymanie w hodowli multipotencjalności
uzyskanych komórek macierzystych [2]. Między innymi z tego powodu przeprowadza się próby izolacji
MSC z innych tkanek. Do tej pory udało się ustalić, że ich źródłem mogą być: maź stawowa oraz błona
maziowa, okostna, tkanka chrzęstna, mięśnie szkieletowe, ścięgna, tkanka tłuszczowa, tkanki płodowe
(w tym np. wątroba), łożysko, krew płodowa, płyn owodniowy, błona owodniowa, błona kosmówkowa,
pępowina wraz z galaretą Wharton’a, krew pępowinowa), krew obwodowa, trzustka, stroma śledziony,
stroma grasicy, skóra, istota gąbczasta kości, płuca, endometrium, miazga zębowa, zęby mleczne [2, 4,
15, 18, 22].

Krew pępowinowa jako źródło komórek macierzystych

Krew pępowinowa stanowi część krwi wytworzonej przez rozwijający się płód w trakcie trwania

ciąży. Podczas życia płodowego jest ona konieczna do prawidłowej wymiany tlenu oraz substancji od-
ż

ywczych między matką a płodem. Wymiana ta zachodzi za pośrednictwem pępowiny, przy czym sama

krew pępowinowa nie miesza się z krwią matki.

Po porodzie krew pępowinowa pozostaje w sznurze pępowinowym oraz w naczyniach części pło-

dowej łożyska [6, 17, 22]. Pomimo udowodnionej znacznej zawartości komórek macierzystych [23],
krew pępowinowa wraz z łożyskiem stanowi najczęściej odpad biologiczny i zwykle jest poddawana
utylizacji [22].

Krew pępowinową można pobierać zarówno podczas porodu odbywającego się siłami natury [7, 22,

24], jak i w trakcie cesarskiego cięcia [22, 25]. W drugim przypadku wiąże się to jednak ze zmniejsze-
niem liczby białych krwinek na mililitr pobranej krwi pępowinowej [25]. W większości przypadków
krew pępowinowa jest pobierana przed urodzeniem łożyska [7, 19, 26], jednak w sytuacji, gdy proces
pobierania krwi zakłócałby przebieg porodu, krew pępowinową uzyskuje się z łożyska, które po jego
urodzeniu umieszcza się na specjalnym statywie [11, 26]. Następująca po pobraniu preparatyka krwi
pępowinowej jest procesem wieloetapowym, obejmującym izolację komórek mononuklearnych i
oczyszczanie populacji komórek macierzystych. Liczba uzyskanych w ten sposób komórek macierzys-
tych zależy od umiejętności pobierającego, a także od takich czynników jak: wielkość łożyska i pojem-
ność jego naczyń, długość sznura pępowinowego, czas trwania porodu oraz czas krzepnięcia krwi.

Krew pępowinowa jest ważnym, szeroko akceptowanym źródłem hematopoetycznych komórek

macierzystych [17, 19], dlatego coraz częściej zostaje ona pobierana podczas porodu i następnie gro-
madzona w bankach krwi pępowinowej [23]. Na świecie do roku 2004 pobrano, zamrożono i nadal
przechowuje się ponad 100000 jednostek krwi pępowinowej [6], które mogą zostać wykorzystane do
przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych zarówno u dzieci, jak i u dorosłych [19].

Krew pępowinowa jest trzecim pod względem ważności źródłem komórek macierzystych wykorzy-

stywanych do transplantacji. Pozostałymi dwoma są szpik kostny oraz krew obwodowa [9]. Do prze-
szczepu można wykorzystać zarówno całkowitą krew pępowinową, jak i wysoko oczyszczone popula-
cje komórek macierzystych, czy nawet pojedyncze komórki [9]. Do 2003 roku na świecie przeprowa-
dzono 3000 autologicznych i allogenicznych przeszczepów krwi pępowinowej [11], natomiast do roku
2008 liczba ta wzrosła do prawie 8000 [13].

W 1994 roku ukazało się doniesienie dotyczące możliwości uzyskania z krwi pępowinowej komó-

rek adherentnych stromy, co udało się wstępnie potwierdzić w roku 2000 [12]. 3 lata później krew pę-

Metody wydajnej izolacji i hodowli

653

powinowa została uznana za alternatywne źródło MSC, zarówno do przeszczepów auto-, jak i alloge-
nicznych [11, 14, 19]. Obecnie nie jest znane dokładne pochodzenie MSC krwi pępowinowej, jednak
sugeruje się, że komórki te wywodzą się z płodowej wątroby lub szpiku kostnego i w trakcie życia pło-
dowego zostają uwolnione do krwioobiegu płodu, skąd trafiają do krwi pępowinowej [21, 27].

W porównaniu z innymi źródłami komórek macierzystych, krew pępowinowa ma wiele zalet [9, 11,

20]. Jedną z nich jest fakt, że obecne w niej komórki macierzyste są mniej dojrzałe zarówno pod wzglę-
dem stopnia zróżnicowania, jak i pod względem immunologicznym [9, 22, 27]. Komórki macierzyste
krwi pępowinowej wykazują także większy potencjał proliferacyjny w porównaniu z dorosłymi komór-
kami macierzystymi [11]. Szybsze tempo podziałów oraz mniejsza dojrzałość komórek macierzystych
z krwi pępowinowej wynikają z obecności w tych komórkach dłuższych odcinków telomerowych, bę-
dących skutkiem obecności aktywnej telomerazy. Dodatkowo genom komórek macierzystych z krwi
pępowinowej nie wykazuje cech starzenia się, co stwierdza się na postawie znikomego (bądź braku)
stopnia uszkodzenia materiału genetycznego spowodowanego promieniowaniem, mutagenami środowi-
skowymi lub błędami powstałymi w trakcie replikacji DNA oraz podziału chromosomów [11].

Korzystnym aspektem wykorzystania komórek macierzystych z krwi pępowinowej do transplantacji

jest także fakt, że proces ten obarczony jest niskim ryzykiem odrzucenia przeszczepu [9, 20]. Stąd też
możliwe jest wykonanie transplantacji komórek krwi pępowinowej od niespokrewnionego dawcy, po-
siadającego do dwóch niedopasowań w układzie antygenów HLA. Ostatecznie prowadzi to do znaczne-
go poszerzenia puli dostępnych dawców [20, 22].

Kolejną zaletą komórek macierzystych z krwi pępowinowej jest większa prostota i nieinwazyjność

metody pobrania materiału biologicznego w porównaniu z innymi tkankami, takimi jak szpik kostny
czy tkanka tłuszczowa [21, 22]. Obecnie ze względu na niewielką liczbę MSC w jednej porcji krwi
pępowinowej [21, 26, 28], transplantacje komórek macierzystych z tego źródła stosuje się głównie
w przypadku dzieci [11]. Wynika to z faktu, że do przeprowadzenia transplantacji komórek macierzys-
tych z krwi pępowinowej niezbędna jest odpowiednia ilość komórek jądrzastych, wynosząca 2,5×10

7

na

kilogram masy ciała pacjenta [26]. Równocześnie trwają jednak badania nad namnażaniem pozaustro-
jowym komórek macierzystych, co wraz z możliwością łączenia kilku jednostek krwi od różnych daw-
ców, może spowodować rozszerzenie puli odbiorców tej metody leczenia także o osoby dorosłe [11,
26].

Mezenchymalne komórki macierzyste

Populacja MSC pochodzących z jednego źródła jest heterogenna. Do tej pory nie udało się bowiem

zdefiniować markera powierzchniowego charakterystycznego dla tych komórek, który tym samym po-
zwalałby na standaryzację procedur ich izolacji z różnych źródeł [2, 3, 5, 9]. Prawdopodobną tego przy-
czyną jest fakt, że MSC dzielą pewne cechy z komórkami endotelialnymi, epitelialnymi oraz mięśnio-
wymi [2]. Dodatkowym utrudnieniem jest zmiana fenotypu MSC w trakcie ich hodowli w warunkach
in vitro [3].

MSC nie posiadają takich antygenów, jak: CD45 (wspólny antygen leukocytarny), CD34 (sialomu-

cyna, prymitywny marker ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych), CD14 (receptor
LPS), CD11b (marker komórek odpornościowych), CD235 (glikoforyna A, marker linii erytroidalnej),
Ter119, CD31, MHC klasy II [2, 9, 10, 16, 22]. Na powierzchni tych komórek występują natomiast:
CD73 (ekto-5’nukleotydaza), STRO-1, CD105 (endoglina), CD44, CD29, CD90/Thy-1, CD106
(VCAM-1), CD27, CD271, CD13, Sca1, CD10, CD166, HLA klasy I [3, 5, 9, 10, 16, 22]. Szczególne
zainteresowanie wzbudza antygen CD146, wykazujący zmienną ekspresję w MSC. Sugeruje się bo-
wiem, że może on stanowić marker multipotencji tych komórek [21].

Na immunofenotyp komórek wpływa wiele czynników. Z punktu widzenia hodowli MSC w warun-

kach in vitro, najbardziej znaczącym jest jego zmienność pod wpływem trwania samej hodowli [3].
Poza tym na ekspresję markerów powierzchniowych wpływają także inne czynniki, jak rodzaj tkanki

A. GESE, K. ROSZEK

654

ź

ródłowej, wiek dawcy, rodzaj przeciwciał stosowanych do izolacji, senescencja w hodowli in vitro,

rodzaj zastosowanej pożywki czy jej suplementacja [18].

Podczas hodowli in vitro, wzrastające komórki MSC należy analizować pod względem cząsteczek

zaliczanych do negatywnych markerów MSC, obecnych na powierzchni tych komórek, które mogą
przypadkowo zostać wyizolowane wraz z MSC. Do tych typów komórek należą: komórki dendrytyczne
(CD1a, CD33), monocyty (CD14, CD33), limfocyty (CD3, CD45), hematopoetyczne komórki macie-
rzyste (CD34). Ze względu na brak charakterystycznego markera, a także na różnice w fenotypie komó-
rek MSC, koniecznym elementem oceny jakości wyizolowanych MSC jest określenie zdolności do
różnicowania w kierunku tkanki kostnej, chrzęstnej oraz tłuszczowej [18, 22].

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej

Standardowe podejście do izolacji MSC obejmuje uzyskanie z tkanki wyjściowej populacji komó-

rek mononuklearnych, którą następnie wysiewa się na szalki w standardowej gęstości w minimalnych
pożywkach zawierających płodową surowicę bydlęcą (FBS, ang. fetal bovine serum) [14, 21, 22]. Po
24

–

48 godzinach poprzez zmianę pożywki usuwane są komórki nieadherentne, a hodowla komórek

przylegających do plastiku prowadzona jest do momentu znacznej redukcji szybkości wzrostu komórek
[7, 8]. Następuje to najczęściej po przekroczeniu wartości 40 podwojeń populacji. Po tym czasie dodaje
się czynniki wzrostu, w wyniku czego otrzymuje się selektywne wzbogacenie określonej subpopulacji
MSC. Najczęściej wykorzystywanym czynnikiem wzrostu jest zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów
(bFGF, ang. fibroblast growth factor), który w obecności 10% FBS wydłuża długość życia MSC do 70
podwojeń populacji [2].

Przed przystąpieniem do izolacji MSC, krew pępowinową rozcieńcza się często buforem fosfora-

nowym (PBS, ang. phosphate-buffered saline) w stosunku 1:1 [7, 14, 19]. Czasami usuwa się także z
próbki erytrocyty poprzez dwugodzinną inkubację krwi z 3% żelatyną w soli fizjologicznej w tempera-
turze pokojowej. Po tym czasie próbkę wiruje się przez 10 minut przy 400g. W wyniku tej procedury
otrzymuje się supernatant bogaty w komórki mononuklearne [24].

Właściwa izolacja komórek mononuklearnych obejmuje nałożenie próby na medium do izolacji i

wirowanie w gradiencie gęstości. Stosuje się różne rodzaje roztworów na bazie glicerolu o gęstości
1,077 g/cm

3

: Ficoll-Paque-Plus [7, 20, 21], Ficoll/Uropolina [11], Ficoll [14], Ficoll-Hypaque [17, 19,

24], Ficoll-Paque [8, 25, 28]. Tak przygotowane próby następnie się wiruje w następujących warun-
kach: 20–30 minut [7, 14, 19-21, 24, 25], 400-435g [7, 14, 19, 21, 24, 25], 10ºC [14] lub temperatura
pokojowa [7, 19, 21]. W wyniku tej procedury krew rozdziela się na szereg frakcji w zależności od
gęstości komórek w nich zawartych. MSC znajdują się w interfazie, nad fazą fikolową [14, 19, 21].
Komórki te pobiera się i przemywa roztworem PBS [14, 19, 21], a następnie wiruje przy 200g przez 10
minut w temperaturze pokojowej [14]. Uzyskane komórki mononuklearne są najczęściej umieszczane
w gęstości 1–4×10

6

komórek/cm

2

[7, 11, 17, 19-21, 24] na szalkach powlekanych płodową surowicą

cielęcą (FCS, ang. fetal calf serum) [7, 19] bądź niepowlekanych [14].

Nie istnieje metoda, która gwarantowałaby równocześnie odpowiednią wydajność i powtarzalność

przeprowadzanej izolacji MSC, gdyż metoda łącząca obie te cechy wymagałaby odtworzenia w hodow-
li złożonego środowiska in vivo danej tkanki [2].

Aby zwiększyć wydajność izolacji dodatkowo wykorzystuje się różnorodne techniki wzbogacania

populacji w komórki o pożądanych właściwościach. Metody te wykorzystują różne cechy MSC, jak
wielkość, zdolność tworzenia monowarstwy lub rodzaj występujących na powierzchni komórek cząste-
czek markerowych [2]. W wyniku zastosowania tych procedur uzyskuje się populacje odmienne pod
względem potencjału do wzrostu oraz różnicowania [2, 18].

Niezależnie od rodzaju tkanki, możliwe jest przeprowadzenie etapu wzbogacania populacji w pożą-

dane komórki. Na tym poziomie można zastosować kilka metod. Najczęściej wykorzystywanymi z nich
są: wzbogacanie przez wirowanie w gradiencie gęstości oraz oczyszczanie w oparciu o zdolność MSC
do adhezji. Pierwsze podejście wykorzystuje znaną gęstość MSC, która wynosi 1,073 g/ml [12], jednak

Metody wydajnej izolacji i hodowli

655

w jej wyniku nadal otrzymuje się populację heterogenną pod względem zdolności do proliferacji i róż-
nicowania [10]. Druga procedura obejmuje usuwanie niezwiązanych z powierzchnią naczynia hodow-
lanego komórek poprzez wymianę pożywki po określonym czasie od założenia hodowli (1–7 dni) [12,
18]. Dodatkowo istnieje także metoda pozwalająca na usunięcie innych adherentnych komórek zanie-
czyszczających populację MSC, takich jak: makrofagi i komórki endotelialne. Jest to procedura czaso-
chłonna, wymagająca wielu cykli obejmujących hodowlę i pasażowanie [12]. Redukcję adhezji mono-
cytów znajdujących się w izolowanym preparacie komórek mononuklearnych uzyskuje się przez su-
plementację medium hodowlanego 10

–7

M deksametazonem. Po tygodniowej hodowli usuwa się ko-

mórki nieadherentne i wymiena pożywkę na pozbawioną deksametazonu [21].

Podczas oczyszczania heterogennej populacji komórek wykorzystuje się specyficzne przeciwciała

przeciwko obecnym na powierzchni MSC cząsteczkom markerowym [18]. Wykorzystuje się je podczas
pozytywnej lub negatywnej selekcji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej [22], magnetycznej
separacji komórek opłaszczonych metalowymi kulkami powlekanymi immunoglobulinami (MACS,
ang. magnetic immunobead-activated cell sorting) [18, 28] bądź poprzez sortowanie komórek w opar-
ciu o fluorescencję barwników związanych z przeciwciałami (FACS, ang. fluorescence-activated cell
sorting) [18].

Do izolacji oczyszczonych populacji MSC wykorzystuje się także technikę polegającą na selektyw-

nej hodowli komórek o odpowiedniej wielkości [29]. Uzyskanie czystej kulury komórek jest także moż-
liwe dzięki metodzie zwanej ograniczonym rozcieńczaniem [8, 18]. Dodatkowo stosuje się nowatorskie
techniki. Jedną z nich jest izolacja MSC w oparciu o kulki magnetyczne powlekane aptamerami – spe-
cyficznymi względem komórek cząsteczkami DNA [18].

Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych

W hodowli MSC w warunkach in vitro stosuje się różnorodne pożywki: DMEM [17, 21, 22], LG-

DMEM [7, 14, 20, 25], IMDM [8, 11, 24], MSCGS [7, 19, 25],

α

-MEM [25] wzbogacane surowicą 10–

20% (FBS (8, 17, 20, 21, 25) lub FCS [7, 11, 14]), 2-20mM L-glutaminą [8, 14, 17, 20, 24, 25], piro-
gronianem sodu [25], antybiotykami [8, 14, 17, 20, 24] oraz cytokinami: bFGF [8, 21], SCF (czynnik
wzrostu komórek pnia, ang. stem cell factor) [21], IL-3 [21], EGF (czynnik wzrostu naskórka, ang.
epidermal growth factor) [25], VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, ang. vascular
endothelial growth factor) [25].

Od momentu stwierdzenia w 1995 roku przez Caplana, że podstawowa pożywka jest niewystarcza-

jąca do zapewnienia adhezji i proliferacji MSC, coraz częściej stosuje się suplementację mediów ho-
dowlanych różnymi rodzajami surowic [12]. Do tej pory nie opracowano niezawodnej metody izolacji
MSC, niewykorzystującej surowicy. Najczęściej stosuje się suplementację surowicą o stężeniu od 2 do
20%. Większość protokołów opiera się o dodanie FCS [3]. Dostarcza ona komórkom niezbędnych
czynników wzrostu oraz białek odpowiedzialnych za adhezję [12]. Obawy wynikające z możliwości
przeniesienia na hodowane komórki BSE lub innej infekcji oraz nieprzewidywalna reakcja immunolo-
giczna gospodarza powodują prowadzenie dalszych badań nad innymi suplementami pożywek. Udało
się opracować techniki oparte na alternatywnych odczynnikach pochodzenia ludzkiego – surowicy,
lizatu płytkowego bądź osoczu. Jednakże wpływ tych składników na jakość preparatów komórkowych
jest nieznany. Badania nad kinetyką wzrostu oraz morfologią komórek wskazują na ich istotne znacze-
nie w procesie izolacji i wzrostu komórek [3, 30]. Wadą płodowej surowicy cielęcej, a także innych
preparatów surowiczych, jest także brak stałego, zdefiniowanego i niezmiennego składu. Zawierają one
nieznane czynniki wzrostu, które mogą wpływać na fizjologię MSC lub modyfikować ekspresję genów
[12]. Rozwój w chemicznie zdefiniowanym, pozbawionym surowicy środowisku jest istotny dla ujed-
nolicenia metod izolacji MSC [3]. Suplementacja pożywki bFGF minimalizuje wpływ różnic w skła-
dzie surowicy, natomiast czynniki wzrostowe zawarte w płytkach krwi znoszą całkowicie jej działanie.
Szczególnie ważny jest w tej grupie płytkowy czynnik wzrostu (PDGF, platelet-derived growth factor).
W hodowli MSC wykorzystywany jest od lat osiemdziesiątych XX wieku, ze względu na silne działa-

A. GESE, K. ROSZEK

656

nie mitogenne, w wyniku czego komórki dzielą się szybciej, przy zachowaniu ogólnej, charakterystycz-
nej morfologii [12].

W latach dziewięćdziesiątych XX wieku opracowano pożywkę do hodowli MSC, pozwalającą na

jej prowadzenie w określonych warunkach składu podłoża. Pożywka ta nie zawiera cząsteczek odpo-
wiedzialnych za adhezję ani czynników wzrostu. Zatem do utrzymania odpowiedniego poziomu proli-
feracji niezróżnicowanych komórek niezbędne jest zastosowanie powlekania powierzchni naczyń ho-
dowlanych fibronektyną oraz dodanie do pożywki odpowiednich czynników wzrostu [12].

Hodowla in vitro MSC jest prowadzona w 37ºC [7, 11, 14, 17, 19, 20, 24], w atmosferze o odpo-

wiedniej wilgotności [7, 19, 20, 24] i stężeniu dwutlenku węgla wynoszącym około 5% [7, 11, 14, 17,
19, 20, 24] do momentu uzyskania 60-80% stanu konfluencji [8, 11, 14, 17, 20]. Po ustalonym czasie
usuwa się z hodowli komórki nieadherentne poprzez wymianę pożywki nad warstwą komórek przykle-
jonych do podłoża [8, 19]. Najczęściej przeprowadza się to po więcej niż 12 godzinach hodowli [7, 17,
20] (1-5 dni [17, 20]). Zbyt krótki czas pozwalający komórkom adherentnym na przyleganie do naczyń
hodowlanych powoduje obniżenie efektywności izolacji MSC [6].

Po uzyskaniu populacji komórek adherentnych wymienia się całą objętość pożywki co 3-5 dni [8,

14, 20], bądź połowę objętości pożywki raz w tygodniu [11, 17, 24]. Hodowlę prowadzi się do momen-
tu uzyskania ponad 50% konfluencji [8, 11, 14, 17, 20], a następnie przeprowadza się pasażowanie
przez trypsynizację [7, 8, 11, 14, 17, 19, 20], rozcieńcza w stosunku 1:3 [8, 11] i wysiewa w gęstości 2–
5×10

3

komórek/cm

2

[7, 17, 19, 20].

Na zdolność proliferacji MSC w warunkach in vitro duży wpływ ma stężenie tlenu w fazie gazowej

nad powierzchnią pożywki. 20% zawartość tlenu obecna w powietrzu atmosferycznym nie przypomina
warunków fizjologicznych właściwych dla MSC. W warunkach in vivo stężenie tlenu jest znacznie
niższe i różni się w zależności od rodzaju tkanki i umiejscowienia w niej komórek macierzystych.
Przykładowo w tkance kostnej stężenie tlenu waha się od 1–12%. MSC w tych warunkach są narażone
na działanie hipoksji. Hodowla pozaustrojowa w warunkach niedoboru tlenu stymuluje proliferację
i wydłuża czas życia komórek. Hipoksja zwiększa produkcję (zarówno syntezę, jak i organizację) ele-
mentów macierzy zewnątrzkomórkowej, a także zmienia ekspresję genów zaangażowanych w metabo-
lizm. Obniżona zawartość tlenu indukuje także produkcję czynników wzrostu takich, jak: VEGF, endo-
telialny czynnik wzrostu wiążący heparynę (HB-EGF, heparin-binding endothelial growth factor) oraz
czynnik wzrostowy łożyska (PGF, placenta growth factor). Dodatkowo hipoksja obniża potencjał do
różnicowania MSC, ułatwiając w ten sposób utrzymanie ich w stanie niezróżnicowanym [12].

Odpowiednie warunki hodowli oraz przeprowadzanie pasażowania wystarczają do otrzymania osta-

tecznie oczyszczonych MSC pozbawionych populacji innych komórek adherentnych (makrofagi, lim-
focyty, komórki endotelialne). Jednak kolejne pasaże mogą zmieniać cechy MSC. Mogą powodować
redukcję szybkości podziałów oraz utratę multipotencjalności. Starzenie się MSC podczas wzrostu w
warunkach in vitro może być powiązane z długością telomerów [12].

Jakość otrzymanych MSC można ocenić na podstawie analizy morfologii komórek [7, 17, 19], ich

zdolności do proliferacji [8, 20], potencjału do różnicowania [7, 8, 14, 20], immunofenotypu (np. meto-
dą FACS) [7, 8, 14, 17, 19, 20] oraz ekspresji genów [17, 20].

Uwagi końcowe

Porównanie efektywności metod stosowanych do izolacji MSC z krwi pępowinowej jest utrudnione

poprzez brak standaryzacji protokołów oraz przez szereg różnych czynników wpływających na wydaj-
ność izolacji oraz hodowli tych komórek – Rycina 1.

Metody wydajnej izolacji i hodowli

657

Ryc. 1. Czynniki wpływające na wydajność izolacji i hodowli MSC (3) – zmodyfikowano.

Fig. 1. Factors affecting the efficiency of MSC isolation and culture (3)

–

modified

Ustalono doświadczalnie, że objętość pobranej próbki krwi pępowinowej przekraczająca 33 ml,

czas od pobrania do izolacji komórek macierzystych – nie większy niż 15 godzin oraz uzyskana ogólna
liczba komórek mononuklearnych przekraczająca 10

8

pozwalają na efektywną izolację MSC z 60%

jednostek krwi [12, 25, 31]. Znaczną poprawę efektywności (nawet 90%) uzyskuje się skracając czas do
mniej niż 2 godzin, przy wyselekcjonowaniu jednostek krwi pępowinowej przekraczających objętość
90 ml [21].

Na efektywność izolacji MSC wpływają także czynniki niezależne od samej procedury izolacji [3,

12]. Najważniejszym parametrem tego typu jest zmienność dawcy materiału. MSC są izolowane jako
pierwotne preparaty komórkowe od dawców o różnym podłożu genetycznym. Dlatego wykluczenie
wpływu tego parametru na izolację jest praktycznie niemożliwe [3].

MSC mogą być pasażowane ograniczoną liczbę razy – ok. 8–15 pasaży, co odpowiada 25–40 po-

dwojeniom populacji. Po tym czasie komórki ulegają senescencji (starzeniu się) i przestają prolifero-
wać. Towarzyszą temu zmiany morfologiczne objawiające się powiększeniem komórek. Obserwowana
jest także redukcja gęstości hodowli. Dokładny molekularny mechanizm senescencji jest nieznany.
Wiadomo jednak, że proces starzenia komórkowego ma wpływ na profile molekularne oraz cechy
funkcjonalne MSC. Wykazano także, że komórki w stanie konfluencji tracą częściowo potencjał do
różnicowania [3].

MSC są często poddawane zamrażaniu w ciekłym azocie w obecności dimetylosulfotlenku

(DMSO). Udowodniono, że w wyniku kriokonserwacji komórki te nie tracą potencjału do różnicowania
[3], jednak ilość komórek macierzystych po rozmrożeniu spada do 0–19% liczebności wyjściowej po-
pulacji [12]. Nie można wykluczyć także wpływu zamrażania na właściwości biologiczne MSC [3].

Wszystkie te czynniki wpływają na brak powtarzalności rezultatów zastosowanych procedur izola-

cji MSC z krwi pępowinowej, przez co ograniczają kliniczne możliwości ich wykorzystania [21]. Ze
względu na liczbę możliwych różnic wynikających z wpływu wspomnianych czynników, nie jest moż-
liwe uwzględnienie ich wszystkich w procedurze izolacji i hodowli MSC. Dlatego właśnie odnalezienie
precyzyjnego markera molekularnego, który mógłby być stosowany do specyficznej izolacji wszystkich
MSC – niezależnie od ich źródła, wydaje się być niezbędne [3].

Wydajność izolacji i hodowli MSC

Zmienność dawcy

Rodzaj tkanki:
- szpik kostny
- krew pępowinowa
- krew obwodowa
- tkanka tłuszczowa
- skóra

Hodowla in vitro:
- czas hodowli
- pasażowanie
- senescencja
- gęstość komórek
- kriokonserwacja

Suplementacja surowicą:
- FCS (i inne)
- ludzka surowica
- osocze bogate w płytki

Suplementacja związkami
chemicznymi:
- L-glutamina
- pirogronian sodu
- antybiotyki
- cytokiny i czynniki wzro-
stu

Warunki hodowli:
- rodzaj pożywki podstawo-
wej
- ciśnienie tlenu
- stężenie dwutlenku węgla

Biomateriały i powlekanie powierzchni:
- adhezja do plastiku
- powlekanie fibronektyną, żelatyną, kolagenem
- hodowle 3D

Metoda izolacji komórek i wzbo-
gacanie:
- ficoll
- rodzaj użytych markerów moleku-
larnych:
- eliminacja komórek CD45
- pozytywna selekcja (np. CD271)
- kriokonserwacja

A. GESE, K. ROSZEK

658

PIŚMIENNICTWO

1.

Urbaniak-Kujda D, Wołowiec D, Tomaszewska-Toporska B, Kapelko-Słowik K, Kuliczkowski K. Mezenchymalne
komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych. Acta Haematol Pol. 2005; 36(2):161-6.

2.

Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and
gene therapy. J Cell Mol Med. 2004; 8(3): 301-16.

3.

Wagner W, Ho AD. Mesenchymal stem cell preparations - comparing apples and oranges. Stem Cell Rev. 2007; 3(4):
239-48.

4.

Pountos I, Giannoudis PV. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 2005; 36 Suppl 3:S8-S12.

5.

Bajek A, Olkowska J, Drewa T. Mezenchymalne komórki macierzyste narzędziem terapeutycznym w regeneracji tkanek i
narządów. Postepy Hig Med Dosw. 2011; 65: 124-32.

6.

Lee MW, Choi J, Yang MS, Moon YJ, Park JS, Kim HC, et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human
umbilical cord blood. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320(1): 273-8.

7.

Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kluter H, Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,
umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006; 24(5): 1294-301.

8.

Lee OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from
umbilical cord blood. Blood. 2004; 103(5): 1669-75.

9.

Bieback K, Kluter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood. Curr Stem Cell Res Ther. 2007;2(4):310-23.

10.

Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche,
self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 2007; 9(1): 204.

11.

Pojda Z, Machaj EK, Gajkowska A, Ołdak T, Jastrzewska M. Badanie potencjalnej przydatności klinicznej komórek
macierzystych uzyskiwanych z krwi pępowinowej. Postępy Biol Kom. 2003; 30: 127-37.

12.

Bourin P, Gadelorge M, Peyrafitte J-A, Fleury-Cappellesso S, Gomez M, Ragea C, et al. Mesenchymal Progenitor Cells:
Tissue Origin, Isolation and Culture. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2008; 35: 160-7.

13.

Roszek K, Komoszynski M. Kontrola i kierunki różnicowania komórek macierzystych krwi pępowinowej oraz ich
zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2008; 62: 660-7.

14.

Musina RA, Bekchanova ES, Belyavskii AV, Grinenko TS, Sukhikh GT. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
Bull Exp Biol Med. 2007; 143(1): 127-31.

15.

Chen Y, Shao JZ, Xiang LX, Dong XJ, Zhang GR. Mesenchymal stem cells: a promising candidate in regenerative
medicine. Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40(5): 815-20.

16.

Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm (Lond). 2005;
2: 8.

17.

Goodwin HS, Bicknese AR, Chien SN, Bogucki BD, Quinn CO, Wall DA. Multilineage differentiation activity by cells
isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. Biol Blood Marrow Transplant. 2001;
7(11): 581-8.

18.

Rojewski MT, Weber BM, Schrezenmeier H. Phenotypic Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Various
Tissues. Transfus Med Hemother. 2008; 35: 168-84.

19.

Feldmann RE, Jr., Bieback K, Maurer MH, Kalenka A, Burgers HF, Gross B, et al. Stem cell proteomes: a profile of
human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood. Electrophoresis. 2005; 26(14): 2749-58.

20.

Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, Hwang SH, Kim SW, Yang IH, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical
cord blood-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 321(1): 102-8.

21.

Zhang X, Hirai M, Cantero S, Ciubotariu R, Dobrila L, Hirsh A, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem
cells from human umbilical cord blood: Reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to
proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose
tissue. J Cell Biochem. 2011; 112(4): 1206-18.

22.

Malgieri A, Kantzari E, Patrizi MP, Gambardella S. Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem
cells: state of the art. Int J Clin Exp Med. 2010; 3(4): 248-69. PMCID: 2971538.

23.

Sikora MA, Olszewski WL. Komórki macierzyste - biologia i zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2004;
58: 202-8.

24.

Alfonso ZZC, Forneck ED, Allebrandt WF, Nardi NB. Establishment of an adherent cell layer from human umbilical cord
blood. Genetics and Molecular Biology. 2000; 23(3): 519-22.

25.

Flynn A, Barry F, O'Brien T. UC blood-derived mesenchymal stromal cells: an overview. Cytotherapy. 2007; 9(8): 717-
26.

26.

Rubinstein P. Cord blood banking for clinical transplantation. Bone Marrow Transplant. 2009; 44(10): 635-42.

27.

Korycka A, Robak T. Komórki macierzyste krwi pępowinowej - nadzieje i rzeczywistość. Acta Haematol Pol. 2005; 36:
389-98.

28.

Laitinen A, Laine J. Isolation of mesenchymal stem cells from human cord blood. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2007;
Chapter 2: Unit 2A 3.

29.

Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, Li H, Ma HL, Lo WH. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human
bone marrow. Stem Cells. 2002; 20(3): 249-58.

Metody wydajnej izolacji i hodowli

659

30.

Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, Perotti C, Zaffaroni N, Novara F, et al. Generation of mesenchymal stromal
cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-
derived progenitors. Haematologica. 2009; 94(12): 1649-60. PMCID: 2791945.

31.

Fan X, Liu T, Liu Y, Ma X, Cui Z. Optimization of primary culture condition for mesenchymal stem cells derived from
umbilical cord blood with factorial design. Biotechnol Prog. 2009; 25(2): 499-507.

Praca wpłynęła do Redakcji 16.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 03.11.2011 r.


Adres do korespondencji:
Anna Gese
Zakład Biochemii UMK
ul. Gagarina 7
87-100 Toruń
e-mail: [e-mail]