Wykład 1

Temat: Zastosowanie inżynierii genetycznej w hodowli zwierząt.

1. MOET multiple ovulation and embryo transfer

metoda wykorzystywana w hodowli bydła, samice stymuluje się hormonalnie do wielokrotnej owulacji. W jednej owulacji dojrzewa kilka do kilkunastu pęcherzyków. Po 2-3 dniach od zapłodnienia wypłukujemy z układu rozrodczego zarodki. Zarodki takie można zamrozić w krioosłonie lub bezpośrednio po pobraniu wstrzyknąć do matek zastępczych.

2. Identyfikacja genów głównych,

3. Testy molekularne,

4. Mapowanie i klonowanie genów,

5. Inżynieria komórkowa,

6. Inżynieria zarodków i gamet

7. Klonowanie zwierząt,

8. Trans geneza.

Genetyczna modyfikacja organizmów zwierzęcych w celu wykorzystywania ich organów do ksenotransplantologii.

Diagnostyka molekularna wad rozwojowych i chorób genetycznych zwierząt gospodarskich- charakterystyka, podłoże genetyczne, identyfikacja nosicieli, modele zwierzęce.

Fenokopia

Wada rozwojowa nie mająca podłoża genetycznego, ale jest wynikiem środowiska wewnątrz macicy istniejącego w okresie embrio- i organogenezy.

Trudność w wykrywaniu nosicieli autosomalnych genów recesywnych.

Całkowita eliminacja z populacji genów letalnych czy semiletalnych o nierozpoznanej strukturze molekularnej jest niemożliwa.

Zapobieganie chorobom genetycznym:

1. niedopuszczenie do kojarzeń krewniaczych,

2. rejestracja wszystkich przypadków urodzeń zwierząt z wadami rozwojowymi umożliwia eliminację nosicieli (zwłaszcza płci męskiej) i informuje o częstości występowania określonych wad.

Choroby monogenowe

wady uwarunkowane genem dominującym autosomalnym

Nazwa schorzenia	gatunek
epilepsja	bydło
brak owłosienia	psy (są heterozygotami)
wielopalczastość	cecha rasowa kur ras handan, silkie, dorking

Wady uwarunkowane genem niezupełnie dominującym autosomalnym

nazwa schorzenia	gatunek
achondroplazja	bydło rasy dexter
krótkonożnosć	cech rasowa kur ras creeper, scot dumpies, japońskich bantamek
wodogłowie wenętrzne	cecha rasowa kur polskie czubatki i handan, kaczki rasy crested white

Achondroplazja (krótkonożność u kur)

wada wywołana genem cp (ang. creeper czyli pełzacz)

1. gen cp jest letalny u większości homozygot między 3 a 4 dniem inkubacji jaj

2. osobniki heterozygotyczne mają skrócone odnoża.

Achondroplazja (chondrodystrofia)

zahamowanie rozwoju układu kostnego

1. osobniki homozygotyczne ulegają poronieniom zwykle przed 8 miesiącem

2. u heterozygot występuje skrócenie kończyn.

Wodogłowie wewnętrzne występuje u bydła, świń i drobiu

1. schorzenie spowodowane nadmiarem płynu nagromadzonego w komorach mózgowia lub w przestrzeniach między oponą pajęczą i miękką,

2. cielęta dotknięte wodogłowiem rodzą się zazwyczaj żywe wykazują powiększenie czaszki ale nie potrafią utrzymać się na nogach i giną w ciągu 2 dni,

3. u świń warunkujący wadę gen wykazuje działanie plejotropowe - wpływa także na rozjaśnienie umaszczenia, prosięta padają do drugiego dnia życia,

4. gen Cr -crest nie wywołuje u drobiu skutków letalnych,

5. kaczki crested white osobniki homozygotyczne giną, heterozygoty mają czub pod którym czaszka jest silnie wysklepiona.

Mutacja w genie FGFR3 (receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów) zespół pajęczy

1. występuje u owiec 700 pozycja DNA,

2. w układzie homozygotycznym zmutowany allel powoduje kątową deformację kończyn, deformację kończyn, deformację grzbietu i żeber, mostka oraz części pyskowej - garbaty nos,

3. u heterozygot występuje delikatna budowa kośćca z wyraźnym wydłużeniem kości długich,

4. mutacja genu receptora czynnika wzrostu fibroblastów tranzycja G do A lub trans wersja G do C; konsekwencją zmian jest zamiana glicyny na argininę w pozycji 380 aminokwasowej białka,

5. białko FGFR zlokalizowane jest w błonie komórkowej. W receptorze wyróżnia się 3 domeny, w części transbłonowej domena liofilowa, a w części cytoplazmatycznej - domeny kinazy tyrozynowej,

6. mutacja dotyczy części transbłonowej.

Wady uwarunkowane genem recesywnym autosomalnym

Nazwa wady	Gatunek
achondroplazja	bydło
amputacja kończyn	bydło, owce, świnie
bezmózgowie	bydło, owce, świnie
brak owłosienia	bydło, króliki, koty, zwierzęta laboratoryjne
brak żuchwy	bydło, owce, świnie
karłowatość	bydło rasy mięsne
porfiria	bydło, u świń cecha dominująca
rybia łuska	bydło
miejscowy brak naskórka	bydło jersey i ayrshire
BLAD	bydło
DUMPS	bydło

Achondroplazja

1. wada występująca u ras mięsnych prosta cech recesywna,

2. osobniki heterozygotyczne charakteryzują się nieznacznym skróceniem kończy n co wpływa pośrednio na zwięzłość budowy,

3. osobniki homozygotyczne mają zazwyczaj wypukłe czoło, niproporcjonalnie krótką szeroką głowę oraz nieprawidłowy układ szczęk, są mało żywotne.

Amputacja kończyn (akrotericena)

1. wada występuje u większości ras bydła, owiec i świń; występuje także u ludzi,

2. u osobników dotkniętych wadą kończyny kończą się blisko stawu łokciowego, pęcinowego lub kolanowego,

3. schorzeniu towarzyszy: skrócenie żuchwy, rozdwojenie podniebienia, brak większości zębów.

Wykład 4

Temat: Choroby genetyczne c.d . Tkanka tłuszczowa, otyłość.

BLAD

Cząsteczka integryny składa się z dwóch jednostek α i β. W skład jednostki β wchodzi podjednostka CD 18 kodowana przez gen ITGB2.

Mutacja w genie kodującym podjednostkę CD 18 β2 - integryny (ITGB2) tranzycja A-G w pozycji 383 DNA zmieniając kwas asparaginowy do glicyny 128 aminokwas.

Integracja β2 integryny z cząsteczkami śródbłonka międzykomórkowego powoduje adhezję co prowadzi do uwolnienia neutrofili.

Efekt fenotypowy mutacji

Zaburzenia adhezji cząsteczek β2 integryny na leukocytach; neutrofile traca zdolność wnikania do tkanek i niszczenia patogenów. W konsekwencji zwierzęta obciążone mutacją w formie homozygotycznej zapadają na powtarzające się infekcje, dożywają 10-14 miesięcy.

Objawy:

1.infekcje bakteryjne,

2.owrzodzenia wewnątrz i wokół pyska,

3.biegunki,

4.infekcje układu oddechowego,

5.zapalenie dziąseł ze stratą zębów,

6. niska masa ciała stanowiąca 60% normy.

Częstość występowania i sprzężenie genetyczne

Częstość występowania BLAD zróżnicowana. U bydła HF w USA na początku lat 90. Wynosiła u buhajów 15%. W Polsce dotychczas opisano pojedyncze przypadki. Geny korzystnych cech ilościowych są istotnie sprzężone z genem ITGB2. Osobniki heterozygotyczne (nosiciele BLAD) cechuje wysoka wartość wyhodowania.

Rybia łuska

Letalna wada dziedziczna dziedzicząca się w sposób autosomalny recesywny. Powstaje w wyniku wytworzenia nadmiernej ilości keratyny i w następstwie - nieprawidłowego rogowacenia naskórka. Skóra cieląt składa się z rogowych płytek przypominających duże łuski, płytki te SA rozdzielone rowkami, w których rosną włosy.

Porfiria

Choroba rozwija się jako skutek niedoboru enzymu katalizującego trzeci etap biosyntezy czerwonego barwnika, którym jest porfiryna. Enzymem tym jest dekarboksylaza uroporfirynogenu, która katalizuje przejście uroporfirynogenu III do kaproporfirynogenu II. Skutkiem niedoboru enzymu jest nadmiar metabolitów pośrednich będących produktem etapów wcześniejszych. Odkładają się one we krwi, kościach, zębach oraz innych częściach ciała. Zęby przybierają różowe zabarwienie. W czerwonobrunatnym moczu występuje uroporfiryna. Pojawia się nadwrażliwość na światło. Zwierzęta chore stają aktywne nocą, unikają natomiast światła dziennego.

Porfiryny eksponowane na światło przechodzą w stan zbudzenia i reagują z tlenem cząsteczkowym wytwarzają w ten sposób rodnikowe formy tlenu, które uszkadzają lizosomy i inne organelle komórkowe. Uwolnione z nich enzymy powodują zmiany skórne - tworzą się pęcherze przechodzące w głębokie owrzodzenia, a następnie w obszerne blizny.

DUMPS

Schorzenie letalne wywołane niedoborem enzymu zaangażowanego w proces syntezy pirymidyn, za które odpowiedzialna jest mutacja punktowa w genie kodującym syntezę urydunomonofosforanową (UMPS). Enzym katalizuje ostatni etap syntezy urydynomonofosforanu powodując konwersję kwasu octowego do urydyno-5`-monofosforanu. Niedobór aktywnej formy enzymu jest przyczyną nieprawidłowej syntezy DNA i RNA co przejawia się:

- megablastozą czyli przerostem komórek najczęściej erytrocytów,

- rozrostem układu erytroblastycznego,

- nieprawidłowym funkcjonowaniem układu nerwowego.

Homozygoty pod względem zmutowanego allelu zamierają ok. 40 dnia ciąży. U heterozygot aktywność tego enzymu w różnych tkankach jest o połowę mniejsza. W mleku i moczu takich osobników rejestruje się zwiększone stężenie kwasu orotowego. Fenotypowe heterozygoty są prawidłowo rozwinięte. Heterozygoty charakteryzuje wyższa wydajność w porównaniu z homozygotami bez mutacji.

Za objawy DUMPS odpowiedzialna jest mutacja w genie UMPS, który składa się z 1869 pz, a mianowicie tranzycja C-T w 405 kodonie, powodując przedwczesne pojawienie się kodonu STOP. W prawidłowym produkcie białkowym UMPS w pozycji 405 występuje arginina. Efekt mutacji to całkowity brak aktywności biologicznej syntazy urydynomonofosforanowej.

Tkanka tłuszczowa jest zaliczana do grupy tkanek łącznych właściwych. Występuje u ssaków w dwóch postaciach jako:

- tkanka tłuszczowa żółta,

-tkanka tłuszczowa brunatna.

Komórkami tkanki tłuszczowej są adipocyty, powstające w procesie ADIPOGENEZY.

Etapy powstawania tkanki tłuszczowej:

1. puripotencjalna zarodkowa linia komórkowa,

2. mezynchymalna, multipotencjalna linia prekursorowa,

3. preadipocyty linia komórek, które rozpoczynają różnicowanie w kierunku dojrzałych adipocytów,

4. dojrzałe adipocyty.

W skład tkanki tłuszczowej żółtej wchodzą:

- preadipocyty,

- fibroblasty,

- limfocyty,

- granulocyty,

- komórki tuczne,

-makrofagi.

W tkance tłuszczowej przebiegają naczynia krwionośne. Komórki tłuszczowej żółtej mają zazwyczaj kształt wieloboczny. Czasami przy mniejszym upakowaniu w tkance mogą przybierać kształt kolisty. Średnica komórek tłuszczowych żółtych zmienia się w zakresie 25-200 μm. Jądro komórki leży obwodowo i ma zazwyczaj spłaszczony kształt. Otoczone są bezstrukturalną błoną podstawową. Nie są unerwione.

Wykład 5 (c.d wykładu 4)

Pojedyncza komórka tłuszczowa żółta zawiera zazwyczaj jedna kroplę tłuszczu stanowiącą ok. 60-90% jej objętości. Komórki tłuszczowe żółte zgrupowane są w tkance tłuszczowej w zraziki otoczone przez warstwę tkanki tłuszczowej włóknistej. Poszczególne komórki tłuszczowe otoczone są siateczką włókien retikulinowych. Do wnętrza zrazików wnikają naczynia włosowate

Preadipocyty

Mają morfologię fibroblastów. Charakteryzują się zdolnością proliferacji. W wyniku ich podziałów i różnicowania liczba komórek tłuszczowych może wzrastać. Jest to u ssaków proces fizjologiczny w pierwszych tygodniach życia i w okresie dojrzewania płciowego. Różnicowanie komórek tłuszczowych z ich prekursorów jest procesem skomplikowanym i związane jest z zasadniczymi zmianami ich budowy i składu biochemicznego. Proces ten przejawia się zwiększeniem intensywności lipogenezy de novo , a także wzrostem poziomu mRNA dla białek bezpośrednio związanych z metabolizmem lipidów oraz produktów genów specyficznych dla adipocytów. Zmiany na poziomie molekularnym powodują zmiany kształtu komórki, składników cytoszkieletu oraz rodzaju macierzy zewnątrzkomórkowej.

Prawidłowy przebieg adipogenezy zależy przede wszystkim od działania czynników transkrypcyjnych aktywujących ekspresję genów specyficznych dla tkanki tłuszczowej. Są to następujące białka:

- C/EBP - C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ, C/EBPζ

- PPAR - PPARγ, PPARδ

- GATA - GATA-2, GATA-3

-CREB

-ADD1/SREBp1

- c-fos wewnątrzkomórkowy regulator różnicowania, białkowy produkt onkogenu

- CREB miejsce jego przyłączania zlokalizowano m. in w promotorze genu leptyny.

Tkanka tłuszczowa brunatna

Ma niemal identyczną budowę u wszystkich ssaków. Komórki tej tkanki zgrupowane są w zraziki, te z kolei tworzą zrazy. Zraziki i zrazy otoczone są tkanką łączną włóknistą widoczną w skrawkach histologicznych w postaci pasm. W pasmach widoczne są naczynia żylne i tetnicze, pęczki włókien nerwowych bezmielinowych, a także komórki tłuszczowe żółte. Kolor brunatny tkanki spowodowany jest obecnością cytochromów, zlokalizowanych w bardzo licznych mitochondriach. Komórki tłuszczowe brunatne, główny komponent tkanki tłuszczowej brunatnej, mają postać wielopęcherzykową - zamiast jednej występuje w nich kilkanaście kropel tłuszczowych. Jądro kształtu kulistego jest położone w centralnej części komórki. W cytoplazmie krople tłuszczowe rozmieszczone są dosyć równomiernie mają tendencję do sąsiadowania z licznymi mitochondriami. Tkanka tłuszczowa brunatna wraz z dojrzewaniem somatycznym przekształca się w tkankę tłuszczową żółtą. Zwykle stanowi nie więcej 1% masy ciała.

Już w 1953 roku zaproponowany został tzw. model lipostatyczny, w myśl którego istnieje regulacja pobierania pokarmu przez organizm. Zakładał on, że proporcjonalnie do ilości zmagazynowanego tłuszczu generowany jest sygnał, który poprzez oddziaływanie na właściwe regiony mózgu, odpowiada za ograniczenia ilości pobieranego pokarmu.

Szczegółowe badania funkcjonowania tego modelu stały się możliwe wraz z uzyskaniem dwóch szczepów myszy, u których otyłość była uwarunkowana przez geny recesywne: ob. (tzw. myszy ob/ob) i ab (myszy ab/ab). Doświadczenie przeprowadzone na myszach posłużyły jako model przebiegu otyłości u innych gatunków ssaków, z człowiekiem łącznie. Pierwsze doświadczenia przeprowadzone na myszach o prawidłowej masie ciała, które połączono parabiotycznie. Po uszkodzeniu podwzgórza jednej z myszy stwierdzono u niej znacznego stopnia otyłość, natomiast druga mysz przestała jeść i straciła na wadze, a zmiana ta była spowodowana utratą białka i tłuszczu. Mysz z uszkodzonym podwzgórzem spożywała nadmierne ilości pokarmu i wydzielała jednocześnie do krwi znaczne ilości leptyny, która działając na podwzgórze partnera spowodowała u niego zahamowanie spożycia pokarmu, prowadząc ostatecznie do nadmiernego wychudzenia. Zwierzę z uszkodzonym podwzgórzem nie reagowało na leptynę, spożywało nadmierne ilości pokarmu i stale przybywało na wadze. Uszkodzenie podwzgórza chudemu zwierzęciu spowodowało szybki przyrost masy ciała. Wyniki doświadczenia wskazały, że do krwi zwierząt wydzielana jest lektyna, kontrolująca spożycie pokarmu, ale decydującą rolę w tej kontroli pełni podwzgórze. W kolejnych doświadczeniach wykorzystywano już myszy z dwóch różnych otyłych szczepów, które parabiotycznie połączono z osobnikami o prawidłowej masie ciała.

Mysz db/db + mysz normal = mysz db/db + mysz normal

Myszy db/db syntetyzują znaczne ilości leptyny, hamującej łaknienie u myszy kontrolnej (normal) same zaś nie są na lektynę wrażliwe.

Parabioza myszy ob/ob z myszami o prawidłowej masie ciała (normal) spowodowała zahamowanie przyrostu masy ciała u myszy otyłej

Mysz ob/ob + mysz normal = mysz ob/ob + mysz normal

Myszy ob/ob nie syntetyzują leptyny powodującej zahamowanie nadmiernego łaknienia, ale są na nie wrażliwe, wobec czego lektyna produkowana przez mysz kontrolną, spowodowała spadek masy ciała u myszy otyłej. Parabiotyczne połączenie otyłych myszy ob/ob z otyłymi myszami db/db spowodowało spadek masy ciała jedynie u myszy ob/ob , natomiast myszy db/db pozostały nadal otyłe.

Otyłość u zwierząt może być spowodowana zarówno brakiem leptyny, jak i jej nieprawidłową budową, a także nieprawidłową budową receptora dla leptyny, który ulega represji w podwzgórzu.

Leptyna

Leptyna (gr. leptos -mały, delikatny, cienki) jest białkiem o masie cząsteczkowej rzędu 16 kDa wykazującym wysoki stopień międzygatunkowej homologii. Zbudowana jest ze 167 aminokwasów ale w osoczu występuje już jako cząsteczka złożona ze 146 aminokwasów, gdyż zostaje od niej oddzielony sygnałowy odcinek wydzielniczy. Leptyna ma właściwości hormonu o czasie półtrwania w krwiobiegu wynoszącym 25 minut. W osoczu jest wiązana kom petycyjnie z białkami, które mogą zmieniać jej bioaktywność i biodostępność. Synteza leptyny zachodzi przede wszystkim w adipocytach oraz w mniejszym stopniu w mózgu, sercu, łożysku i ścianie żołądka. Po wydzieleniu do krwi leptyna jest transportowana do podwzgórza. W podwzgórzu leptyna wiąże się ze specyficznym dla niej receptorem i powoduje jego dimeryzację i utworzenie właściwej dla jego aktywności konformacji. Konsekwencją tego jest zahamowanie biosyntezy i uwolnienie neuropeptydu Y oraz peptydu pokrewnego aguti. Jednocześnie następuje wzrost stężenia propiomelanokortyny i tran skryptu regulowanego kokainą i amfetaminą.

Struktura genu LEP u ssaków:

- ekson 1 w całości wchodzi w skład regionu 5'-UTR,

- region kodujący jest zawarty w eksonach 2 i częściowo 3.

Ekspresja genu leptyny

Poziom ekspresji genu leptyny zależny jest od wielu czynników genetycznych, hormonalnych i dietetycznych. Ekspresja genu leptyny w tkance tłuszczowej jest różna i zależna od jej lokalizacji w organizmie oraz płci. U szczurów w adipocytach samic stwierdza się przeszło dwukrotnie więcej tran skryptów mRNA LEP w tłuszczu podskórnym, niż w tłuszczu okołonerkowym, natomiast u samic nie stwierdzono podobnej zmienności. U samic generalnie stwierdzono większy poziom ekspresji genu LEP niż u samców.

U ludzi obserwuje się znacznie wyższe stężenie mRNA LEP w tłuszczu podskórnym niż w tłuszczu sieciowym. Różnice te widoczne są szczególnie u kobiet, u których ilość tran skryptów LEP była znacznie wyższa niż u mężczyzn. Ilość tran skryptów LEP jest proporcjonalna do wielkości adipocytów i rośnie wraz ze zwiększającym się poziomem tłuszczu w organizmie. Stężenie mRNA w tkance tłuszczowej wykazuje zmiany dobowe. W mechanizmie działania leptyny najistotniejszą rolę odgrywają specyficzne dla niej receptory. Receptor dla leptyny (OB-R, LEPR) zaliczany jest do rodziny klasy I receptorów dla cytokin. Znany jest tylko jeden gen kodujący receptor leptyny, ale w wyniku alternatywnego składania tran skryptu powstają różne izoformy jego białkowego produktu. Dotychczas zidentyfikowano 6 funkcjonalnych lizoform receptora leptyny: Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc, OB-Rd, Ob-Rd, Ob-Rf.

Ludzki gen dla receptoraleptyny

- 20 eksonów,

- 816 aminokwasów w domenie zewnątrzkomórkowej.

Ob-Ra krótki receptor dla leptyny posiada 34 aminokwasową domenę cytoplazmatyczną. Zlokalizowany jest przede wszystkim w splocie naczyniowym mózgu, ekspresji także w niewielkich ilościach ulega w jądrach i tkance tłuszczowej. Prawdopodobnie uczestniczy w transporcie leptyny z krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego (bariera krew - mózg).

Ob-Rb długi receptor dla leptyny posiada aminokwasową domenę cytoplazmatyczną długości 304 aminokwasów. Uczestniczy w przekazywaniu pobudzenia wewnątrz komórki. W największych ilościach jest wykrywany w jądrze łukowatym podwzgórza oraz w innych okolicach mózgu, biorących udział w regulacji bilansu energetycznego.

Ob-Rc krótki receptor dla leptyny wewnątrzkomórkowa domena złożona jest z 32 aminokwasów. Pełni funkcję transportową.

Ob.-Re najkrótsza forma receptora dla leptyny jest pozbawiony domeny transbłonowej. Jego łączna długość to 808 aminokwasów. Receptor uważany za formę rozpuszczalną biorącą udział w przyłączaniu i inaktywacji leptyny w krwiobiegu. Ulega ekspresji w podwzgórzu, sercu, jądrach, tkance tłuszczowej.

Domena zewnątrzkomórkowa ma dwa konserwatywne motywy Trp-Ser-X-Trp-Ser

BOX 1 konserwatywny rejon, który zawiera wszystkie izoformy receptorów, poza Re.

BOX 2 występuje tylko w długich formach receptora pomiędzy 50 a 60 aminokwasem domeny cytoplazmatycznej.

BOX 1 i BOX 2 są miejscami niezbędnymi do oddziaływania i aktywacji kinaz Jak, fosforyzujących tyrozynę w pozycji 138.

Jak i STAT są cytoplazmatycznymi czynnikami transkrypcyjnymi biorącymi udział w przekazywaniu sygnału z receptora do wnętrza komórki i aktywacji genów docelowych.

Połączenie leptyny z receptorem błonowym jest pierwszym krokiem zapoczątkowującym jej działanie na metabolizm na poziomie komórkowym. W sytuacji niedoboru lub braku jednego z tych elementów działanie hormonu na tkanki jest mocno osłabione lub całkowicie zniesione. Lektyna po wydzieleniu do krwiobiegu wiąże się kom petycyjnie ze specyficznymi białkami wiążącymi i dalej jest transportowana do podwzgórza.

Efekty działania w podwzgórzu zależą od bardzo wielu czynników wśród których jednym z istotniejszych jest poziom ekspresji genu kodującego receptor dla leptyny w podwzgórzu.

Zwierzęta i osoby otyłe charakteryzują się z reguły wyższym poziomem krążącej leptyny, a wraz z utratą masy ciała dochodzi do mniejszego wydzielania hormonu z tkanki tłuszczowej. Dlatego też leptynie przypisuje się kluczową rolę w skłonności ssaków do pobierania pokarmu i gromadzenie tkanki tłuszczowej.

Wykład 6

Temat: Struktura, ekspresja i inżynieria genów odpowiedzialnych za miogenezę u zwierząt gospodarskich.

Biochemiczne podstawy biogenezy. Budowa i powstawanie tkanki mięśniowej.

Włókno mięśniowe:

- długość od kilku do kilkudziesięciu centymetrów,

- jądra komórkowe,

- sarkolemma,

- średnica 10-100 μm.

Włókno mięśniowe poprzecznie prążkowane zawiera znaczną liczbę jąder komórkowych, co jest wynikiem fuzji kilku komórek jednojądrzastych. Typowym miejscem występowania jąder komórkowych w dojrzałym włóknie mięśniowym jest sarkoplazma na obwodzie włókna w pobliżu sarkolemmy; są one wydłużone równoległe do długiej osi włókna; jądra te nie mają zdolności proliferacyjnych.

Wnętrze włókna mięśniowego wypełniają miofilamenty biegnące przez całą długość komórki przymocowane do sarkolemmy w rejonie biegunowym włókna. Średnica tych włókien wynosi 1-2 μm. Wśród miofilamentów wyróżniamy wyróżniamy miofilamenty cienkie (aktynowe) i miofilamenty grube (miozynowe).

Sarkomer jest strukturalną jednostką włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych; pojedynczy ma długość ok. 2,5 μm. Wiele sarkomerów ułożonych jeden za drugim tworzy włókienko mięśniowe, składające się z kilkuset do kilku tysięcy sarkomerów, w zależności od długości włókna. Sarkomer składa się z kilku drobniejszych odcinków zwanych krążkami; poszczególne krążki leżą na tych samych poziomach co odpowiednie krążki sarkomerów włókien sąsiednich, co powoduje występowanie charakterystycznego poprzecznego prążkowania.

Komórki satelitowe mięśniowe

Biorą udział we wzroście włókien mięśniowych dzięki zdolności ich jąder do replikacji i proliferacji. Umieszczone są na obwodzie włókien, wewnątrz otoczki utworzonej przez błonę podstawną i sarkolemmę. Po podziale mitotycznym powstają dwie komórki potomne, z których jedna ulega włączeniu do włókna mięśniowego, a druga nadal pozostaje komórką satelitarną, zachowując położenie i zdolności do proliferacji. W mięśniach młodych osobników stanowią 2% ogólnej liczby jąder komórkowych włókiem mięśniowych. Proces podziału komórek satelitarnych zachodzi w okresie wzrostu mięśni szkieletowych oraz pod wpływem treningów u osób dorosłych. Komórki satelitarne są jednojądrzaste i zawierają niewiele cytoplazmy. Nie zawierają włókien poprzecznie prążkowanych. Zdolność do proliferacji oraz cechy budowy upodobniają te komórki do sarkoblastów. Przypuszcza się, że komórka satelitowa jest tym sarkoblastem z okresu embriogenezy, który nie uległ fuzji w przebiegu tworzenia się włókna poprzecznie prążkowanego.

Różnicowanie tkanki mięśniowej

sarkoblasty

najwcześniejsza forma komórki mięśniowej jest SARKOBLAST (mioblast pierwotny)

mioblasty kolejnym pokoleniem są MIOBLASTY wykazują już pierwsze oznaki różnicowania, nie mają już właściwości komórek satelitarnych,

proliferacja

mioblasty generacja mioblastów bez zdolności podziałowych tzw. mioblasty postmitotyczne,

mikrotubule fuzja mioblastów w wielojądrzaste komórki powoduje powstanie tubul mięśniowych czyli miotubul, synteza miozyny.

Warunkiem fuzji mioblastów w tubule mięśniowe jest proces związany ze zmianą składu chemicznego błony komórkowej. W tubulach mięśniowych zachodzi intensywna synteza białek tworzących miofilamenty. W ten sposób tubule organizują się we włókna mięśniowe o budowie sarkomerowej. Wykazują poprzeczne prążkowanie charakterystyczne dla dojrzałego włókna mięśniowego, różnią się jednak od tych ostatnich mniejszą średnicą oraz centralnym ułożeniem jąder komórkowych.

Dojrzewanie tubul mięśniowych

- wzrost średnicy komórek,

- przesuwanie jąder komórkowych z centrum w pobliże sarolemmy,

- wypełnianie wnętrza komórki przez aparat kurczliwy,

- wytwarzanie błony podstawnej.

Tubule mięśniowe dojrzewają asymetrycznie na swojej długości przez co mają różną średnicę w różnych miejscach.

Molekularna regulacja procesu miogenezy

- miogenina jeden z podstawowych białkowych czynników regulujących geny zaangażowane w różnicowanie tkanki mięśniowej szkieletowej.

Cząsteczki miogeniny łączą się ze specyficznym regionem DNA i indukują transkrypcję genów kontrolujących biogenezę. W warunkach in vitro wpływom miogeniny podlegają rozmaite kategorie komórek, które bez tego czynnika transkrypcyjnego nie mogą różnicować się w mięśnie. Doświadczenia na myszach wykazały, że heterogeniczne osobniki ze zmutowanym allelem tego genu kojarzone ze sobą dawały w efekcie 25% potomstwa z ostrymi objawami niedorozwoju mięśni szkieletowych i były to skutki letalne (zgodnie z prawami Mendla musiały mieć zmutowane oba allele).

Dokładne mechanizmy działania biogenezy na poziomie molekularnym nie zostały jak dotąd dokładnie wyjaśnione. Wiadomo jednak, że podczas prawidłowej biogenezy, migenina indukuje geny niezbędne do ostatecznego różnicowania mioblastów, nie wpływa jednak na ich zdolność do proliferacji ani na ich migrację poprzedzającą różnicowanie.

MyoD z doświadczeń przeprowadzonych w warunkach in vitro oraz na myszach knockout (ukierunkowana mutacja Myf-5/MyoD) jednoznacznie wynika, że białko to indukujące miogenezę w formie nieaktywnej biologicznie powoduje u myszy przedwczesną śmierć lub martwe porody co wynika z całkowitej nieobecności mięśni szkieletowych, a to prawdopodobnie może być spowodowane brakiem ekspresji desminy, za którą czynnik jest bezpośrednio odpowiedzialny. Badania in vivo nie potwierdziły jednak jednoznacznie zasadniczego wpływu MyoD na rozwój i różnicowanie mięśni szkieletowych, podobnie jak badania na myszach z unieczynnionym tylko czynnikiem MyoD.

Indukcja miogenezy w komórkach nie będących mięśniowymi

Fibroblasty wyhodowane z komórek kosmówki

Transfer genu MyoD za pośrednictwem wirusów

Różnicowanie w komórki mięśniowe

Kolejny etap różnicowania - powstanie wielojądrzastych miotubul

Brak ekspresji genów typowych dla komórek mięśniowych

Ekspresja genów wczesnej miogenezy desmina

Ekspresja genów późnej biogenezy titina, miozyna, dystrofina.

Desmina polipeptyd o masie 53 kDa ulegający ekspresji w komórkach mięśni gładkich, szkieletowych i w komórkach mięśnia sercowego; bierze udział we wczesnych etapach różnicowania mięśni, a mianowicie w fuzji mioblastów oraz formowaniu się miofilamentów (mifibrylogenezie) przy zmutowanej formie białka następuje prawidłowy rozwój, ale dochodzi do nieprawidłowego różnicowania mięśni gładkich, szkieletowych i mięśnia sercowego oraz degeneracji miofibryli.

Titina białko o masie 3 MDa jeden z głównych składników sarkomerów w mięśniach kręgowców, pełni wiele funkcji m.in. kontroluje montaż fi lamentów grubych (miozynowych)

Miostaytna pierwsze doświadczenie wykazujące na udział miostatyny w rozwoju mięśni szkieletowych przeprowadzono na myszach z ukierunkowaną mutacją genu Gdf-8. Ma ścisły związek ze zwiększeniem liczby komórek mięśniowych (hiperplazja) jak i zwiększeniem średnicy włókien (hipertrofia).

Przerost masy mięśniowej u bydła wynika z większej liczby włókien mięśniowych, w mniejszym stopniu z większej średnicy indywidualnych włókien. Najpełniej umięśnioną rasą bydła jest Belgian Blue, Piemontese, charakteryzujące się powszechnie zwany “podwójnym umięśnieniem” przy czym jest to cecha dziedzicząca się zgodnie z prawem Mendla.

Mutacje genu Gdf-8

- delecja 11 nukleotydów, która zmienia ramkę odczytu i jednocześnie powoduje przedwczesne pojawienie się kodonu STOP co ostatecznie prowadzi do utraty 3 aminokwasów (w pozycji 275, 276, 277) oraz braku aktywności biologicznej domeny karboksylowej białka, które w efekcie nie może spełniać swoich funkcji fizjologicznych. Mutacja dotyczy eksonu 3.

- substytucja (ekson 2) kodon 204 powodująca przedwczesne pojawienie się kodonu STOP.

Miostatyna w rozwijających się komórkach działa w tym samym czasie co miogenina. Swoje funkcje pełni za pośrednictwem białka p21, które jest inhibitorem kinaz cyklino zależnych, zasocjowanych z odpowiednimi cyklinami. Zasadnicza funkcja - programowe tłumienie fosforylacji białka Rb, a co się z tym wiąże obniżenie aktywności mitotycznej komórek przez zatrzymanie cyklu komórek w fazie G1.

Nieczynna biologicznie miostatyna

Brak aktywnej miostatyny przekłada się bezpośrednio na brak białka p21, będącego inhibitorem kinaz cyklino zależnych wobec czego dochodzi do nadmiernej ich aktywności oraz nadmiernej fosforylacji białka Rb i nadmiernej proliferacji mioblastów. To z kolei przekłada się na nadmierną liczbę tubul mięśniowych, z których w życiu płodowym rozwijają się włókna mięśniowe.

Charakterystyka zwierząt z podwójnym umięśnieniem

- masa mięśni zwiększa się o 20-50%,

- mniejsza zawartość tłuszczu międzymięśniowego i tkanki łącznej,

- większy udział wartościowych wyrębów,

- wyższa wydajność rzeźna wynikająca z mniejszego udziału kości w stosunku do mięsa,

- znaczna kruchość mięsa wynikająca z mniejszego udziału tkanki łącznej i mniejszej średnicy włókien mięśniowych.

Ujemny wpływ

- obniżenie płodności,

- niższa przeżywalność cieląt,

- opóźnienie procesu dojrzewania płciowego,

- częste poronienia i ciężkie porody,

- nadmierne powiększenie języka i serca u noworodków, skutkujące zaburzeniami czynnościowymi układu oddechowego i krwionośnego.

Wykład 7

Temat: Determinacja płci u ssaków. Anomalie rozwojowe płci, podłoże genetyczne.

Płeć chromosomowa

Płeć genetyczna (w chromosomie Y gen SRY)

Płeć gonadalna

Płeć podwzgórza ( formuje się u ssaków pod koniec ostatniego trymestru ciąży)

Płeć metrykalna Płeć psychiczna

Zespół Klinefeltera

- wyższy wzrost niż przeciętnie dla populacji,

-nieproporcjonalnie długie ramiona i nogi,

-bezpłodność wynikająca z atrofii kanalików nasiennych,

- ginekomastia rozwój gruczołów piersiowych,

- obniżanie IQ.

Zespół Turnera XO

- zamiast gonad pasma tkanki łącznej,

- proporcjonalnie mniejsze rozmiary ciała,

-infantylizm płciowy i nieprawidłowy rozwój jajników,

-klatka piersiowa szeroka o kształcie tarczy,

-trójkątna twarz, małżowiny uszne zwinięte ku tyłowi,

- szeroka szyja z podłużnym fałdem skórnym.

XYY

- ponadprzeciętny wzrost,

-poziom IQ niższy od średniej dla populacji o 10-15 punktów,

- drobne zaburzenia zachowań hiperaktywność, zburzenia umiejętności skupienia uwagi,

- częstość występowania w populacji więźniów płci męskiej 1/30, przy częstości ogólnej dla populacji 1/1000.

Grzebień płciowy zawiązek gonad, w którym zachodzi ekspresja genów LIM 1, WT 1, SF 1.

LIM 1 należy do grupy genów HOMEO-box, które na poziomie molekularnym regulują ontogenezę u wielu gatunków ssaków. Utrata w wyniku mutacji, biologicznej aktywności LIM 1 u myszy jest przyczyną braku zawiązków głowy, co czyni tę mutację jeszcze w bardzo wczesnych etapach rozwojowych letalną. Przypuszcza się, że LIM 1jest zaangażowany w dojrzewanie grzebienia płciowego, chociaż jego rola w indukcji rozwoju gonad nie jest do końca wyjaśniona.

SF 1 czynnik steroidogenny, należący do jądrowych receptorów hormonalnych z rodziny orfanów; produkt genu FT2-F1. Jego ekspresja w grzebieniu płciowym poprzedza u samców pojawienie się pierwszych produktów SRY; czynnik niezbędny do zapewnienia odpowiedniego środowiska dla ekspresji SRY.

Wykład 8 (dokończenie wykładu 7)

WT 1 (Wilms Tumor) niezbędny do rozwoju grzebienia płciowego. Gen WT 1 zawiera kilka miejsc splacingowych, wobec czego powstają cztery izoformy białek WT 1. Wspólną ich cechą jest występowanie motywu palców cynkowych, typowych dla czynników transkrypcyjnych.

Region promotorowy genu SRY posiada miejsce konsensusowi dla wiązania WT 1, a więc jest niezbędny dla stworzenia odpowiedniego środowiska dla ekspresji SRY oraz bezpośredniej regulacji tej ekspresji.

Białko SRY składa się z trzech regionów; najistotniejszy z nich to region centralny - domena HMG, która umożliwia wiązanie i zaginanie DNA w obszarach regulatorowych genów docelowych.

Pierwsze transkrypty mRNA SRY u myszy pojawiają się między 10,5 a 12,5 dniem po zapłodnieniu; u ludzi ok. 44 dpz.

SRY inicjuje proces formowania jąder ale jego obecność nie jest konieczna do utrzymania zachodzących w nich dalszych etapów różnicowania.

SOX 9 gen autosomalny, należący do licznej grupy genów SOX (SRY related HMG box) kodujących białka zawierające domenę HMG podobną do tej, jaka występuje w białku SRY. SOX 9 to czynnik transkrypcyjny posiadający domenę transkrypcyjną oraz wiążącą z DNA.

Pierwsze transkrypty mRNA SOX 9 pojawiają się w prekursorowej linii komórek Sertoliego grzebienia płciowego oraz w tkance mezenchymatycznej, w miejscach jej przekształcania się w chrząstkę. Szczyt ekspresji genu SOX 9 ma miejsce w tym samym czasie co gen SRY. Precyzyjna funkcja SOX 9 nie została precyzyjnie określona, wiadomo jednak, że w szczególnych przypadkach może inicjować rozwój jąder w genetycznych samic XX, a więc pod nieobecność SRY.

Brak ekspresji wynikającej z delecji obszaru regulatorowego genu SOX 9

XX

Nadekspresja, wynikająca z mikroduplikacji regionu z locus SOX 9

XX

DAX 1 zmapowany w chromosomie X; jego duplikacja powoduje rozwój płci żeńskiej u pacjentek z kariotypem 46,XY z czynną funkcjonalnie kopią SRY. Efekt fenotypowy - całkowita rewersja płci, będąca efektem podwojonej dawki genu, dlatego syndrom ten określa się mianem DSS.

Gen dwueksonowy kodujący białko zaliczane do mad rodziny jądrowych receptorów hormonalnych. U myszy gen DAX 1ulega ekspresji w pierwotnej gonadzie ok. 11 dpz u obu płci, po czym następuje zróżnicowanie modelu ekspresyjnego; obniżenie i całkowite zahamowanie u samców (12,5 dpz), a kontynuacja u samic. Początkowo uważano, że DAX 1 może promować determinację jajników, na co wskazywała głównie jego ekspresja w rozwijających się jajnikach, a jej zahamowanie - w jądrach po pojawieniu się pierwszych transkryptów.

WNT 4 gen autosomalny, kodujący glikoproteinową cząsteczkę sygnałową o miejscowej aktywności, należącą do rodziny WNT. Ekspresja WNT 4 zbiega się w czasie z ekspresją DAX 1 u obu płci, ale utrzymuje się tylko w rozwijających się jajnikach podczas gdy w płodowych jądrach jest hamowana przez produkty genu SRY. Ponadto odnotowano ekspresję WNT 4 w mezenchymie, z której w życiu płodowym u obu płci formowane są przez przewody Müllera.

Homozygotyczna dysfunkcja genu WNT 4 u samic prowadzi do maskulinizacji wewnętrznej narządów płciowych - brak struktur wywodzących się z przewodów Müllera przy utrwalonych strukturach wywodzących się z przewodów Woffa.

U samców analogiczna mutacja nie zakłóca prawidłowego przebiegu procesów determinacji i różnicowania płci. Prawdopodobne funkcje białka WNT 4:

1. zapobieganie różnicowania interstycjalnych komórek jajnika w komórki Leydiga,

2. zapoczątkowanie i prawidłowy rozwój przewodów Müllera poprzez oddziaływanie sygnałowe na szlaku nabłonek - mezenchyma,

3. transaktywacja ekspresji DAX 1 ,

4. czynnik antyjądrowy, niezbędny do prawidłowego rozwoju płci żeńskiej.

DMTR 1 i DMTR 2 udział tych czynników w determinacji płci jest najbardziej hipotetyczny, niemniej jednak wskazują na to przypadki rewersji płci u kobiet o kariotypie 46,XY, z delecją dystalnego odcinka ramion krótkich chromosomu 9, w którym zidentyfikowano geny DMTR1 i DMTR2.

Komórki podporowe Sertoliego wydzielają AMH (MIS) hormon glikoproteidowy wymagający obecności swoistych receptorów MISR, AMHR. Zanik, regresja przewodów Müllera.

Komórki śródmiąższowe Leydiga testosteron odpowiedzialny za stabilizację przewodów Woffa rozwój najądrzy, nasieniowodów, części cewki moczowej, wymaga obecności swoistych receptorów AR.

Różnicowanie narządów płciowych samic odbywa się dzięki samoistnej zdolności tkanek przewodów Müllera do przekształcania w drogi wyprowadzające gamety żeńskie - jajowody, rogi macicy i macicę. W rozwoju wewnętrznych narządów płciowych u samic biorą udział żeńskie hormony tkanki matki i ewentualnie hormony wydzielane przez płodowe jajniki, ale ich działanie ma najprawdopodobniej charakter pomocniczy.

DHT: 5α-dihydrosteron powstający z testosteronem w tkankach docelowych in situ z udziałem 5α- reduktazy - rozwój moszny, prącia.

Ośrodki w podwzgórzu

- żeński; nad skrzyżowaniem nerwów wzrokowych, odpowiedzialny jest za cykliczne wydzielanie gonadoliberyn, a więc i gonadotropin,

- męski; umieszczony w jądrze brzuszno - przyśrodkowym i w jądrze łukowatym, odpowiedzialny jest za stałe wydzielanie gonadoliberyn - gonadotropin.

Płeć podwzgórza wytwarza się pod wpływem hormonów wydzielanych w życiu płodowym w tak zwanym krytycznym okresie płciowego różnicowania podwzgórza. Wpływ hormonów płciowych na organizację tkanki nerwowej podwzgórza odbywa się za pośrednictwem estradiolu; jest on wytwarzany in situ na drodze aromatyzacji testosteronu. Efekt determinacji podwzgórza realizuje się w życiu płodowym, ale jest trwały i nieodwracalny.

Podawanie testosteronu samcom, u których doszło do determinacji żeńskiej podwzgórza, w późniejszym okresie, nie znosi tego efektu.

Zaburzenia determinacji i różnicowania płci:

1. nieprawidłowości chromosomów zarodków - w chwili zapłodnienia,

2. nieprawidłowości gametyczne - w chwili rozwoju gonad oraz rozwoju wewnętrznych i zewnętrznych narządów płciowych,

3. nieprawidłowości determinacji płciowej podwzgórza - w chwili dojrzałości płciowej.

Frymartynizm u przeżuwaczy - bydła, owiec i kóz

Zjawisko występuje u samic pochodzących z urodzeń bliźniaczych różnopłciowych, definiowane jako niedorozwój układu rozrodczego samicy prowadzący do trwałej bezpłodności u bydła 90%, u owiec 1-10%, u kóz prawdopodobnie 1%. Bezpośrednią przyczyną frymartynizmu jest powstawanie połączeń naczyniowych (anastomoz) między łożyskami bliźniaczych płodów, różnej płci, połączenie takie sprawia, że związki hormonalne oraz inne czynniki wytwarzane przez płodowe jądra docierają do organizmu samicy i wpływają na maskulinizację układu rozrodczego.

Zakres zaburzeń w kształtowaniu cech płciowych frymartynów zależy od momentu, w którym powstały naczynia i ich połączenie:

1. jeśli do połączeń doszło w okresie różnicowania pierwotnej gonady u zarodka męskiego, to SRY może zakłócać proces kształtowania jajników u osobnika bliźniaczego płci żeńskiej, w takim stopniu że może się rozwinąć gonada męska, a w ślad za tym drogi płciowe będą miały charakter męski,

2. jeśli anastomozy powstaną w chwili gdy jajniki są już ukształtowane, wówczas wydzielany przez jadra czynnik antymüllerowski i testosteron powodują zakłócenia w różnicowaniu dróg wyprowadzających gamety,

3. możliwe jest także powstanie połączeń kiedy przewody Müllera będą już przekształcone w jajowody i macicę; wówczas dihydrotestosteron powstający z wydzielanego przez komórki Leydiga testosteronu może zakłócać proces kształtowania zewnętrznych narządów płciowych,

4. jeśli anastomozy powstaną w czasie determinacji płci podwzgórza, urodzona z samcem samica będzie prawidłowo ukształtowana pod względem cech płciowych, niemniej jednak charakter zachowań płciowych, a także sposób wydzielania gonadoliberyn będzie typowo męskie.

Wykład 9

Wszystkie przypadki, niezależnie od stopnia zakłócenia procesu różnicowania cech płciowych są bezpłodne. Cechy męskiego współbliźniaka są rozwinięte prawidłowo; samce takie mogą być wykorzystane w rozrodzie, ale parametry określające ich przydatność rozpłodową są czasami obniżone.

Diagnostyka frymartynizmu

Analiza łożysk bliźniaczych płodów różnej płci tuż po urodzeniu umożliwiająca bezpośrednią identyfikację połączeń tętniczo - żylnych w łożyszczach (liścieniach). Badania kliniczne samic podejrzanych o frymartynizm - nie zawsze przydatne, zwłaszcza w przypadkach kiedy zewnętrzne narządy są prawidłowo ukształtowane. Badania cytogenetyczne ze względu na wspólną cyrkulację krwi płodu, których łożyska były połączone dochodzi do zagnieżdżenia komórek macierzystych szpiku kostnego samicy w szpiku kostnym samca i odwrotnie. Z tego powodu we krwi frymartynów stwierdza się obecność dwóch linii komórkowych 60, XX i 60, XY.

W identyfikacji chimeryzmu komórkowego można także wykorzystać metody molekularne. Opierają się one na identyfikacji sekwencji typowych dla chromosomu Y w DNA izolowanym z komórek krwi frymartynów. Jeśli takie sekwencje (SRY,AMGL) będą obecne w formie wyraźnego prążka, możemy wnioskować że osobnik jest nosicielem chimeryzmu komórkowego.

Zespół odwróconej płci u koni

Fenotypowe samice mają układ chromosomów 64, XY. Zewnętrzne narządy płciowe o charakterze żeńskim zazwyczaj prawidłowo rozwinięte, ale także zdarzają się przypadki zwierząt z powiększoną łechtaczką.

Interseksualizm bezrogich kóz

Zwierzęta obojnacze (bezrogie homozygoty) mają układ chromosomowy 60, XX a w ich genotypie nie stwierdza się genu SRY. W procesie kształtowania płci u takich osobników występuje zaburzenie zarówno zewnętrznych jak i wewnętrznych struktur, a stopień nasilenia zmian jest bardzo zróżnicowany. Gonady mają zazwyczaj strukturę jąder bez aktywności spermatogenetycznej, czasami jest to ovotestis. Zewnętrzne narządy mogą mieć niemal prawidłowy charakter żeński i wówczas odróżnicowanie takiego obojnaka od prawidłowej samicy jest praktycznie niemożliwe. Czasami stwierdza się zwiększoną odległość między odbytem i sromem lub znaczne powiększenie łechtaczki, które może być przesunięte w kierunku dogłowowym w przypadku takich osobników stosunkowo łatwo udaje się zdiagnozować interseksualizm. Mogą występować także fenotypy o zdecydowanie męskim charakterze zewnętrznych narządów płciowych. Są one czasami trudne do odróżnienia od samców o prawidłowej płci chromosomowej i genetycznej. Usytuowanie gonad może być pachwinowe albo w worku mosznowym.

Sposób postępowania przy diagnozowaniu nieprawidłowego rozwoju płci:

1. ocena kliniczna zewnętrznych / wewnętrznych narządów płciowych,

2. ustalenie płci chromosomowej,

3. ustaleni płci genetycznej - badanie kierunku obecności SRY w genomowym DNA,

4. identyfikacja nieprawidłowości innych genów zaangażowanych w proces determinacji i różnicowania płci.

Temat: Metody uzyskiwania transgenicznych zwierząt gospodarskich.

Do uzyskiwania transgenicznych zwierząt gospodarskich, jak i modelowych, wykorzystuje się obecnie 3 metody:

1. iniekcję egzogennego DNA do przedjądrzy zygoty,

2. wprowadzenie DNA do linii płciowej z użyciem zmodyfikowanych genetycznie pierwotnych komórek zarodkowych,

3. usunięcie chromosomów zaktywowanego oocytu, a na ich miejsce wprowadzenie jądra genetycznie zmodyfikowanej komórki somatycznej.

Inne metody w prowadzenie obcych genów do zarodków za pomocą zmodyfikowanych retrowirusów. Wielkość odcinka DNA który można „zapakować” w wektory wirusowe jest ograniczona. Limituje to rozmiar genu, który w ten sposób ma być wprowadzony do komórki. Ponadto sekwencje pro wirusów prowokują metyzację co prawdopodobnie z innymi (?) mechanizmami umożliwia ekspresję trans genu dziedziczonego w linii płciowej. Wszystkie wymienione wady sprawiają, że wektorów wirusowych nie wykorzystuje się w doświadczeniach, których celem jest uzyskiwanie transgenicznych ssaków. Do tej pory większość transgenicznych zwierząt powstała dzięki mikroiniekcji DNA do męskiego przedjądrza zygoty zarodków jednokomórkowych.

Mikroiniekcja do przedjądrzy zygoty

1. samicom, od których chcemy uzyskać zarodki podaje się gonadotropiny, aby uzyskać indukowaną superowulację. Najczęściej samicom podaje się gonadotropinę uzyskiwaną z surowicy źrebnych klaczy (PMSG) a po 48h ludzką gonadotropinę kosmówkową (HCG),

2. następnie łączy się je z samcami,

3. uzyskane zygoty wypłukuje się z jajowodów następnego dnia, natomiast przylegające do nich komórki pęcherzykowe usuwa się przez inkubację w roztworze hialuronidazy, a następnie po kilkukrotnym przepłukaniu umieszcza się w małych kroplach pożywki hodowlanej,

4. niezapłodnione oocyty odrzuca się,

5. DNA wstrzykuje się do przedjądrzy kolejnych zygot pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w kontrast fazowy lub interferencyjny oraz w specjalne mikromanipulatory,

6. Kolejnym etapem jest wprowadzenie do przedjądrza określonej liczby takich samych kopii dobrze scharakteryzowanych fragmentów linearnego DNA. Zwykle do jednego lub dwóch przedjądrzy (najczęściej wybiera się większe przedjądrze męskie) wprowadza się kilka pikolitrów płynu zawierającego od 50 do 1000 kopii transgenu,

7. po zabiegu zarodki można przenieść od razu do jajowodów odpowiednio zsynchronizowanych hormonalnie samic - biorczyń lub pozostawić w hodowli do stadium 2- lub 4- komórkowe.

Samice biorczynie przygotowuje się łącząc je z samcami poddanymi wasektomii. Łączenie to jest warunkiem odpowiedniej synchronizacji cyklu płciowego samicy. Tak więc oocyty takich samic nie zostają zapłodnione i nie będą się rozwijać w przeciwieństwie do wprowadzonych zarodków.

Całkowita wydajność tej metody przy aplikowaniu DNA jest bardzo mała ze względu na toksyczny wpływ egzogennego DNA co powoduje małą przeżywalność zarodków. Właściwość tę zidentyfikowano dzięki zastrzykiwaniu kontrolnych zarodków płynem nie zawierającym DNA.

Wykład 10

Temat: Klonowanie zwierząt.

Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning czyli powstanie lub otrzymanie bliźniąt monozygotycznych gdzie nie można wyróżnić dawcy. Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej informacji genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra.

Metody klonowania:

- izolacja blastomerów zarodków 2-, 4-, 8-komórkowych,

- bisekcja zarodków w stadium moruli lub blastocysty,

- reagregacja blastomerów (klonowanie chimerowe),

- diploidyzacja,

- transplantacja jąder komórek zarodkowych do enuklowanych oocytów lub blastomerów.

Izolacja blastomerów

- w metodzie tej wykorzystuje się zdolność pojedynczych blastomerów do utworzenia całego organizmu co nazywamy totipotencją,

- nie wiadomo, kiedy w wyniku procesów różnicowania dochodzi do utraty totipotencji przez blastomery lub przynajmniej ich części. Wiadomo jednak, że pierwsze przejawy różnicowania zachodzą prawdopodobnie w okresie kiedy zarodek w stadium moruli ulega procesowi KOMPAKCJI. Zewnętrznym objawem kompakcji jest ścisły kontakt między blastomerami; zarodek ulega wyraźnemu zaokrągleniu co jest widoczne w stadium 16-komórkowym, pierwsza komórka zostaje całkowicie otoczona przez pozostałe komórki.

Izolację blastomerów przeprowadza się w sposób podobny u wszystkich gatunków ssaków. Pierwszym etapem procedury jest usunięcie osłonki przejrzystej. Jednym ze sposobów jest trawienie w roztworze pronazy. Dalsze postępowanie jest uzależnione od stadium komórkowego zarodka. Zarodki 2- i 4-komórkowe pipetuje się za pomocą pipet o lekko obtopionych brzegach, której średnica jest nieco mniejsza niż średnica zarodka. Przed dezagregacją zarodków 8-komórkowych zalecana jest inkubacja w pożywkach pozbawionych jonów wapnia i magnezu, co zapobiega uszkodzeniu poszczególnych blastomerów.

Innym nieco trudniejszym sposobem uzyskiwania pojedynczych blastomerów jest ich pobranie z całych zarodków za pomocą mikropipety wprowadzonej przez osłonkę przejrzystą. Stosuje się głównie do zarodków 4- i 16-komórkowych. Kolejnym etapem procedury jest hodowla izolowanych blastomerów w warunkach in vitro do momentu osiągnięcia przez nie stadium kompaktnej moruli lub blastocysty.

Wydajność metody

Wysoki odsetek blastomerów pochodzących z zarodków 2- i 4-komórkowych może się rozwinąć do stadium blastocysty. W przypadku pojedynczych blastomerów pochodzących z zarodków 8-komórkowych tylko ok. 15% z nich jest zdolnych do utworzenia blastocyst morfologicznie prawidłowych. Blastocysty z blastomerów 1/4 rozwijają się do końca z wydajnością 50%, a blastocysty 1/8 w około 6%. Potencjał rozwojowy izolowanych blastomerów jest różny u różnych gatunków ssaków.

Dzielenie bisekcja zarodków w stadium moruli lub blastocysty.

Dzielenie można prowadzić przy zachowanej osłonce przejrzystej lub też po uprzednim uwolnieniu zarodków z osłonek. Kierunek podziałów zarodków w stadium moruli jest zupełnie dowolny. Zarodki ze stadium blastocysty muszą być dzielone w ten sposób, aby oś podziału przechodziła przez biegun blastocysty, dzieląc węzeł zarodkowy mniej więcej na dwie równe części. Po podziale zarodki hoduje się in vitro przez około 60 minut, kiedy odzyskują zwykle prawidłowy wygląd morfologiczny, czego przejawem w przypadku podzielonych blastocyst jest utworzony w obu z nich blastocelu jamy blastuli wypełnionej płynem. Podzielone zarodki można umieszczać w zastępczych osłonkach jednak zabieg ten przeprowadza się rzadko, gdyż pozbawione osłonek zarodki w stadium moruli i blastocysty rozwijają się prawidłowo po ich transplantacji do macicy biorczyń.

- metoda bisekcji jest metodą uniwersalną dla wszystkich gatunków zwierząt,

- w odniesieniu do bydła i owiec znalazła swoje zastosowanie praktyczne - jest na szeroką skalę wykorzystywana przez firmy komercyjne.

Reagregacja blastomerów (klonowanie chimerowe) metoda ta zakłada, że jeśli pojedynczy blastomer 1/4 lub 1/8 otoczy się innymi blastomerami to zwiększa się w ten sposób wyjściową masę zarodka i szansę utworzenia węzła zarodkowego z centralnie położonych blastomerów. Metoda ta polega na otoczeniu izolowanych blastomerów 1/4 , 1/8, 2/8 kilkoma blastomerami pochodzącymi z zarodków będących w tym samym stadium, lecz z odmiennej linii. Technikę tę wykorzystywano z powodzeniem do klonowania myszy i owiec. Klonowanie tą metodą pozostaje techniką czysto laboratoryjną.

Transplantacja jąder komórek somatycznych technika wzbudzająca największe zainteresowanie, gdyż - przynajmniej teoretycznie - jest jedyną metodą pozwalającą na uzyskanie u ssaków klonów liczących wiele osobników. Polega ona na zastąpieniu jąder komórki jajowej jądrem pochodzącym z komórek starszych zarodków (2-32) lub pobranych z komórek osobników dorosłych.

Etapy procedury:

1. enukleacja komórek biorczyń jąder somatycznych,

2. uzyskiwanie jąder komórek somatycznych,

3. wprowadzenie jąder komórek somatycznych do cytoplazmy komórek biorczyń

4. aktywacja rekonstruowanych oocytów.

Klony uzyskane w procesie transferu jądrowego nie są w 100% genetycznie identyczne z dawcami. W trakcie tego procesu wymienia się bowiem tylko materiał genetyczny zawarty w jądrze komórkowym pozostawiając DNA mitochondrialne biorcy. Mitochondrialny DNA jest jednak, w sensie ilościowym, materiałem marginalnym.

(1938) Hans Spemann wykorzystanie transferu jądrowego w celu sklonowania organizmu. Pomysł pochodzi z rozwiązań nad sposobem eksperymentalnego rozstrzygnięcia kontrowersji, czy w procesie różnicowania następuje utrata materiału genetycznego, gdyby następowała, klonowanie byłoby niemożliwe.

Żaba Rapa pipiens (1952) Robert Briggs i Thomas King. Mieli trudności z uzyskaniem klonów z komórek zróżnicowanych doszli do konkluzji, błędnej, że następuje utrata materiału genetycznego.

Żaba Xenopus laevis (1958, 1962) John B. Gurdon odniósł sukces. Przez wiele lat jedna jego wynik był kwestionowany, zwłaszcza w świetle nieudanych prób klonowania ssaków. Gurdon wielokrotnie udoskonalał eksperyment, by odpowiedzieć na kolejne zarzuty.

Karp (1963) informacja kontrowersyjna

Owca (1996) pierwszy sklonowany ssak owca Dolly

Dolly urodziła się 23 lutego 1996 roku jako wynik eksperymentów naukowców Roslin Instytute w Edynburgu. W raz z nią urodziło się także 254 innych sklonowanych organizmów, jednak większość obciążona była mutacjami genetycznymi, pozostałe były zniekształcone - wszystkie zostały uśmiercone. W czasie życia owcy Dolly zebrano dużo informacji na temat rozwoju sklonowanego organizmu. Zaobserwowano m.in. że wiek materiału genetycznego sklonowanego organizmu jest identyczny z wiekiem dawcy. Tym samym Dolly miała biologicznie 6 lat w chwili urodzenia, tyle ile miała owca dawczyni. Prawidłowość ta powoduje między innymi, że klon nie jest pozbawiony wad genetycznych wieku starczego dawcy i ma mniejszą odporność na choroby. Dolly została uśpiona ze względu na nieuleczalną chorobę płuc po 6 latach, 14 lutego 2003 (owce żyją 11-12 lat). Wcześniej cierpiała także na zwyrodnieniową chorobę stawów. Wydała na świat 6 zdrowych jagniąt. Po śmierci została wypchana i zaprezentowana publiczności w edynemburskim muzeum 11.IV.2003.

Mysz (1998) Wakayana i Yamagimachi . W 2002 roku Hochedlinger i Jaenisch sklonowali myszy z limfocytów Ti pokazali, że otrzymane osobniki mają rearanżację genu receptora limfocytu T właściwą dla wyjściowej populacji limfocytów. Powszechnie uważa się to za najsilniejszy dowód, że klonowanie jest możliwe z komórek zróżnicowanych.

Wykład 11

Temat: Transgeneza zwierząt gospodarskich - zwierzęta gospodarskie jako bioreaktory.

Pozyskiwany czynnik	Zwierzę
AAT	Owca
TPA	Koza
Czynnik VIII	Owca
Czynnik IX	Owca
Laktoferyna	Krowa
Białko C	Świnia
Hemoglobina	Świnia

Jako bioreaktory mogą służyć:

- gruczoł mlekowy,

- pęcherz moczowy,

- tkanka krwiotwórcza.

AAT- α1-antytrypsyna

Białko syntetyzowane głównie w wątrobie oraz w niewielkiej ilości w nerkach, płucach, jelicie. Kontroluje ponad 70 wariantów białek surowiczych. Jest głównym inhibitorem proteaz w procesach degradacji białek. U ludzi występują dwa warianty polimorficzne genu kodującego AAT-MM przy średniej koncentracji w osoczu na poziomie 1,3 mg/ml oraz (stosunkowo rzadko) ZZ manifestujący się zmniejszeniem poziomu białka we krwi 20-30%. W przypadku genetycznego niedoboru najskuteczniejszym systemem prewencji jest rezygnacja z palenia bądź przebywania w atmosferze drażniącej drogi oddechowe.

Aktywator plazminogenu

Proteinaza przekształcająca prekursorowy produkt (proenzym, plazminogen) w biologicznie aktywną plazminę, która wykazuje silne działanie fibrynolityczne i jest ogniwem w całym mechanizmie umożliwiającym regenerację uszkodzonych naczyń i tkanek, likwidowanie skrzepów, zatorów wewnętrznych i wylewów. U ludzi występuje niedobór na tle genetycznym. Niedobór ma w klinistyce znaczenie marginalne niemniej jednak podejmowano próby uzyskiwania aktywatora plazminogenu w organizmach owiec.

Czynnik IX krzepliwości krwi

Niedobór czynnika IX krzepliwości krwi wywołuje u ludzi hemofilię typu B. Kliniczne zapotrzebowanie na ten metabolit nie jest duże, gdyż hemofilia B występuje rzadko (o 75% rzadziej niż niezbyt częsta hemofilia A) i w większości ma łagodny przebieg. W warunkach standardowych jest pozyskiwany z ludzkiej krwi. Jego przechowywanie jest stosunkowo proste, gdyż charakteryzuje się dużą stabilnością nie ma więc potrzeby poszukiwania go na drodze trans genezy. Niemniej jednak są takie próby.

Hemoglobina kręgowców składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych po dwa w każdego z dwóch rodzajów jest więc hetero - tetramerem. Hemoglobina A podstawowa hemoglobina występująca u dorosłych ludzi składa się z dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów β oraz hemu (kompleks metaloporfirynowy). U dorosłego człowieka występuje również hemoglobina AZ (nie więcej niż 3% w odniesieniu do całkowitej ilości hemoglobiny), która zamiast łańcuchów β występujących w hemoglobinie A zawiera łańcuchy delta. Zarodek i płód mają odmienną hemoglobinę. Wkrótce po zapłodnieniu zarodek zarodek syntetyzuje łańcuchy zeta, odpowiadające łańcuchom α i ε, odpowiadające łańcuchom β. W trakcie rozwoju łańcuchy zeta są zastępowane przez łańcuchy α a łańcuchy ε przez łańcuchy gamma i ostatecznie przez łańcuchy β. Te płodowe hemoglobiny noszą odpowiednie nazwy:

- GOWER 1 (2 zeta i 2 epsylon),

- GOWER 2 (2 alfa i 2 epsylon),

- PORTLAND (2 alfa i 2 gamma).

Podstawową hemoglobiną podczas ostatnich 6 miesięcy ciąży jest hemoglobina F o strukturze podjednostek α2γ2. Różnice strukturalne wpływają na większe powinowactwo hemoglobiny płodowej do tlenu w porównaniu z hemoglobiną A.

Geny kodujące poszczególne łańcuchy globin

U ludzi geny globin zawarte są w dwóch zamkniętych grupach, określanych jako locus alfa i locus beta. Pierwsza grupa(locus alfa) zlokalizowana jest w chromosomie 16 a w jej skład wchodzą w kolejności ułożenia w kierunku 5' 3' dwa geny zeta i dwa geny alfa. Geny kodujące łańcuchy α są identyczne. Każdy syntetyzuje ok. ¼ mRNA potrzebnego do wytworzenia hemoglobiny. Koordynacja tego procesu nie jest dostatecznie poznana. Element promotorowy znajduje się w pozycji 5' przed każdym genem tej grupy. Wspólny jest natomiast region enhancera, zapewniający optymalną ekspresję wszystkich genów; jest to klasyczny LCR usytuowany powyżej ORF dla genów zeta i alfa. Mechanizm za pomocą którego elementy DNA położone tak daleko od genów docelowych regulują ich ekspresję, jest przedmiotem intensywnych badań. Geny zeta ulegają częściowej, embrionalnej ekspresji.

Druga zamknięta grupa genów (locus beta) usytuowana jest w chromosomie 11. Ich ułożenie odpowiada kolejności w jakiej ulegają one ekspresji podczas rozwoju embrionalnego, płodowego i postnatalnego. Pierwszy z nich epsylon ulega ekspresji ok. 12 tygodnia ciąży. Gen gamma występujący w dwóch kopiach ulega ekspresji w czasie rozwoju płodowego. Około momentu narodzin jego ekspresja obniża się i jest wypierana przez gen beta usytuowany na końcu omawianej grupy genów. Gen delta zlokalizowany między genem gamma i beta w niewielkim stopniu ulega ekspresji u dzieci i u osobników dorosłych. Jego produkt łańcuch delta wchodzi w skład hemoglobiny AZ. Ekspresja genu beta jest właściwa dla dojrzałej ludzkiej hemoglobiny przy czym jest to ekspresja precyzyjnie odpowiadająca w sensie ilościowym ekspresji białka.

Zwierzęta transgeniczne jako bioreaktory do produkcji rekombinowanej ludzkiej hemoglobiny

Zapotrzebowanie na krew stanowi ogromny problem co roku na świecie przetaczanych jest 30 mln jednostek krwi przy czym brakuje ok. 4 mln głównie ze względu na brak dawców. Duże zainteresowanie rekombinowaną hemoglobiną jest więc oczywiste. Wg WHO 5% ludzi na świecie jest nosicielami różnych dziedzicznych form mutacji genów globinowych -obecnie znanych jest ponad 300 z czego większość jest neutralna bądź szkodliwa dla zdrowia.

Obecnie rozwijane są 3 kierunki badań umożliwiające uzyskanie sztucznej krwi:

- modyfikacja hemoglobiny (potrzebni dawcy),

- produkcja substytutów krwi (oparta na związkach fluorescencyjnych, niska trwałość do ok. 6 godzin) preparaty odpowiednie dla pacjentów potrzebujących krwi podczas operacji, ale nie dla osób dotkniętych hemoglobinopatią,

- hemoglobina transgeniczna.

Cele wprowadzania ludzkich genów globin do transgenicznych zwierząt

- produkcja hemoglobiny jako substytutu krwi do transfuzji,

- badanie ekspresji genów globin,

- badanie budowy hemoglobiny,

- badanie z zakresu chorób genetycznych tzw. hemoglobinopatii

Hemoglobina transgeniczna

Pierwsze badania z zakresu pozyskiwania transgenicznej hemoglobiny miały miejsce w 1989 roku kiedy to uzyskano syntezę ludzkiej hemoglobiny w organizmie transgenicznych myszy, którym wprowadzono geny ludzkich globin α. Hemoglobina ludzka syntetyzowana przez myszy wskazywała taką samą zdolność wiązania tlenu. Kolejne badania z omawianego zakresu to transfekcja ludzkich komórek erytroidalnych ludzkimi genami α i β które połączono.

Transgeniczne świnie uzyskano po raz pierwszy w 1992 roku. Do ich uzyskania użyto 5 konstruktów genowych. We wszystkich przypadkach odnotowano wysoki poziom ekspresji ludzkiego genu α- globiny przy niskiej, a nawet minimalnej ekspresji genu kodującego łańcuch β. Możliwość uzyskania większej liczby funkcjonalnej cząsteczek ludzkiej hemoglobiny były więc niewielkie. Zastosowanie konstruktu genowego o nazwie ,,339'' o długości 18 kb dało zaskakujące rezultaty. Włączono locus ε w celu poprawy regulacji ekspresji genu beta gdyż są to zjawiska skorelowane. Konstrukt wprowadzono do 1714 świńskich oocytów które przeniesiono do 50 biorczyń. Uzyskano 23 mioty liczące ogółem 145 prosiąt z których 8 okazało się zwierzętami transgenicznymi (efektywność 3%). Masa ciała prosiąt 1-2 kg.

We krwi transgenicznych świń odnotowano obecność następujących rodzajów cząsteczek hemoglobin:

- hemoglobina mieszana (hybrydowa) w której łańcuchy α pochodziły z globiny ludzkiej, a łańcuchy β z globiny świńskiej, występowała u wszystkich transgenicznych zwierząt,

- hemoglobina ludzka,

-hemoglobina świńska.

U wszystkich transgenicznych świń poziom hemoglobin utrzymywał się w granicach normy fizjologicznej dla danego gatunku, podobnie jak liczba erytrocytów i hematokryt. W przypadku 7 świń hemoglobina ludzka stanowiła 5-24% całkowitej hemoglobiny erytrocytarnej. Najkorzystniejsze proporcje odnotowano u transgenicznej lochy, w erytrocytach której 24% stanowiła hemoglobina rekombinowana. W ciągi roku pozyskano 500-1000 gram hemoglobiny.

Inne cele rozwijania badań

- badanie heterozygot pod względem ich odporności na śmiertelną formę malarii (jeden zmutowany allel).

Cząsteczka hemoglobiny będąca w naturalnych warunkach tetramerem, po uwolnieniu z erytocytów traci stabilność i dysocjuje na dwa jednakowe dimery i jest usuwana z organizmu.

Inne cele rozwijania badań z zakresu pozyskiwania transgenicznych zwierząt z ludzką hemoglobiną:

- badania z zakresu ekspresji budowy i roli hemoglobin zarodkowych GOWER 1, GOWER 2, Portland, które są wciąż słabo poznane,

- badania w organizmach transgenicznych zwierząt różnego rodzaju hemoglobinopatii.

Kapsułkowana hemoglobina jest to wytworzenie sztucznych czerwonych krwinek przy czym najbardziej obiecującym tworzywem wstępnie badanym okazał się biofosfoglicerynian (2,3 BFG), który dodatnio wpływa na oddawanie tlenu przez hemoglobinę w naczyniach włosowatych gdyż zmniejsza jej powinowactwo do tlenu 26x. Cząsteczki takie przypominają swoim wyglądem i funkcjami erytrocyty, ale nie mają powierzchniowych antygenów. Cząsteczka hemoglobiny jest bardziej stabilna nie rozpada się na dimery. Pierwsze produkcje sztucznych krwinek datuje się na 1957.

Sieciowanie hemoglobiny metoda wykorzystująca odpowiednie związki chemiczne do utrzymania struktury hemoglobiny lub łączenie jej w większe agregaty. Czas półtrwania dla mniejszych polihemoglobin (4-5 cząsteczek) wynosi 30 godzin. Dodatek analogu 2,3 - difosfoglicerynianu powoduje, że takie policzą steczki wykazują zbliżone właściwości do naturalnych erytrocytów.

Na drodze inżynierii genetycznej udało się uzyskać hemoglobinę ludzką w komórkach E. coli oraz Saccharomyces cerevisiae. Wystąpiły jednak czynniki ograniczające natury ekonomicznej, bowiem nakłady ponoszone były większe od zysków.

GENY BIAŁEK MLEKA - BUDOWA, LOKALIZACJA, EWOLUCJA

INFORMACJE PODSTAWOWE

• główne składniki białkowe mleka krów to kazeiny (ၡS1, ၡS2, ၢ, ၫ)

• występują one w połączeniu z fosforanem wapnia w postaci koloidowych cząsteczek (miceli)

• hydroliza miceli przez chymozynę (podpuszczkę) prowadzi do destabilizacji miceli i powstania strątu kazeinowego (razem ze sporą ilością tłuszczu i b.serwatki)

• strąt jest półproduktem w procesie wytwarzania serów

• mleko kozy i owcy zawiera identyczne kazeiny do krowich, natomiast innych gatunków ssaków zawiera kazeiny, które na podstawie właściwości można zaliczyć do jednej z grup kazein krowich

• w mleku gryzoni jedną z głównych frakcji jest kazeina ၧ (u myszy wykazano aż 9 różnych typów kazein)

• w mleku człowieka ilość kazein jest niższa niż w mleku przeżuwaczy (ၡ w śladowych ilościach), główną frakcją jest kazeina ၢ

• serwatka mleka przeżuwaczy składa głównie się z ၢ-laktoglobuliny oraz ၡ-laktoalbuminy

• ၡ-laktoalbumina z galaktozylotransferazą tworzą kompleks syntazy laktozowej (synteza laktozy z glukozy i UDP-galaktozy)

• ၢ-laktoglobulina uczestniczy w transporcie witaminy A i innych niskocząsteczkowych związków występujących w mleku

• w mleku gryzoni, człowieka, świni i wielu innych gatunków ssaków ၢ-laktoglobulina nie występuje

• u myszy, szczura i królika głównym składnikiem białkowym serwatki jest tzw. kwaśne białko serwatki (WAP, ang. whey acid protein)

SKŁAD BIAŁEK MLEKA PRZEŻUWACZY, KRÓLIKA I CZŁOWIEKA

Białko	Krowa	Koza	Owca	Człowiek	Królik
kazeina ၡS1	+	+	+	ślady	+
kazeina ၡS2	+	+	+	?	?
kazeina ၢ	+	+	+	+	+
kazeina ၫ	+	+	+	+	+
WAP	-	-	-	-	+
ၢ-laktoglobulina	+	+	+	-	-
ၡ-laktoalbumina	+	+	+	+	+
Stężenie białka, g/l	34	29	55	10	136

OGÓLNA BUDOWA GENÓW BIAŁEK MLEKA

• ogromny postęp w poznawaniu struktury i sekwencji genów kazein i innych białek mleka nastąpił w ostatnich 20 latach

• wszystkie poznane dotychczas geny białek mleka mają budowę kanoniczną, typową dla eukariotycznych genów klasy II

• transkrybowane są przy udziale RNA polimerazy II

• ich sekwencje kodujące (eksony) rozdzielone są (czasami bardzo długimi) intronami

• miejsca inicjacji transkrypcji poprzedzone są długimi sekwencjami flankującymi końca 5'

• sekwencja TATA (mniej lub bardziej typowa) występuje zawsze w odległości około 30 par zasad od miejsca inicjacji transkrypcji

• geny białek mleka zawierają sekwencje kodujące miejsca składania mRNA

• na końcu 3' występuje sekwencja AATAAA (kodująca sygnał poliadenylacji mRNA), po niej występują powtarzające się sekwencje GT (koniec transkrypcji)

• w części proksymalnej genu występują sekwencje wiążące czynniki aktywujące lub represorowe (czynniki transkrypcyjne i receptory hormonalne)

INFORMACYJNY RNA (mRNA) GENÓW BIAŁEK MLEKA

• budowa typowa dla mRNA organizmów eukariotycznych

• na końcu 5' posiada czapeczkę (cap) utworzoną przez 7-metylocytozynę

• chroni ona przed degradacją mRNA przez nukleazy i ułatwia tworzenie kompleksu inicjującego translację z podjednostką 40S rybosomu, Met-tRNA i czynnikami inicjującymi

• większość mRNA białek mleka posiada typowy sygnał poliA, wyjątkiem są mRNA kazeinowe królika (20-25% całkowitej puli) - bardzo krótkie sygnały poliA lub ich całkowity brak

• długość mRNA różnych białek mleka waha się od 549 nt (WAP królika) do 1349 (kazeina ၡ szczura)

• mRNA białek mleka (podobnie jak innych białek sekrecyjnych) zawiera informację dla peptydu sygnałowego (około 20-aminokwasowy fragment), który jest odłączany przed wydzieleniem z komórki

• otwarta ramka odczytu (część mRNA kodująca aminokwasy) stanowi 60-70% długości mRNA

• fragmenty nie podlegające translacji: 30-40 nt na końcu 5' i około 180 nt na końcu 3'

LOKALIZACJA GENÓW KAZEIN (LOCUS KAZEINOWY)

Locus kazeinowy bydła/kozy. Zaznaczono rozmieszczenie genów kazein ၡ_S1, ၡ_S2, ၢ i ၫ na chromosomie 6.

• Mysz - geny kazein ၡ, ၢ, ၧ zlokalizowano na chromosomie 5

• Królik - geny kazein ၡ, ၢ zlokalizowano na chromosomie 12

• Owca - geny kazein ၡ_S1, ၡ_S2, ၢ, ၧ zlokalizowano na chromosomie 6

Geny kazein występują w organizmach prawdopodobnie w postaci jednej kopii (nie wykazano istnienia dodatkowych aktywnych genów lub pseudogenów w genomach ssaków)

BUDOWA GENÓW KAZEIN

1/ GEN β-KAZEINY BYDŁA

2/ GEN -KAZEINY BYDŁA

1/ GEN S1 -KAZEINY BYDŁA

1/ GEN S2 -KAZEINY BYDŁA

EWOLUCJA GENÓW KAZEIN

• analiza sekwencji nukleotydowych genów kazein wskazuje na wysoki stopień zróżnicowania ewolucyjnego

• wskazuje się na wspólne pochodzenie genów tzw. kazein wrażliwych na wapń (ၡ_S1, ၡ_S2, β)

• funkcje biologiczne kazein są dość luźno związane z ich strukturą I-rzędową

• trzy obszary genów kazeinowych - niekodujące fragmenty końca 5', regiony kodujące peptyd sygnałowy i regiony kodujące miejsca fosforylacji - mają budowę bardziej zachowawczą

• stopień homologii pomiędzy tymi regionami u różnych gatunków zwierząt jest bardzo wysoki, wskazując na wspólne pochodzenie genów kazein

• międzygatunkowe różnice w długości i sekwencji genów kazein dotyczą w większym stopniu intronów niż eksonów

• różnice długości intronów wynikają głównie z występowania w niektórych genach kazein długich sekwencji powtórzonych

• w genie ၡ_S2-kazeiny krowy sekwencje powtórzone stanowią 14% długości genu

• rodzina genów kazeinowych powstała w procesie ewolucji przez duplikację genu pierwotnego zawierającego sekwencje kodujące dla peptydu sygnałowego oraz miejsc fosforylacji białka (tzw. bloki fosfoserynowe)

• dwa fragmenty kodujące w genie ၡ_S2-kazeiny bydła (eksony 7-11 i 12-16) powstały przez duplikację jednego fragmentu DNA

• bydlęcy gen ၡ_S1-kazeiny jest bliżej „spokrewniony” z genem β-kazeiny niż ၡ_S2

• przypuszcza się, że geny obu kazein ၡ_S1 i β mogły powstać przez wewnętrzną duplikację fragmentów DNA

• gen ၫ-kazeiny nie wydaje się być spokrewniony z genami pozostałych kazein

• ၫ-kazeina ewolucyjnie wydaje się być powiązana z rodziną genów fibrynogenu, gdyż podobnie do kazeiny kappa ich częściowa hydroliza prowadzi do powstania strątu białkowego

POLIMORFIZM GENÓW BIAŁEK MLEKA - REGION 5'

• analiza komputerowa sekwencji części promotorowych genów białek mleka wykazała istnienie wielu potencjalnych miejsc wiązania czynników regulujących ich ekspresję (m.in. MGF/STAT5A1, MAF2, MPBF3, AP1, CREB, CTF/NF1, OCT1, GR, HSE)

• działanie niektórych czynników w regulacji ekspresji genów białek mleka potwierdzono eksperymentalnie

• większość sekwencji regulatorowych zlokalizowano w części proksymalnej promotorów w odległości około 200-250 pz od miejsca startu transkrypcji

• element regulacyjny BCE1 genu β-kazeiny zlokalizowano w odległości 1500 pz od miejsca startu transkrypcji

• opisano istnienie wielu miejsc polimorficznych w części 5' genów białek mleka, niektóre z nich mogą występować w obrębie sekwencji regulatorowych

• polimorfizm w obrębie tych sekwencji może różnicować ekspresję genów białek mleka wpływając na cechy fizjologiczne (fenotypowe) zwierząt

POLIMORFIZM GENÓW KAZEIN (REGION 5')

Gen	Gatunek	Długość genu (5')	Typ / lokalizacja polimorfizmu	Metoda analizy
αS2	Bydło	18483 (2509)	10 substytucji nukleotydowych w regionie od -1150 do +118 genu	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
αS1	Bydło	17508 (2131)	15 substytucji, 2 delecje/ insercje (region od -1145 do +100)	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
αS1	Bydło		fragment genu długości 218 pz,(region od +3 do -215)	SSCP
αS1	Bydło		substytucja A/G w pozycji -175 genu	RFLP
β	Bydło	8498 (1722)	10 substytucji nukleotydowych, 1 insercja / delecja (od -1049 do +88)	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
β	Bydło		delecja T w pozycji -516	Sekwencjonowanie
β	Koza	9006 (1001)	substytucja A/G w pozycji -161	RFLP, Sekwencjonowanie
ၫ	Bydło	13000 (2167)	15 substytucji nukleotydowych , (od -1028 do +59)	RFLP, Sekwencjonowanie
ၫ	Bydło		fragment długości 241 pz w regionie 5'	RFLP

POLIMORFIZM GENU -KAZEINY BYDŁA

• u bydła wykryto dwa główne warianty genetyczne ၫ-kazeiny (A i B)

• wariant A charakteryzuje się występowaniem Thr(ACC) i Asp(GAT) w pozycjach 136 i 148, podczas gdy allel B - Ile(ATC) i Ala (GCT)

• różnice te mogą być wykrywane dzięki obecności lub braku miejsca restrykcyjnego dla enzymu HindIII (dodatkowo zniesione zostaje miejsce dla enzymu HinfI w przypadku allelu B dla pozycji 148)

• allel B genu ၫ-kazeiny ma korzystniejszy wpływ na jakość mleka ras europejskich bydła - krótszy czas reakcji na obecność podpuszczki

• sery produkowane z mleka krów BB charakteryzują się wyższą zawartością białka, wyższą wydajnością i lepszą jakością niż te z mleka krów AA i AB

• mleko krów HF o genotypie BB zawiera (średnio) 0.13% białka więcej

• w regionie 5' genu ၫ-kazeiny wykazano istnienie kilkunastu mutacji, jednakże brak jak na razie szczegółowych opracowań w literaturze na temat ich wpływu na cechy mleczności bydła

• Kamiński donosi, że dla polimorfizmu PCR/RFLP-DdeI zlokalizowanego w części 5' genu istnieje możliwość doskonalenia % zawartości białka w mleku

GENY BIAŁEK SERWATKI

• główne białka serwatki to ဠၢ-laktoglobulina, ၡ-laktoalbumina i WAP

• geny b. serwatki są krótsze i mniej skomplikowane w budowie niż geny kazein

• geny ၢ-laktoglobuliny owcy i bydła mają podobną strukturę, co wskazuje na wspólne pochodzenie ewolucyjne

• geny ၡ-laktoalbuminy są ewolucyjnie zbliżone, składają się z 4 eksonów

• wskazano na podobieństwo pomiędzy genami ၡ-laktoalbuminy i lizozymu szczura (pochodzenie od wspólnego genu przodka)

• lokalizacja chromosomowa: gen ၡ-laktoalbuminy: bydło 5, owca 3, człowiek 12

• u bydła i owcy wykazano obecność kilku pseudogenów ၡ-laktoalbuminy

• lokalizacja chromosomowa: gen ဠၢ-laktoglobuliny: bydło i koza 11, owca 3

• w genomie kozy i owcy wykazano istnienie pseudogenów ဠၢ-laktoglobuliny

POLIMORFIZM GENÓW SERWATKI α-LAKTOALBUMINA

• α-laktoalbumina jest niezbędna w biosyntezie laktozy w gruczole mlecznym, dlatego jest brana pod uwagę jako potencjalny marker cech mleczności u bydła

• u ras europejskich gen α-laktoalbuminy jest raczej monomorficzny, poza regionem 5'

• w przypadku substytucji A/G w pozycji +15 wykazano, że krowy z allelem A miały wyższą wydajność mleka, tłuszczu i białka, allel B wpływał na wyższą procentową zawartość białka i tłuszczu w mleku (prawdopodobnie istnieją różnice w poziomie mRNA)

• Voelker i wsp. wykazali istnienie drugiej mutacji ściśle sprzężonej z mutacją +15, opisaną jako A/G w pozycji -1689

POLIMORFIZM GENÓW SERWATKI β-LAKTOGLOBULINA

• β-laktoglobulina występuje w mleku wielu gatunków, głównie przeżuwaczy, nie występuje u gryzoni, królika i wielbłąda (jest tam zastąpiona przez WAP)

• u bydła poznano 12 wariantów polimorficznych, ale 2 najczęściej występujące (A i B) wiąże się z różnicami w wydajności i składzie białka mleka

• mutacje te opisano jako Asp64 (GAT) / Gly (GGT) and Val118 (GTC) / Ala (GCC)

• allel B wpływał na wyższą zawartość kazein i tłuszczu w mleku krów, natomiast krowy HF o genotypie AA charakteryzowały się wyższą zawartością białka ogólnego i białek serwatki niż osobniki o pozostałych genotypach

• Kamiński i Zabolewicz wykazali zależności pomiędzy polimorfizmem regionu 5' genu a cechami mleczności krów typując region promotorowy jako marker % zawartości białka w mleku krów

Ekspresja i inżynieria genów białek mleka - Metody inżynierii genetycznej w hodowli zwierząt

WPROWADZENIE

• Gruczoł mlekowy jest gruczołem pęcherzykowo-cewkowym pochodzenia skórnego

• Prenatalny rozwój gruczołu mlekowego kontrolowany jest przez czynniki genetyczne i hormonalne (na tym etapie ustala się potencjalna użytkowość mleczna)

• Postnatalny wzrost gruczołu mlekowego jest regulowany przede wszystkim przez hormony jajników, przedniej części przysadki, kory nadnerczy

• Pod ich wpływem układ przewodów ulega silnemu rozgałęzieniu, na końcach rozgałęzień rozwijają się pęcherzyki mleczne

• U podstawy jednowarstwowych pęcherzyków znajduje się warstwa kurczliwych komórek mięśniowo-nabłonkowych

• Grupa pęcherzyków tworzy tzw. zraziki, te tworzą zrazy, zrazy - ćwiartki, a 4 ćwiartki stanowią wymię (u krowy)

• Wzrost gruczołu mlekowego od urodzenia do momentu osiągnięcia dojrzałości płciowej jest powolny

• Aktywny wzrost rozpoczyna się wystąpienia regularnych cykli płciowych. Pełny stopień rozwojowy osiągany jest na początku pierwszej laktacji

• Zapoczątkowanie biosyntezy składników mleka określa się mianem laktogenezy, utrzymanie laktacji - laktopoezy

Proces tworzenia gruczołu mlekowego przebiega pod kontrolą:

1. estrogenów (rozwój przewodów mlecznych)

2. progesteronu (rozwój pęcherzyków)

3. hormonu wzrostu (GHR, IGF-I)

4. prolaktyny (rozwój i sekrecja pęcherzyków mlecznych)

5. insuliny

6. trójjodotyroniny

7. kortykotropiny (ACTH)

Laktogeneza przebiega pod kontrolą:

1. Prolaktyny - zapoczątkowanie laktacji i sekrecji mleka

2. Tyreoliberyny - pobudzanie sekrecji prolaktyny

3. Progesteronu - główny inhibitor laktogenezy

4. Glikokortykoidów - kontrolują i regulują aktywność kilku kluczowych enzymów biorących udział w syntezie składników mleka

5. Insuliny - pobudza syntezę mRNA białek mleka

6. Hormon wzrostu - działanie ma charakter pośredni i polega na zwiększaniu transportu substancji odżywczych do komórek gruczołu mlekowego

7. Insulinopodobnych czynników wzrostu (IGF-I, IGF-II)

Ekspresja genów białek mleka in vivo

• Podczas ciąży następuje wzrost syntezy różnych typów RNA

• Wzrost syntezy rRNA i tRNA służy rozbudowaniu aparatu biosyntezy białka komórek wydzielniczych i przygotowaniu do syntezy olbrzymich ilości białek mleka

• Synteza mRNA ma miejsce na długo przed podjęciem syntezy i sekrecji białek mleka (wzrasta w czasie ciąży, szczyt w czasie laktacji)

• W gruczole mlecznym mRNA białek mleka stanowi około 90% całej puli informacyjnego RNA

• Liczba cząsteczek kazeinowego mRNA wzrasta około 4000 razy (osiąga poziom 80 tysięcy cząsteczek na komórkę nabłonka wydzielniczego)

• Zawartość kazeinowego mRNA w gruczole mlecznym szczura znacznie maleje po odsadzeniu młodych

• W gruczole mlecznym szczura opisano zróżnicowany poziom ekspresji białek mleka w trakcie ciąży i laktacji; ilość mRNA kazein w gruczole mlecznym wzrasta między 5 dniem ciąży a 15 laktacji

• Zawartość mRNA ၡ-laktoalbuminy jest niewielka w czasie ciąży, wzrasta istotnie w trakcie laktacji

• w gruczole mlecznym krowy znaczny wzrost stężenia mRNA kazeiny ၡ_S1 obserwuje się na 2 dni przed porodem (w przeciwieństwie do innych kazein i LALBA)

• porównanie zawartości mRNA głównych białek mleka w gruczole mlecznym krowy wykazało 3-4 krotny pomiędzy 8 miesiącem ciąży a pełną laktacją

• zawartość mRNA kazein ၡ_S1 i ၢ w komórkach laktującej krowy jest około 4-krotnie większa niż zawartość mRNA kazein ၡ_S2 i ၫ (znajduje to odzwierciedlenie w składzie frakcji białkowych mleka krowiego)

• w trakcie zasuszania zawartość mRNA kazein zmniejsza się znacznie, choć nie jednakowo; 72 godziny po ostatnim doju mRNA kazeiny ၡ_S1 obniża się o połowę, natomiast mRNA kazeiny ၫ spada do 16%

• akumulacja mRNA ၢ-laktoglobuliny rozpoczyna się już 5 miesiącu ciąży, wzrastając w czasie dalszej ciąży i laktacji

• mRNA laktoferyny, małe w czasie ciąży i laktacji, wzrasta w trakcie inwolucji gruczołu mlecznego

Mechanizm działania hormonów na ekspresję genów białek mleka

• Prolaktyna zwiększa tempo transkrypcji genów kazein i stabilizuje mRNA. W obecności PRL, insuliny i kortyzolu trwałość mRNA kazeinowego wzrasta 4-krotnie

• Insulina stymuluje transkrypcję genu kazeiny ၢ, ma jednak niewielki wpływ na trwałość kazeinowego mRNA (w przeciwieństwie do glikokortykoidów mających niewielki wpływ na tempo transkrypcji - zwiększają one natomiast 20-krotnie czas półtrwania kazeinowego mRNA)

• obecność lamininy w podłożu hodowlanym zwiększa 2-krotnie tempo transkrypcji kazeiny ၡ i 4-krotnie trwałość kazeinowego mRNA

• działanie GH na ekspresję genów białek mleka jest niejasne, zachodzi prawdopodobnie za pośrednictwem IGF (obecność receptorów w gruczole). Wykazano, że IGF-I stymuluje in vitro syntezę mRNA i akumulację kazeiny ၢ

• Hormony steroidowe (kortyzol i progesteron) działają poprzez wewnątrzkomórkowe receptory (wiążące się bezpośrednio z sekwencjami regulacyjnymi w genach)

• obecność takich sekwencji (GRE i PRE ang. glucocorticoid/progesterone response element) stwierdzono w promotorach wszystkich poznanych genów białek mleka

• hormony białkowe (GH, PRL) działają poprzez receptory ulokowane w błonie komórkowej (liczne receptory PRL w błonie komórkowej nabłonka wydzielniczego)

• działanie hormonów białkowych zakłada istnienie wewnątrzkomórkowego przekaźnika(-ów)

• Inhibitor syntezy spermidyny (MGBG) obniża znacznie zależną od PRL akumulację kazeinowego mRNA w eksplantatach gruczołu mlecznego szczura (dodanie spermidyny nie przywraca jednak akumulacji kazeinowego mRNA do normalnego poziomu)

• dodanie cyklicznego GMP (cGMP) do podłoża hodowlanego stymuluje 2-3 krotnie akumulację mRNA (efekt około 10-krotnie mniejszy niż PRL)

• Cykliczny AMP (cAMP), stymulujący podziały komórek gruczołu mlecznego, wpływa raczej hamująco na różnicowanie nabłonka wydzielniczego. W gruczole mlecznym szczura i królika cAMP (prostaglandyny, wazopresyna, oksytocyna) nie naśladują in vitro działania PRL na ekspresję genów kazein), podobnie jak EGF (czynnik wzrostu naskórka)

• Elementy cytoszkieletu pełnią istotną rolę w regulacji ekspresji genów białek mleka, szczególnie w przekazywaniu sygnału PRL do wnętrza komórki. Inhibitor filamentów aktynowych (cytochalazyna D) hamuje in vitro syntezę i akumulację mRNA kazein

• Oubaina (inhibitor transportu przez błony komórkowe jonów K⁺/Na⁺) i amiloryd (K⁺/H⁺) blokują działanie PRL na ekspresję genów kazein królika

• Estry forbolowe (TPA i PMA), stymulujące lub hamujące w komórce aktywność kinazy białkowej C hamują ekspresję PRL. Podobnie działają inne inhibitory kinazy białkowej C - sfingozyna, staurosporyna, fosfolipaza A₂,

• jednym z mechanizmów regulacji ekspresji jest metylacja reszt cytozynowych (silna metylacja =mniejsza aktywność). Wykazano wyższy stopień metylacji genu ၫ-kazeiny szczura w okresie ciąży niż w trakcie laktacji

Sekwencje regulacyjne w promotorach genów białek mleka

• inne podejście badania molekularnych mechanizmów ekspresji genów białek mleka polega na poszukiwaniu sekwencji regulacyjnych w ich promotorach

• analiza komputerowa sekwencji promotorów genów kazein i białek serwatki wykazała obecność kilku sekwencji homologicznych, typowych dla genów białek mleka (po raz pierwszy przeprowadzona przez Yu-Lee i wsp. 1986)

• Yu-Lee i wsp. zidentyfikowali 6 konserwatywnych sekwencji w regionach regulatorowych końców 5' genów kazein ၡ, ၢ i ၧ szczura

• analiza większej grupy genów kazein oraz ၡ-laktoalbuminy pozwoliła zidentyfikować 30-nukleotydowej sekwencji poprzedzającej o około 100 pz miejsce inicjacji transkrypcji (tzw. milk box). Stopień homologii tej powszechnej dla genów białek mleka sekwencji waha się od 65 do 80%). W obrębie sekwencji milk box wiążą się białka jądrowe.

• ukierunkowana mutageneza genu kazeiny ၢ w obrębie milk box (-110 do -140) spowodowała wzrost ekspresji genu (zapoczątkowanie transkrypcji genu kazeiny może być związane z uwolnieniem czynników represorowych)

• Malewski i Zwierzchowski (1995) badając promotor genu ၢ-kazeiny szczura (2096 pz) wykazali istnienie 150 sekwencji potencjalnie wiążących 56 różnych czynników transkrypcyjnych (co najmniej 20 może uczestniczyć w regulacji ekspresji przez hormony i ich mediatory)

Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów białek mleka

• analiza teoretyczna oraz identyfikacja potencjalnych sekwencji regulacyjnych w promotorach genów nie świadczy jednoznacznie, że uczestniczą one w regulacji ekspresji genów (dowodem jest wiązanie białek regulacyjnych ze swoistymi sekwencjami promotorów genów)

• badania takie zapoczątkowali Luboń i Hennighausen (1988) wykorzystując fakt wolniejszej migracji kompleksu DNA-BIAŁKO niż nagiego DNA. Autorzy badali wiązanie białek jądrowych z promotorami genów kwaśnego białka serwatki (WAP) i ၡ-laktoalbuminy.

• metodą tą wykazano (w promotorze szczurzej ၡ-laktoalbuminy) istnienie dwóch miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego NF1. Ponadto wykazano obecność 5 miejsc wiązania czynnika NF1 w genie owczej ၢ-laktoglobuliny

• analiza promotora genu WAP szczura wykazała obecność tzw. miejsc superwrażliwych na DNazę-I w pozycjach -150 i -800. W miejscu dystalnym wykazano sekwencje wiążące czynniki transkrypcyjne z rodziny CTF/NF1 (niezbędnych w czasie laktacji)

• innym powszechnie występującym czynnikiem transkrypcyjnym, który wiąże się z promotorami genów białek mleka jest czynnik Oct1 (4 miejsca w genie ၡ_S2 kazeiny bydła w pozycjach -480, -260, -210, -50).

• wiązanie czynnika Oct1 z regionem promotora -48 do -55 jest pozytywnie skorelowane z poziomem ekspresji genu ၢ kazeiny. W regionie tym wiąże się prawdopodobnie inny czynnik transkrypcyjny: C/EPB

• opisano także białka regulujące transkrypcję, swoiste dla gruczołu mlecznego (MPBF, MGF, MAF i PMF)

MGF (Mammary Gland-specific Nuclear Factor)

• najlepiej poznany czynnik specyficzny dla gruczołu mlecznego; po raz pierwszy zlokalizowany w promotorze ၢ-kazeiny szczura, następnie w genach różnych kazein myszy, królika, bydła

• MGF wiąże się z dwoma regionami mysiego promotora ၢ-kazeiny w pozycji -80 do -100 i -130 dp -150 (związanie z 1-szych z tych miejsc jest niezbędne do hormonalnej indukcji ekspresji genu)

• w promotorze ၡ_S2 kazeiny bydła występuje w regionie -85 do -95; oczyszczone białko MGF ma masę cząsteczkową od 84-96 kDa

PMF (Pregnancy-specific Mammary Nuclear Factor)

• PMF pełni funkcje represora ekspresji genów białek mleka, pośrednicząc w hamującym działaniu progesteronu na transkrypcję ၢ-kazeiny

• wiąże się w dwóch miejscach promotora ၢ-kazeiny w pozycjach od -9 do +4 i od -364 do -349; czynnik pojawia się w gruczole mlecznym myszy ciężarnych, zanika podczas laktacji

MPBF/STAT5A (Milk Protein Binding Factor)

• wiąże się w 3 miejscach w promotorze owczego genu ၢ-laktoglobuliny (mutacja w tym regionie powoduje znaczne obniżenie ekspresji (pełni więc rolę aktywatora)

• do ujawnienia aktywności tego czynnika niezbędna jest fosforylacja reszt tyrozynowych

• wykazano eksperymentalnie wiązanie tego czynnika do promotora genu WAP; znaleziono sekwencje wiążące MPBF w promotorach genów kazein bydła, świński morskiej, szczura

MAF(Mammary-Cell Activating Factor)

• sekwencje wiążącą specyficzny dla gruczołu mlecznego czynnik MAF wykryto w regionach regulacyjnych retrowirusa MMTV (transformacja nowotworowa)

• czynnik ten odpowiedzialny jest za tkankowo-specyficzną ekspresję genów

Glikokortykoidy

• są jednymi z ważniejszych regulatorów ekspresji genów białek mleka

• w komórkach gruczołu mlecznego występują swoiste receptory dla glikokortykoidów (ich stężenie zmienia się w trakcie ciąży i laktacji)

• przypuszcza się, że działanie hormonów steroidowych na ekspresję genów może zachodzić pośrednio, z udziałem innych czynników transkrypcyjnych

• liczne sekwencje potencjalnie wiążące receptor glikokortykoidowy (GR) znaleziono w obszarze od -231 do -71 promotora mysiego genu WAP oraz -250 do -79 promotora genu kazeiny ၢ

Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów białek mleka

• czynnikiem wpływającym na ekspresję genów białek mleka jest także struktura chromatyny

• zidentyfikowana wiele białek posiadających zdolność „rozluźniania” chromatyny (wzajemne oddziaływania białko/białko)

• w stanie aktywnym istnieje współdziałanie pomiędzy białkami STAT5, GR, C/EBP

• w stanie nieaktywnym (represja) współdziałają białka LIP (ang. liver-enriched inhibitory protein) i YY1 - białko odwracające proces acetylacji histonów; następuje represja transkrypcji.

Prolaktyna

• Głównym hormonem wpływającym na ekspresję genów białek mleka jest prolaktyna (zbudowana ze 197-199 aminokwasów)

• PRL Odgrywa kluczową rolę w zapoczątkowaniu i podtrzymywaniu laktacji, odpowiada za syntezę głównych składników mleka (białek, laktozy i tłuszczów)

• Gen prolaktyny (PRL) ulega ekspresji głównie w przysadce mózgowej oraz w gruczole mlecznym (mRNA genu PRL są obecne również poza laktacją)

• W regulację ekspresji genu PRL zaangażowany jest czynnik transkrypcyjny Pit-1. W części promotorowej genu PRL zlokalizowano miejsca wiązania dla Pit-1 (2 w części proksymalnej promotora oraz jedno w części dystalnej - w obrębie wzmacniacza transkrypcji - w pozycji -1580/-1720)

• Prolaktyna wpływa na ekspresję genów poprzez receptory ulokowane na powierzchni komórek

• Ten mechanizm działania zakłada istnienie wewnątrzkomórkowego przekaźnika lub przekaźników

• Prolaktyna, główny hormon laktogenny, stymuluje wszystkie etapy ekspresji genów białek mleka

• Gen PRL zbudowany jest z pięciu eksonów, przedzielonych czterema intronami; obejmuje 10 kpz (u bydła leży na chromosomie 23). W genie PRL bydła wykazano istnienie kilku miejsc polimorficznych

• opisano RFLP/AvaII (insercja / delecja 200 pz) - badania nad wpływem tego polimorfizmu na cechy użytkowe bydła mlecznego wykazały, że bardziej pożądany w doskonaleniu cech mleczności wydaje się być allel delecyjny (1,15 kpz) niż insercyjny (1,35 kpz)

• w części promotorowej genu prolaktyny wykryto cztery allele (technika PCR-SSCP) - u bydła HF: B, C, i D oraz allel A - w populacji bydła australijskiego

• w nowszych badaniach (Klauzińska, 2001) wykazała istnienie pojedynczych substytucji w części promotorowej genu PRL (w miejscu potencjalnego wiązania czynnika transkrypcyjnego C/EBP), wskazując, że genotyp PRL nie ma bezpośredniego wpływu na poziom prolaktyny w krwi obwodowej, ale we współdziałaniu z innymi czynnikami (poziom podstawowy hormonu), istotnie modyfikuje sposób jego uwalniania do krwi

• innym miejscem polimorficznym w genie PRL jest ekson III (substytucja AႮG w kodonie dla aminokwasu 103) - miejsce polimorficzne dla enzymu RsaI

• Chung (1996) - osobniki AA produkowały więcej mleka o wyższej procentowej zawartości tłuszczu niż osobniki o genotypie BB. Dla kontrastu, Chrenek (1999) nie wykazali (Brown Swiss) istotnego wpływu genotypu PRL/RsaI na mleczność

• Dybus (2001) - najwyższa wydajność mleka, tłuszczu i białka: PRL/RsaI (AB), najwyższa % zawartość białka: PRL/RsaI (AA).

• Brym i wsp. (2005) najwyższa wydajność mleka u krów o genotypie AB, krowy o genotypie BB - najwyższa zawartość tłuszczu (%) w mleku

Hormon wzrostu

• Hormon wzrostu to białko o masie 22-kDa wydzielane przez część gruczołową przysadki mózgowej. Składa się ze 190/191 aminokwasów (alanina/fenyloalanina na N-końcu; alternatywne przekształcanie białka prekursorowego w czasie wydzielania). Inna opisana różnorodność bGH to substytucja leucyna/walina w pozycji 127 białka.

• Uwalnianie somatotropiny z przysadki mózgowej regulowane jest przez somatoliberynę (wzmożona sekrecja) oraz somatostatynę (działanie hamujące)

• Jedną z głównych funkcji GH jest regulacja postnatalnego wzrostu kręgowców za pośrednictwem IGF-I. W czasie laktacji sekrecja GH z przysadki mózgowej jest wzmożona. Przypuszcza się, że bGH może zwiększać ilość lub aktywność komórek gruczołu mlecznego (powodując wzrost całkowitej syntezy mleka)

• Podawanie egzogennego GH powoduje zwiększenie mleczności krów od 10 do 45%, wzrost całkowitego mRNA w gruczole mlecznym (w tym dwóch enzymów zaangażowanych w przemiany tłuszczowe: karboksylazy acetylo-CoA i syntazy kwasów tłuszczowych)

• Egzogenny GH zmienia ekspresję genu kodującego białko transportujące glukozę, ułatwiając dostarczanie tego składnika do gruczołu mlecznego.

• Istotną rolę w utrzymywaniu prawidłowej laktacji wywierają hormony tarczycy; krowy w czasie laktacji często wykazują niedoczynność tarczycy (zmniejszona koncentracja jodotyronin oraz wyższa koncentracja tyreoliberyny)

• Przypuszcza się, że bGH z alaniną na N-końcu (191 aa) i leucyną-127 bardziej pobudza wydzielanie IGF-I niż inne warianty bST.

• Obecna wiedza o biologii laktacji wskazuje na to, iż genetycznie lepsze zwierzęta różnią się od zwierząt mniej wydajnych głównie w regulacji wykorzystania składników pokarmowych, a kluczową rolę w wykorzystaniu tych składników pełni GH. Prowadzona przez wiele lat selekcja w kierunku zwiększenia wydajności mleka krów doprowadziła do równoczesnego zwiększenia zawartości bGH w surowicy krwi.

• Gen hormonu wzrostu bydła zlokalizowano (przy zastosowaniu hybrydyzacji in situ) w chromosomie 19. Zbudowany jest on z pięciu eksonów, które przedzielone są czterema intronami.

• Krowy mleczne otrzymujące rbST-V₁₂₇ wykazywały większy przyrost wydajności mleka (2kg/dzień) niż rbST z leucyną₁₂₇ (genotyp bST może wywoływać zmienność w poziomie mleczności; allel V₁₂₇ wyższa produkcja mleka)

• Aminokwas 127 zlokalizowany jest na końcu trzeciej ၡ-helisy (region pomiędzy 120 a 140 aminokwasem bST wykazuje działanie laktogenne i somatogenne). Chociaż region ten nie bierze bezpośredniego udziału w wiązaniu bGH z receptorem, jednak oddziaływania pomiędzy czterema ၡ-helisami wpływają na strukturę przestrzenną cząsteczki białkowej.

Polimorfizm genu hormon wzrostu bydła

• w bydlęcym genie GH zlokalizowano istnienie wielu miejsc polimorficznych. W części promotorowej wykryto istnienie sześciu substytucji oraz jedną w pierwszym intronie (niektóre z miejsc polimorficznych pokrywają się z potencjalnymi miejscami wiązania czynników transkrypcyjnych). Ponadto, w części promotorowej genu GH (9 nukleotydów od kasety TATAAA) wykryto ponadto delecję ^-35AAG^-33 (polimorfizm ten obserwowano dotychczas u ras mięsnych).

• wcześniejsze badania (metoda RFLP) ujawniły polimorfizm dla enzymów BglI, BamHI, EcoRI, PstI, PvuII i TaqI (we wszystkich przypadkach spowodowany był insercją/delecją fragmentu DNA długości 1 kpz w regionie 3' genu)

• zastosowanie hybrydyzacji Southerna (z sondą cDNA bGH ) wykazało istnienie miejsca polimorficznego dla enzymu MspI. Polimorfizm ten zlokalizowano w III intronie w pozycji 1547 (tranzycja CႮT albo insercja tyminy i transwersja CႮG)

• Lucy i wsp. (1991) wykazali istnienie miejsca polimorficznego w V eksonie bGH (zamiana nukleotydów CႮG w pozycji 2141 genu - zamiana kodonu CTG na GTG - substytucja leucyny przez walinę w produkcie białkowym.

• W innych badaniach opisano inny polimorfizm w V eksonie w pozycji 2241 (transwersja AႮC). Substytucja nie powoduje zmiany aminokwasu w bST; zmieniona sekwencja nukleotydowa umożliwia oznaczanie polimorfizmu metodą PCR-RFLP (enzym restrykcyjny DdeI). Ponadto, w części 3' genu GH w pozycji 2637 wykryto polimorfizm dla enzymu restrykcyjnego HaeIII)

• W populacji bydła japońskiego wykazano istnienie dodatkowego miejsca polimorficznego CႮT w 172 kodonie genu (zamiana treoniny na metioninę w białku)

• Lucy i wsp. (1993) krowy HF o genotypie LL produkowały więcej mleka niż osobniki LV

• Lee i wsp. (1996) wykazali, że selekcja w kierunku wysokiej wydajności nie spowodowała zmian we frekwencjach alleli GH^L i GH^V. Wartość genetyczna selekcjonowanych krów była negatywnie skorelowana z występowaniem wariantu GH^V (wytłumaczeniem obserwowanych różnic pomiędzy osobnikami o genotypach Leu₁₂₇/Val₁₂₇ jest prawdopodobieństwo istnienia sprzężenia z wariantem Leu₁₂₇ innych genów odpowiedzialnych za wzrost ilości wytwarzanego przez krowy mleka)

• Sabour i wsp. (1997) sugerują, że allel GH^V jest bardziej pożądanym allelem tego genu w doskonaleniu cech użytkowości mlecznej w zakresie ilości oraz składu mleka

• Chrenek i wsp. (1999) w badaniach na krowach Brown Swiss wykazali wyższą zawartość tłuszczu (4,77%) i białka (3,55%) u krów LL w porównaniu do krów VV (4,41% i 3,37%).

• Dybus (2002) wykazał, że krowy LL produkowały więcej mleka, tłuszczu i białka niż LV.

• Hoj i wsp. (1993), Falaki i wsp. (1996), Dybus (2001) wykazali wyższe frekwencje wariantu MspI(-) genu GH u krów o wysokiej zawartości tłuszczu w mleku

• Lagziel i wsp. (1996, 1999) wykazali, że allel MspI(-) warunkuje wyższą wydajność oraz procentową zawartość białka w mleku krów HF

• przeciwstawne wyniki prezentował Yao i wsp. 1996 , wskazując na wariant MspI(+), jako bardziej pożądany w doskonaleniu cech użytkowości mlecznej bydła

Czynnik transkrypcyjny Pit-1 (POUF1)

• czynnik transkrypcyjny Pit-1 należy do rodziny czynników transkrypcyjnych POU (Pit, Oct, Unc) regulujących rozwój ssaków; geny należące do tej rodziny posiadają fragment kodujący powstawanie domeny POU (rejonu wiązania DNA)

• białko Pit-1 posiada masę cząsteczkową około 33 kDa, łączy się ze specyficznymi sekwencjami w częściach promotorowych genów wpływając na ich transkrypcję.

• Pit-1 aktywuje ekspresję genów prolaktyny (PRL) oraz hormonu wzrostu (GH), a także wpływa na różnicowanie oraz proliferację komórek przysadki mózgowej

• w czasie rozwoju ekspresja genu PIT1 poprzedza ekspresję genów GH i PRL w komórkach somatotropowych i laktotropowych, i wydaje się być głównym aktywatorem ekspresji genów prolaktyny i hormonu wzrostu w tych typach komórek

• zahamowanie syntezy czynnika Pit-1 prowadzi do znacznego obniżenia poziomu PRL i GH oraz drastycznego spadku proliferacji linii komórkowych syntetyzujących prolaktynę i somatotropinę

• wykazano, że tkankowo-specyficzny czynnik transkrypcyjny Pit-1 zdolny jest do wzmacniania ekspresji genów zaangażowanych w inicjację cyklu komórkowego, co mogłoby wskazywać na to, iż mechanizm ten pozwala na zwiększanie proliferacji komórek somatotropowych i laktotropowych

• w badaniach Chung i wsp. (1998) zaobserwowano zwiększony poziom mRNA genu PIT1 w odpowiedzi na podawanie GHRH (rola we wczesnej ekspresji genu hormonu wzrostu

• gen PIT1 zlokalizowano w regionie centromerowym chromosomu 1 bydła, pomiędzy markerami TGLA57 i RM95

• w genie PIT1 zidentyfikowano polimorfizm RLFP/HinfI (mutacja punktowa GႮA w szóstym eksonie genu). Mutacja nie powoduje substytucji aminokwasu w produkcie białkowym (wykryto ponadto polimorfizm w V intronie - SSCP)

• wpływ polimorfizmu genu PIT1 na cechy użytkowe bydła jest słabo udokumentowany (Renaville i wsp. (1997) wskazywał, że PIT1^A wpływał na podwyższenie wydajności mleka i białka, obniżenie procentowej zawartości tłuszczu w mleku krów, jak również istotnie wpływał na zwiększenie wymiarów ciała krów)

• Zwierzchowski et al. (2003) showed that both genotypes with allele A at the PIT1 locus positively affected all milk production traits studied. The AB genotype was superior for the milk yield and for daily yield of all milk components, while genotype AA was shown to positively affect their concentrations

• Dybus i wsp. (2004) nie wykazali wpływu polimorfizmu genu PIT1 na cechy uzytkowości mlecznej bydła czarno-białego

Somatoliberyna (GHRH, GRF)

• GHRH jest hormonem podwzgórzowym, który stymuluje syntezę oraz sekrecję przysadkowego GH (za pośrednictwem receptorów GHRHR obecnych na somatotropach)

• sekwencja aminokwasowa GHRH człowieka jest zbliżona do GHRH świni (93% homologia), bydła (88%) i owcy (86%). Wyizolowane z podwzgórza bydlęce białko GHRH składa się z 44 aminokwasów

• wykazano, że GHRH wpływa na regulację ekspresji genu GHRHR w przysadce mózgowej, powoduje wzrost stężenia endogennego GH w surowicy krwi bydła, zwiększając średnie oraz pulsacyjne uwalnianie bST (zwiększając produkcyjność mleczną krów

• podawanie rGHRH powoduje wzrost mRNA i białek enzymów kluczowych w przemianach tłuszczowych (karboksylazy acetylo-CoA i syntazy kwasów tłuszczowych), przy jednoczesnym obniżeniu ich zawartości w tkance tłuszczowej

• gen GHRH człowieka składa się z pięciu eksonów obejmując około 10 kpz; bydlęcy gen GHRH zlokalizowano w chromosomie 13

• Moody i wsp. (1995) wykazali istnienie RFLP/HaeIII bydlęcego genu GHRH; autorzy zasugerowali korzystny wpływ rzadkiego allelu A na cechy mleczności bydła HF

• Dybus (2001) wykazał wpływ polimorfizmu GHRH/HaeIII na % zawartość tłuszczu w mleku krów czarno-białych (4,5% genotyp AA / 4,0% genotyp BB)

• podobne tendencje zaobserwowano u rasy Jersey (Dybus i wsp. 2005 w druku)

38

---