IX Hodowle pierwotne

komórek nerwowych

Rodzaje komórek

nerwowych i ich

identyfikacja w hodowli

Tkanka nerwowa składa się z

neuronów i komórek glejowych, tj.
makrogleju (astrocyty,
oligodendrocyty) i mikrogleju.

Początkowo najwięcej jest neuronów,

których większość umiera w życiu
płodowym w wyniku spontanicznej
apoptozy.

Ze względu na liczbę wypustek (aksonów i

dendrytów), neurony dzieli się na:



jednobiegunowe (np. w
podwzgórzu);



pseudojednobiegunowe (zwoje
czuciowe nerwów czaszkowych i
rdzeniowych);



dwubiegunowe (np. w siatkówce
oka, błonie węchowej);



wielobiegunowe:



z długim aksonem (np. neurony
ruchowe rdzenia kręgowego);



z krótkim aksonem (dendrytem) (np.
neurony kojarzeniowe w istocie szarej
mózgu i rdzenia kręgowego).

Pod względem kierunku przekazywania

sygnału neurony dzieli się na:

1.

czuciowe (aferentne, dośrodkowe),
biegnące od receptora do ośrodka;

2.

ruchowe (eferentne, odśrodkowe),
biegnące od ośrodka do efektora;

3.

kojarzeniowe (pośredniczące),
występujące między innymi
pomiędzy neuronami czuciowymi i
ruchowymi.

Neurony dzieli się również według głównego

wydzielanego neuroprzekaźnika. Według tego

kryterium wyróżnia się między innymi neurony:



cholinergiczne – głównym
neuroprzekaźnikiem jest
acetylocholina;



dopaminergiczne – dopamina;



GABA-ergiczne – kwas gamma-
aminomasłowy (GABA);



noradrenergiczne – noradrenalina,
itd.

Wyróżniamy dwa sposoby (kierunki)

przekazu bodźca wewnątrz neuronu:



ortodromowo – z perykarionu (ciała
komórki) do synaps



antydromowo – z synaps do
perykarionu (ciała komórki)

Podział ze względu na długość

wypustek:

1.

Golgi I – długie aksony, na dalekie
odległości;

2.

Golgi II – krótkie wypustki, na małe
odległości.

Dojrzałe neurony w hodowli in vitro

przypominają wyglądem neurony
obserwowane in situ.

We wczesnym etapie rozwoju kiedy

neurony i ich wypustki są jeszcze
niewielkie trudno je odróżnić od
komórek glejowych.

Komórki nerwowe można identyfikować

immunocytochemicznie in vitro dzięki
występowaniu w nich typowych białek,
np. :



w neuronach znajdują się białka: tau,
MAP2



w astrocytach białko GFAP



poszczególne typy neuronów można
rozróżnić poprzez ich neuroprzekazniki i
związane z nimi enzymy np.

interneurony

hamujące zawierają GABA, neurony
dopaminergiczne- hydroksylazę tyrozynowa itp..

Hodowane neurony są postmitotyczne i w

warunkach in vitro już się dalej nie dzielą
tylko dojrzewają

Komórki glejowe zachowują swój potencjał

mitotyczny dzięki czemu ich hodowla w
porównaniu z neuronami jest znacznie
łatwiejsza. Nawet jeśli duża liczba tych
komórek zginie w początkowym okresie
hodowania, to po pewnym czasie pozostałe
komórki dzieląc się „nadrobia” straty

Wymagania odżywcze

komórek

pH



pH warunkujące optymalną przeżywalność

komórek nerwowych w hodowli in vitro waha się
między 7,2 a 7,4



Utrzymuje się ono dzięki wysokiemu stężeniu
dwutlenku węgla w inkubatorze i buforami
znajdującymi się w pożywce



Komórkom nie dzielącym się można podać
pirogronian sodu, co nasila ich oddychanie
mitochondrialne i w konsekwencji pozwala
ustawić optymalne pH

Tlen i przeciwutleniacze



Do pożywki dodaje się selen, który będąc
kofaktorem peroksydazy glutationowej
działa jako zmiatacz wolnych rodników



Dodanie witaminy E chroni komórki przed
peroksydacją wielonienasyconych kwasów
tłuszczowych



Zastosowanie pożywki bez surowicy
ogranicza stężenie glutaminianu

glukoza



Jest czynnikiem energetycznym w
komórce i nasila oddychanie
komórkowe



Jej nadmiar może wywołać spadek
aktywności dyzmutazy nadtlenkowej
potrzebnej w walce z wolnymi
rodnikami

glutamina



Jest obok glukozy głównym źródłem energii
komórek w hodowli in vitro



jednak gdy w pożywce rośnie nadmiernie
ilość produktów rozpadu glutaminy tj.
kwasu



pirolidono-5-karboksylowego oraz
amoniaku może być ona szkodliwa



Są doniesienia, iż sama glutamina jest
toksyczna dla neuronów

Antybiotyki i cytostatyki



Penicylina



Streptomycyna



Gentamycyna

Penicylina już w stężeniu 30 i.u. zaburza prądy

chlorkowe receptora GABA w neuronach

W celu zahamowania wzrostu gleju najczęściej

stosuje się AraC „cytozar”

Prowadzenie hodowli w pożywkach bez surowicy

ogranicza proliferację astrocytów

Typy hodowli pierwotnych

Komórki nerwowe można hodować na

kilka sposobów. Mogą to być hodowle:

1.

Polimorficzne neuronalno-glejowe, gdzie w
równym stopniu będą się znajdować neurony i
glej

2.

kokultury, w których w odpowiednim stosunku
będą hodowane różne typy komórek nerwowych

3.

Wzbogacone w neurony, z najwyżej 5-10%
udziałem gleju

4.

Polimorficzne glejowe, z różnymi typami
komórek glejowych

5.

Monokultury glejowe: astrocytów, mikrogleju

Hodowle wzbogacone w

neurony

Materiał do hodowli neuronów pobiera się

tradycyjnie z zarodków lub też z
noworodków bądź kilkudniowych osesków.

Przyczynia się do tego obserwowana

wówczas mniejsza podatność neuronów na
uszkodzenia. W tym czasie bowiem
neurony nie wykształcają jeszcze dużych
wypustek aksonalnych i dendrytycznych

Kora nowa

Hodowle wzbogacone w neurony kory nowej

wyprowadza się z 15-16-dniowych
zarodków szczura lub myszy

Tkanka nerwowa może pochodzić także ze

starszych zarodków, ale będzie ona już
bardziej „zanieczyszczona” astrocytami

hipokamp

Hodowle wzbogacone w neurony piramidowe

hipokampa (85-90% komórek) są
prowadzone najczęściej na materiale
pobieranym z 18-dniowych zarodków.

W celu uzyskania hodowli wzbogaconej w

neurony zakrętu zębatego potrzebną
strukturę mózgu izoluje się z noworodków
lub kilkudniowych osesków.

Są już doniesienia o wyprowadzeniu hodowli

neuronów z dojrzałego hipokampa.

śródmózgowie

Śródmózgowie izoluje się z 15-16-

dniowych zarodków.

Około 0,5-2,0% wszystkich neuronów w

hodowli będą stanowić neurony
dopaminergiczne.

Neurony ziarniste móżdżku

Neurony ziarniste móżdżku hoduje się

zwykle wykorzystując materiał pochodzący
z 7-8-dniowych osesków szczura lub myszy.

Szczególnym wymaganiem tych komórek

jest duże stężenie jonów potasu. W małym
stężeniu komórki szybko degenerują i
niemal cała hodowla umiera w ciągu
tygodnia.

prążkowie

Komórki prążkowia pobiera się do hodowli z

16-17-dniowych płodów.

Prążkowie oddziela się wówczas bardzo

wyraźnie od kory nowej.

Jego neurony bardzo łatwo przeżywają

początkowy etap hodowli w pożywce
pozbawionej surowicy, podczas gdy
większość komórek glejowych w tym czasie
umiera.

wzgórze

Neurony wzgórza przeżywają najlepiej,

jeśli zostaną pobrane z 15-16-
dniowych zarodków.

Hodowle glejowe

Hodowle glejowe prowadzi się

najczęściej wykorzystując materiał
pochodzący od noworodków lub
kilkudniowych osesków, głównie
dlatego, że w tym czasie liczba
komórek progenitorowych dających
początek astrocytom i
ologodendrocytom jest największa.

astrocyty

Materiał do hodowli astrocytów może

pochodzić z różnych obszarów mózgu
noworodka szczura.

Hodowle glejowe zakłada się podobnie

jak hodowle neuronów, z tą jednak
różnicą że komórki wysiewa się na
początku w pożywce zawierającej 20-
30% surowicy.

Po około 3-5 dniach hodowli, gdy

komórki glejowe już się namnożą,
można je poddać wytrząsaniu w
temp. 37oC.

W tym czasie astrocyty typu I zostaną

nadal przyczepione do podłoża, zaś
neurony oraz astrocyty typu II i
oligodendrocyty utworzą zawiesinę
komórek.

Hodowle macierzystych

komórek nerwowych

Zgodnie z istniejąca wiedzą, komórki

macierzyste dorosłych ssaków pozostają w
stanie uśpienia, ale zachowują zdolność do
proliferacji i wytwarzania dojrzałych
komórek mogących zastąpić uszkodzona
tkankę.

Macierzyste komórki nerwowe w obszarze

hipokampa i opuszek węchowych mogą się
przekształcić w trzy podstawowe rodzaje
komórek OUN: NEURONY, ASTROCYTY I
OLIGODENDROCYTY.

Proliferacja macierzystych komórek

nerwowych może być stymulowana
przez:



IGF-I (insulinopodobny czynnik wzrostu)



TGF-alfa (transformujacy czynnik wzrostu
alfa)



bFGF (zasadowy czynnik wzrostu
fibroblastów)

Na różnicowanie komórek

macierzystych może wpływać:



FGF czy EGF (epidermalny czynnik
wzrostu)

Grzebień nerwowy

Większość dotychczasowych badan nad

macierzystymi komórkami nerwowymi
ssaków przeprowadzano na komórkach
grzebienia nerwowego wyprowadzonych z
9-dniowych zarodów myszy.

Wykorzystano tu bowiem fakt, że na tym

etapie rozwoju komórki te jeszcze nie
migrują, lecz pozostają w grzbietowej
części cewki nerwowej.