Inżynieria genetyczna - kurs podstawowy
Prowadzący: dr hab. Andrzej Mazur
Wymiar: 45 godz. (15 godz wykład, 30 godz. lab), 3,5 p.
Semestr: V
Wymagana: zaliczone kursy genetyki i biochemii
Rozliczenie: zaliczenie z ocenią liczoną do średniej - test
Program:
Narzędzie słuzące rekombicaji DNA in vitro
nzymy stosowane w rekombinacji in vitro: restryktazy, polimarazy, ligazy, enzymy modyfikujące DNA. Elektroforeza DNA w żelach agarozowych i poliakrylamidowych. Klonowanie genów: wktory, łeńcuchowa reakcja polimerazy (PCR), metody wprowadzanie DNA do komórek bakterii, drożdży, roślin i ziwerząt. Rekombinacja DNA: identyfikacja i selekcja zrekombinowanych genów w biorcach
Literatua
1. Brown, T.A. Genomy, PWN 2009
2. Piotr Węgleński Genetyka molekularna PWN 2006
3. Markiweicz Z. Biologia molekularna bakterii, PWN 2006
4. Szala, S. Terapia Genowa. PWN 2003
5. Kofta, W. Podstawy inżynierii genetycznej. Prószyński i S-ka 1999
6. Gajewski, W. Węgleński, P. Inżynieria genetyczna. PWN 1986
7. Primrose S.B. Zasady analizy genomu. Przewodnik do mapowania i sekwencjonowania DNA różnych organizmów. WNT 1999;
8. Sambrook, J. Fritsch, E.F. Maniatis T, Molecular Cloning, A Laboratory Manual;
9. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press 1999
www.dnai.org
inżynieria genetyczna kurs podstawowy
skrypty do ćwiczeń, materiały do wykładu, etc.
Endonukleazy restrykcyjne - molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna - nauka o technikach badawczych pozwalających na ingerencję w material genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki określonych genw oraz zmiany ich właściwości dziedzicznych
Nie należy utożsamiać inzynierii genetycznej z biotechnologią
Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmuące wszlkie menipulacje żywymy organizmami (zwłaszcza mikrooganizmami) w celu osiągnięcia okreslonych korzyści.
Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 40 lat, biotechnologia od niepamiętnych czasów
Współczasena biotechnologia opiera się w dużej mierze na technikach inżynierii genetycznej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i pdorukcja zrekobminowanej nsuliny w bakteriach
Transfer genu insuliny
Tneimy plazmid enzymem restrykcyjnym, dodajemy ludzie cDNA do plazmidu (łączenie przez linkerowe DNA, zrekombinowany lasmid, transformacja bakterii, klonowanie genu
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzie molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w probówce).
Najważniejsze z nich to:
- enzymy restrykcyjne,
- ligazy,
- wektory
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja zrekombinowanej insuliny w bakteriach
1869 - odkrycie DNA (Miescher)
1944 - funkcja DNA: przechowywanie informacji genetycznej (Avery)
1953 - podwójna helisa - odkryce struktury DNA (Crick, Watson)
1955 - Arthur Kornber wyizolował polimerazę DNA
Odkrycie enzymów restrykcyjnych
1962r. - Arber i Dussoix - wyjaśnili zjawisko restrykcji - ograniczenia orzowju fagów w E.coli. Zidentyfikowali endonukleazę, która trawiła niechroniony (o inym wzrocłó metylacji)DNA. Metylacja charakcterystyczna dla gospodarza bakteryjnego chroniał DNA przed restrykcją.
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w inżynierii genetycznej i molekularnej
Enzymy restrykcyjne (ER)
- pod względem biochemicznym są endonukleazami - przecinają szkielet fosfocukrowy w DNA
- ER działają na określone sekwencje w DNA (miejsce rozpoznania): żeby sttrawić DNA enzym restrykcyjny musi „zobaczyć” określony ciąg liter
- Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III
Główne różnice pomiędzy klasami enzymów ER dotyczą:
* wzajemnej lokalizacji systemu restykcji i metylacji DNA
W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu nzymatycznego złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych podjednostek, w II są rozdzielone
* lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA
* enzymy poszczgólnych klas różnia się także wymaganiami co do kofaktorów
Endonuklazay restrykcyjne I klasu
- aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji na tym samym białku
- substratem jest dwuniciowy DNA (dsDNA) zawierający określoną sekwencję - miejsce rozpoanania
Enzymi klasy I
Endonukleazy restrykcyjne III klasy
- substratem jest dsDNA
- aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku
- rozpoznają asymetryczne miejsca 6-7 nukleotydowe
Endonukleazy restrykcyjne II klasy
- posiadają rozdzielona aktywność restryktazy i metylazy, ich geny zwykle siąsiaduja w genome
- substratem jest dwuniciowe DNA - dsDNA (nieliczne enzymy mogą przecinać określone sekwencje w jiednonicowym ssDNA).
- w większości przypadków enzymy typu II trawią obywada pasma DNA w obrębie miejsca rozpoznania 0 którekitje sekwencji (4-13 nukleotydów)
Większość enzymór restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpzoanania, choć nieliczne wymagają metylacji
- do aktywnośc in vitro bezwględnie wymagają jonów magnezu
Trawienie DNA zachodzi tylko w specyficznym miejscu
BamH1 plus DNA (TATGGATCCATA) - na specyficznym odcinku enzym może się dopaswać i przeciąć
Większość enzymw restrykcyjnych wiaże się do sekwencji palindromowych jako dimery
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II
- większość miejsc rzpoznania jest ścislym palindromem z symetrią rotacyjną
- ma długość 4,5,6,7,8 nt
- niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt np. Sfi i GGCCNNNNNGGCC
Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA
np.: (zakładając że G + C = 50%)
enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok 65 kpz (służą np. do konstrukcji bibliotek genomowych)
z 6nt sekwencią rozpoanania tną DNA co 4096 bp (4^6) (wygodne do klonowania genów)
4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (4^4) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA - fingerprinting)
Enzymy rzadkotnące:
- rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.:
SapI 5'-GCTCTTC-3'
Sgf1 5'-GCGATCGC-3'
- enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT
SmaI rozpoznaje 5'-CCCGGG - 3' trawi co 78 kb;
NotI rozpoznaje 5'-GCGGCCGC - 3' trawi co 10 MB
Niktóre enzymy pochodzące z różnych bakterii rozpoznają identyczne sekwencje, są to tzw. izoschizomery i mogą przecinać te sekwencje w dokładnie taki sam sposób
Neoizoschizomery - enzymy rozpoznające taką samą sekwencje ale przecinające ją w inny sposób.
Przykłady
SmaI 5'...CCC'GGG...3'
XMaI 5'.. w innym miejscu tnie
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne końce DNA
Lepkie końce mogą być róznej długosć (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą być taże 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmiernści typu 5' lub 3', w zależności do użytego enzymu restrykcyjnego.
BamH1 - nadmierności typu 5'
Kpn1 - nadierności typu 3'
Moga też tworzyć tępe końce
Jeśeli lekpkie końca są ze sobą komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo polączyć niezależnie od pochodzenie DNA, tworząc formy rekombinacyjne
Możemy łączyć ze sobą również końce tępe ale jest to troche trudniejsze
Enzym tnie obie nici DNA po tej samej stronie, razem z obcym DNA
Frgamenty DNA łączą się z lepkimi końcami
BamHI
5'-G^CATCC-3'
3'-CCTAG^G^5'
nie izoschizomery ale dają komplementarne lepkie końce, może je połączyc i żaden enzym restrykcyjny już nie przetnie
Użycie ER in vitro
Czynniki wpływające na aktywnośćenzymór restrykcyjnych
Skład buforu:
- enzymy mają różne prefernecje jeśli chodzi o siłę jonową (stęż. soli) i kationy (Na lub K). Zwykle pracują w pH 8.8. Bufory są zwykle dostarczane razem z enzymem przez producenta. Źle dobrany bufor powoduje albo brak trawienia albo tzw. częściowe trawienie.
- można trawić równoczście kilkoma enzymami dobierając pośrednie warunki reakcji
Bufor do przechowywania:
Tris-EDTA, DTA jest inhibitorem działania enzymór restrykcyjnych, ale nie w stężeniach poniżej 0,005 mM
Temperatura inkubacji:
Większość enzymór pracuje w 37C, u psychotrofilii niżej, u ermofili wyżej
Na wydajność trawienia duży wpływ ma czystość DNA:
kontaminacja solami (np. z innych buforów - ważne przy wielokrotnych trawieniach), inhibitory, nukleazy mogą powodować trawienie częściowe lub jego kompletny brak DNA
Rodzaj użytego DNA
Aktywność gwaździsta (star activity, relaxation of specificity - rozluźnienie specyficzności)
Enzym w niestandardowych warunkach tnie DNA w miejscacj innych niż miejsce rozpoznania, np.
BamHI (GGATCC) może trawić sekwencje: NGATCC, GPuATCC, GGNTCC
Niestandarwode watunki
- nieoptymlany bufor
- za mało DNA w stosunku do enzymu
- za długa inkubacj, eyc
Zastosowanie enzymór restrykcyjnych
1. Izolacja wybranych fragmentów DNA (np. genów)
2. Rekombinowanie DNA in vitro i klonowanie genów
3. Mapowanie fizyczne genomów
4. Diagnostyka (np. chorbów) i identyfikacja (np. ustalanie pokrewieństwa)
Zastosowanie enzymów w diagnostyce chorób genetycznych
Analiza polimorfizmu DNA
RFLP - restriction fragment lenghtpolymorphism. Różnice w dłg. freagmentów restrykcyjnych tworzonych po cięciu DNA restryktazami II typu.
Wykrywa się głównie przez trawienie DNA amplifikowanego w reakcji PCR, podobny wzór cięcia
Wykrywanie mutacji przy pomocy enzymów restrykcyjnych
np.: anemia sierpowata
Nrmalny gen globiny Zmutowany gen globiny
CTGAC CTCTC
CACTC GACAC
Trawienie enzymem DdeI → elektroforeza agarozowa
Dwa framenty o dłg: Jeden dłuższy fragment
Elektroforeza kwasow nukleinowych
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja zrekombinowanej insuliny w bakteriach
Transfer genu insuliny
tniemy plazmid enzymami restrykcyjnymi - dodajemy cDNA, łączymy linkerem → otrzymujemy zrekombinowany plazmid - namnażamy go z bakteriach
Elektroforeza
- jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować częsteczki DNA i jest stosunkowo czuła
(po odpowiednim wyberwieniu żeu jesteśmy w stanie zobaczyć ng DNA)
- jest techniką rozdzielania fragmentów DNA
Podział technik elektroforezy DNA
- agarozowa (horyzontalna)
* w stałym polu elektrycznym - to będziem często robić, technika podstawowa
* w stałym polu (PFGE)
- akrylamidowa (wertykalna)
* denaturująca
* niedenaturująca
- elektroforezę w żelu aarozowym stosuje się do rozdzielania dużych cząsteczek DNA
- elektrofoerzę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania małych fragmentów DNA
- elekroforeza DNA w żelu agarozowym w stałym polu elektrycznym jest rutynową techniką wizualizacji DNA i RNA
Funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego, gdzie negaywnie naładowane cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym w kierunku anody; krótsze wędrują szybciej, dłuższe - wolniej
Fragmenty DNA → idą przez pory między cząsteczkami żelu
Elektroforeza agarozowa
Agaroza jest naturalnym polimerem izolowanym z krasnorostow
Zalety elektroforezy agarozowej
- duży zakres rozdzielanych fragmentów DNA od kilkuset z do 40 kpz (w elektroforezie w stałym polu) i Mpz (w zmiennym polu elektrycznym)
- łatwość przygotowania żelu i elektroforezy
- jest nietoksyczna
Wady
- mała zdolność rozdzielcza żeli agarozowych
- agaroza jest stosunkowo droga.
Zestaw do prygotowania żelu agorozowych i elektroforezy
- nalewanie roztworu agarozy w buforze, wkładamy grzebień,
- nakładami probek do studzienek po zastygnięciu
- podłączami prąd, po dwudziestu minutach mamy
Przygotowanie probek
roztwór DNA miesza się z buforem próbkowym, który zagęszcza DNA (nie wypływa zestudzienek) pozwala obserwować migrację DNA
Barwienie żeli agarozowych
Bromek etydyny (EB) jest używany najczęściej, lecz jest silnie mutagenny. Należy unikać barwienia żelu przed elektroforezą (tzn. barwnik dodany do agarozy lub do buforu). Daje dość silne tło i żele powinno się odbarwiać przed archiwizacją.
SYBR Green, SYBR Gold bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko alkalicznych warunkach, WADA!!! - drogi.
GelRed bardziej czuły na małe ilości DNA niż EB.
Czynniki wpływające na stopiń migracji DNA w żelu agarozowym
Wielkość cząsteczki - dsDNA liniowe migruje w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do ilości par zasad (odwrotnie proporcjonalna do log10 z masy cząsteczkowej).
Konformacja DNA - superzwinięta kolista forma (CCC), otwarto kolista (OC) i liniowa (LIN) forma migrują w żelu z rózną szybkością. Wzglęðna ruchliwość tych form zależy od stęż. agarozy, natężenia pądu, siły jonowej buforu i gęstości superskrętów formy CCC. Najleiej dla odróżnienia form stosować odpowiednie markery (zwykłe plazimy i fragmenty DNA)
- najszybciej CCC, potem LIN, najwolniej OC
Nie można określić wielkości kolistej cząsteczki DNA porównując jej drogę migracji z liniowym DNA o znanej wielkości!!!
koliste mogą być mniejsze od liniowych, a migruje wolniej
koliste mogą być porównywane z kolistymi, a liniowe z liniowymi.
- stężenie agarozy - jest liniowa zależność midzy logarytmem mobilności elektroforetycznej DNA (µ) i stężeniem żelu (gamma) wg równania:
logµ = logµ0 - Kr gamma
gdzie µ0 jest swobodną ruchliwością DNA i Kr jest współczynnikiem opóżnienia, czyli stałą związaną z własnościami żelu oraz wielkością i kształtem cząsteczek.
Zakresy 0,5 - 2%, im bardziej stężony żel, tym lepiej rozdzielą się małe fragmenty, im mniej stęzony, tym lepiej duże fragmenty.
- obecność bromku etydyny w żelu i buforze
Interkalacja bromku etydyny powoduje spadek łdunku negatywnego w dsDNA i wzrsot sztywności i długości DNA. Stopień migracji jest opóżniony o około 15%.
Napięcie prądu - w niskim napięciu, stopień migracji liniowych fragmentów DNA jest proporcjonalny do zaaplikowanego napięci. W Wyższym napięciu mobilność wysoko-cząsteczkowych fragmentów nie jest proporcjonalna do napmięcia.
Skład buforu do elektroforezy - w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno, w buforach o zwbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku powoduje wuedzilanie
Markery wielkości
Konwencjonalne oparte na DNA plazmidów i fagów.
plazmidowe DNA albo genom faga np. lambda, podzielone na określone fragmenty, następnie porownujamy z badanimi fragmentami
tzw. drabinki (ladders)
bardzo regularny rozklad prazków, co 50-500 pz
Izolacja DNA z żeli agarozowych
- zestawy do izolacji DNA z żelu oferowane przez firmy np. perełki szklane. DNA jest adsorbowane na silikonowych perełkach z rozpuszczonej agarozy w wysokim stęż. soli, a eluowane w niskim stęż. soli
- można też używać agarozy, które topi się i tężeje w niższej niż standardowa temperaturze (LMP - low melting point)
Agaroza, która została zmodyfikowana przez hydroksymetylację, które radukuje ilość wiazń wodorowych,ma niższą temp. topnienia i żelowania
Elektroforeza pulsacyjna - PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis)
Fragmenty dsDNA powyżej krytycnej wielkości ~40 kb migrują w żelu agarozowym ze stałą szybkością, niezależną od wielkości. Z tego powodu nie można ich rozdzielić w stałym prądzie na horyzontalnych żelach.
PFGE jest elektroforezą, w której pole elektryczne jest okresowo zmieniane co ozwala na rodział cząsteczek DNA do wk. rzędu Mpz. Rodział następuje ponieważ czase wymagany do zmiany kierunku migraci dla cząsteckzki DNA zależy od jej wielkośći w zmiennym polu elektrycznycm. Krótsze cząsteczki mogą szybciej reorientować się (tzn. zmieniać konformację i powracać do stanu pierwotnego) niż dłuższe i dlatego węrdują w żelu z większą szybkością. Dłuższe cząsteczki większość czasu potrzebują na reorientację w zmieniającym się napięciu pola niż na migrację. Różnica w czasie reorientacji jest tym czynnikiem, który decyduje o rozdzieleniu się fragmentw DNA o wlk. powyżej 40 kb.
CHEF - Cantour-Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis - elektrforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciokąta foremnego
możemy dzięki temu bardzo dowolnie manipulować kątem i kireunkiem pola elektrycznego, kąt może sięgać nawet 120 stopni, → jeszcze większa potrzeba czestej reorientacji - rodzieleanie jeszcze większych cząsteczek.
zestaw do elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym
- komora do elektroforezy
- zaprogramwany zasilacz
- chiller (chłodnica)
- pompa
Przygotowanie próbek
PFGE wymaga nieuszkodzonego DNA ponieważ każde uszkodzenie spodowujezmianę wyglądu prążków.
Najpierw umieszcza się bakterie lub inne komórki w agarozie, a następnie trawi sięjeenzymami litycznymi, co nie narusza DNA. DNA następnie można trawic enzymami restrykcyjnymi. Tak przygotowany peparat jest przycinany do odpowiedniej wielkości, wkładany do wejścia w żelu agarozowym izaklejamy agarozą.
Enzymy restrykcyjne w PFGE
Wybiera się enzymy, które:
- tną DNA rzadko np. rozpoznają 8-nukleotydowe sekwencj
- w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par GC (jest rzadko spotykany u Eukaryota)
- w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par AT (mogą być rzadsze u Prokaryota).
markerami w PFGE są albo kontakatemety DNA faga lambda (50 kb), albo chromosomy S. cerevisiae (200-2000 kb)
Zastosowanie PFGE
- rozdzielanie cząsteczek DNA w zakresie 50 kpz - 10 Mpz
Izolowane fragmenty mogą być użyte do klonowania
- konstrukotwanie mam prestrykcyjnych calych genomów bakterii oraz dużych regionow genomów eukariotycznych
- identyfikacja genomów w tzw. epidemiologii molekularnej.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Polimer akrylamidu może służyć do rozdziełu dsDNA issDNA według wielkości i konformacji. Żele poliakrylamidowe mają trzy główne cechy korzystniejsze niż żele agarozowe:
- ich zdolność rozdzielcza jest tak duża, że mogą rozdzielać cząstezki różniące się długością równą 0,1% (tzn. 1 b w 1000 b);
- można rozdzielać większe ilości DNA - można rozdzielać do 10 µg DNA w jednej ścieżce (1cm x 1 mm) bez utraty zdolności rozdzielczej
- DNA odzyskane z żelu akrylamidowego jest bardzo czyste (metodami podobnymi do odzyskiwania z agarozy) i można go używać np. do iniekcji zarodków mysich.
Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów jakie tworzy olimer, a to zależy od stężenia akrylamidu i N.N' - metylenbisakrylamidu oraz od szeregu innych czynników jak natężenie prądu czy grubość żelu
Zakres stężenia akrylamidu to 3,5% - 20%,w którym dzieli się fragmenty 6-2000 pz
Stosunek bisakrylamidu do akrylamidu wynosi 1:30
Żele akrylamidowe nie mogą być barwione przed elektroforezą,
Rodzaje żeli ekrylaminowych w elektroforezie DNA:
Żele denaturujące służą do rozdzielania i oczyszczania ssDNA lub RNA. Te żeele są polimeryzowane w obecność mocznika, formamidu lub formaldehydem co hamuje tworzenie par DNA. Zdeneturowany DNA migruje w ych żelach z szybkością niezależną od składu zasad i ich sekwencji. Stosuje się m.in. do rozdziału RNA, izolacji radioaktywncyh sond i do rozdziału produktów reakcji sekwencyjnych.
Żele niedenaurujące są używane do rozdziau i czyszczania dsDNA
Zasadniczo dsDNA migruje w żelach z szybkością odwrotnie proporcjonaln<a do log10 z ich wielkości. Jednakże syzbkość migracji zależy tez od skłądu zasad i fragmenty tej samej wielkości mogą migrować z szybkością różniącą się nawet o 10%. Zwykle służą do preparowania bardzo czystego DNA i do wykrywania interakcji DNA-białko (EMSA - Gel shift Assay)
3. Kombinacje plazmidów i bakteriofagów
fagemidy - fagemid jest wektorem plazmidowym który ma miejsce replikacji z bakteriofaga M13, f1
Bakteriofagi mogą replikować się zarówno dwuniciowo, jak i jednoniciowo
wygląda jak zwykły pazmid, można przestawić go na inne miejsce replikacji, żeby zaczął się replikować jako jednoniciowa cząsteczka DNA
kosmidy - miejsce cos faga lambda wstawione w plazmid - w główce zyskaliśmy pojemność oko 40 000 pz.
Po infekcji komórki, sekwencja wygląda jak plazmid
Fosmidy - specyficzna odmiana kosmidów
- plazmid uzyty do plazmid F - plazmid jednokopijny, niskokopijny, ma bardzo regulowane mechanizmy replikacyne, jest bardzo stabilny i nie pozwala się zgubić.
wprowadzone do niego DNA będzie w niewielkie ilośc kopii i będzie bardzo stabilne.
Białko wyprodukowane w bakterii nie będzie miało modyfikacji potranslacyjnej - podstawników niebiałkowych, ect, może nie być tak samo funkcyjne.
Dlatego stosuje się jako gospodarza organizm eukariotyczny - drożdże.
- możliwość modyfikacji potranslacyjnej
- dobry organizm modelowy - eukariot, ale jednokomórkowy i łatwy w hodowli.
- posiada podzielone geny, transkrypcja i tranlsacja taka sama jak u innych eukariotów
Jeżeli chcemy stworzyć w pełni funkcjonalne białko eukariotyczne to lepiej użyć drożdż
WEKTORY DROŻDŻOWE - wahadłowe, bifunkcjonalne
wahadłowość charakterystyczna dla wektorów eukariotycznych
Dla rodzaje systemów replikacyjnych - typowo bakteryjny i typowo eukariotyczny (drożdżowy)
YAC (Yeast artificial chromosome)
nie wygląda wcale jak chromosom, a plazmid
posiada część prokariotyczną - miejsce nicjacji replikacji, geny oporności, zapewnie replikację prokariotyczną, reszta to część euariotyczna
Po cięciu przybierze postać małego chromosomu drożdżowego (liniowa cząsteczka DNA) - wszystkie elementy pozwalające na trwanie w jądrze komórkowym.
Gen Sup4 pełni taka sama funkcje jak alfa-komplementacja w wektorach plazmidowych - pozwala rozdzielić drożdże,które dostłay wektor pusty i z DNA
- system selekcyjny (już nie może być to opornosc na antybiotyki)
Wektory do komórek ssaczych
- nie jest to system do powielania DNA w kom - można to robić w drożdżowych - jest to system dostarczanai DNA do komórki (w celu jego ekspresji - org transgeniczne, terapia genowa, ekspresja badanego bialka)
- są to wektory wahadłowe (w większości)
- zbudowane na bazie wirusów
System dostarczania DNA → musi być bezpieczny dla pacjenta, nie może przynosić szkody.
Musi dostarczać do komórek DNA specyficznie (do konkretnych tkanek i typów komórek) i stabilnie
Łatwość namnażania i użycia
Duża pojemność
Brak immunogenności - nie powoduje reakcji odpornościowej - biegunki, gorączki, alergii
Obecnie nie ma wektora który spełniałby wszystkie kryteria.
Jak bezpiecznie przerobić wirusa żeby nadawał się do użycia w komórkach eukariotycznych.
Zabrać z niego wszystko co jest mu niepotrzebne na jego etapie rozwoju.
Fragmenty wirusowe cis - muszą zostać
Trans - można wyrzucić, dostarczając tylko produktów tych genów
Retrowirusy
odwrócone powtórzenia - sygnał pakowania wirusa w otoczkę - białka płaszcza, odwrotna transkryptaza, glikoproteiny,
Bezpieczny, dwuskąłdnikowy ukąłd złożony
- pierwszy eement to plazmid w którym są odwrócone powtórzenia i sygnal pakujący - elementy cis wirusa, dostarczamy obcy gen i powielamy w bakterii.
- drugi składnik - linia komórek pakujących - linia kom eukariotycznych hodowanych in vitro, w genomie tych linii komórkowych znajdują się pozostałe geny wirusa, które mu zabraliśmy: gag, pol, env
plazmid z transgenem w bakterii namnażamy - izolujemy plazmid - wprowadzamy do linii komórek pakujących, które na chromosomie mają geny trans - wirus ulega transkrypcji, linia pakująca sytnetyzuje mu białka do spakowania się → spakowany retrowirus nie może się namnażać, ma tylko sekwencję pakującą → geny kodujące białka ma tylko kom linii pakującej, gdzie indziej nie namnoży się → infekcja kom docelowej, wirus przepisze się i zintegruje z genomem komórki docelowej, ale nie namnoży.
modyfikuje się np. HIV - jest w stanie zakażać również komórki, które się nie dzielą.
Adenowirus nie wstawi się do komórki gospodarza, ale może na nią zadziałać - nadaje się do nsizczenia komóek np. nowotworowych ale nie wprowadzania nowych genów.
herpeswirusy - np. Epstein-Barr ma dużą pojemność, z czego mało to geny cis.
niektóre wirusy opryszczki mają duże powinowactwo do neuronów
markery selekcyjne w wektorach eukarotyczne
do selekcji tzw. markery dominujące
antybiotykooporność - odporność na kanamycynę w kom. roślinnych - większość kom roślinnych wrażliwa
neomycyna - gen odporności na neomycynę oprzez gen bakteryjny Neo - sotoswana w kom zwierzecy linii komorkowych.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Zastosowania hybrydyzacji
- znajdowanie genu w plazmidzie
- lokalizacja danego genu na chromosomie i jego sąsiedztwa
Hybrydyzacja - pwstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwnecjach nukleotydów
Hybrydyzacja zachodzi już przy komplementarnych odcinkach długości kilkunastu (17) nt
w hybrydyzacji kwasów nukleinowych mogą pwostawać struktury hybrydowe różnego typu:
DNA-DNA
RNA-RNA - wyciszanei genów
DNA-RNA
Żeby wykorzystać hybrydyzację (jako narzędzie badawcze) należy spełnić przynajmniej dwa warunki:
Sonda molekularna
- wyznakowana znacznikiem (radioktywny lub nie) - uwidocznienie i zlokaliwoanie zhybrydyzwaonej z nim sekwencji
* sondy radioaktywne 32P, 35S, detekcja opiera się na autoradiografii - metoda czuła lecz toksyczna
* sondy fluorescenscyjne, np., rodamina, fluoresceina
* metody immunochemiczne, ctyochemiczne - nukleotyd związany z haptenem (biotyną, digoksygeniną). detakcja przy pomocy przeciwciał specyficznych dl danego haptenu.
Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi cih uwidocznienie czasteczkami: alkaliczną dosfatazą, proksydazą.
Sposoby znakowania sond
- reakcja przesunięcie pęknięć w DNA
polimeraza I E.coli dodaje nukleotydy do wolnego końca 3' OH utworzonego wczśniej w dwuniciowym DNA przez działanie DNazy I. W tym samym czasie, polimeraza I egzonukleolitycznie usuwa nukleotydy od końca 5' pęknięci.
- reakcja przypadkowego startu replikacji
SOndy molekularne możemy uzyskać przez wyznakowanie końców cząsteczek kwasów nukleinowych
- 5' przez przeniesienie grupy fosforanowej z ATP na zdefosforylozwany koniec 5' koniec RNA lub DNA za pmocą np. T4 PNK (Kinazy polinukleotydowej z bakteriofaga T4). Jeżeli ATP jest wyznakowany w pozycji
- 3'
Przygotowanei docelowego DNA (target DNA0, w którym za pomocą sondy molekularnej będziemy szukać komplementarncyh odcinków
Najczęściej wygląda to tak:
- izolacja genomowego DNA
- podział na mniejsze fragmenty
proces przenoszenia DNA z żelu na membranę to „blotting”
1975 Edwin Suthern - „southern blotting”
DNA - cięcie - elektroforeza - przenoszenie na membranę
porowata substancja - bibula- żel- membrana-dociska się bibułą - ściśnięcie - wszystko to wbuforze alkalicznym - trzeba je zdenaturować do cząsteczk ejdnoniciowych, dlatego bufor alkaliczny.
proces trwa kilka dni, trzeba wymieniać bibuły, p kilku dniach mamy DNA
Elektrotransfer - elektroblotting
ujemne DNA idzie do anody
sond molekularna musi być zdenturowana.
Efekt: prążki zawierające poszukwiany gen zabarwiają się dzięku połączeniu z sondą.
1. DNA:DNA - hybrydyzaja Southerna
2. RNA-DNA (lub RNA-RNA) - hybrydyzacja typu northern - badanie poziomu ekspresji genów lub wizualizacji regionów, gdzie zachodzi ekspresja genów
Warunki hybrydyzacaji musząbyć odpowiednio dobrane
- tworzenie hybryd ssDNA lub NA jest odwracalne i zależy od
* długości komplementarnych sekwencji (minimalna długosć 17 nukleotydów)
* stężenia kwasów nukleinowych (dużo DNA lub RNA na filtrze, mało sondy molekularnej)
* temperatury
* siły jonowej
operując tymi parametrami możemy zhybrydyzować nawet fragmenty homooligczne w mniej niż 50%
Hybrydyzacja fluorescencyjna in-situ - FISH - bezpośrednio uwidacznia pzycję markera w cząsteczce DNA np. chromosomie po hybrydyzacji z sondą fluorescencyjną, lub diagnostyka chorób genetycznych
komórka - destamilizacja formamidem genomu - dodajemy sonðe
northern
sonda do krwi szczura, patrzymy w któ¶ymi regionie zacodzi największa ekspresja - np. w wątrobie, nerkach
zastosowanei hybrydyzacji w metodzie screeningu - przeszukwanie klonów bakteryjnych w poszukiwaniu danego genu.
lub gdy daną bakterię transformowaliśmy bankiem genów a szukamy jednego genu w danym klonie komórek
hybrydyzacja kolonijna - na celulozie lub innej membranie tworzymy replikę kolonii bakteryjnych, przyklejamy bakterie do membrany, liza, denaturacja, następnie
PCR - ang. polymerase chain reaction
reakcja łańcuchowa polimerazy → częściowa alternatywa do klonowania molekularnego → polimeryzacja cząsteczki DNA
1. Reakcja replikacji matrycy DNA in vitro
Matryca może pochodzić z dowolnego miejsca w genomie
In vivo - widełki replikacyne, maszyneria enzymatyczna
Jedna nić ciągła, druga w postaci fragmentów Okazaki
Cząsteczka DNA musi się rozplątać - wys. temperatura
Startery - musimy je zaprojektować
komplementarność → przyłączanie starterów do zdenaturowanej nici
Każdy startej się dołącza do innej nici
1 cykl składa się z takich etapów:
- reakcja denaturacji matrycy - 94o - 96o
- dołączanie się zaprojektowanych starterów do komplementarnej doń matrycy - primery doczepiają się - 50o - 56o
- elongacja 72o
Polimerza wydłuża startery - do każdej nici dołączony jeden - powstaje produkt pierwsozrzędowy
Pierwszorzędowe produkty amplifikacji to jeszcze nie są te pożądane, projekty
Produkt drugorzędowy - 1 nić jeszcze nie przypomina produktu pożądanego, druga już tak (?)
W cyklu 3 pojawiają się pożądane produkty i od teraz rosną w postępie wykładniczym - ilość produktu wprost proporcjonalna do ilości cykli
- otrzymujemy naszą cząsteczkę
klonowanie molekularne -częściowo zastępuje klonowanie w plazmidach
3 etapy
- denaturacja (30 s - 5 min, 64-96oC)
- przyłączanie
- wydłużanie
Dobór starteru
Polimerazy DNA
Inicjalnie: polimeraza I E. coli (fragment Klenowa)
nie jest ona jednak termostabilna, trzeba jej dodawać po każdym cyklu
Termostabilne polimerazy DNA z termostabilnych bakterii → obecnie uzyskuje się z rekomninantów, polimerazę Taq namnażamy w E. coli
- nie mają aktywności korektorskiej. częste błędy
- charakterystyczne zakończenie z pojedyńczą adeniną na końcu
Polimeraza Pfu
- jest aktywnośc sprawdzająca - zdolna do powielania genów do późniejszej ekspresji
- produkty mają tępe, równe końce
Polimeraza Tth
- może być odwrotną transkryptazą i zwykłą polimerazą w zależności od kofektora
Mn2+ → odwrotna transkryptaza
Mg 2+ → zwykła polimeraza
dobrze do przepisywania RNA na DNA i RT-PCR → zdolna przepisywać RNA w wys. temp.
Polimeraza Deep Vent
wysoce termostabilna
duża procesywność - możliwość klonowania długich odcinków DNA
Long PCR Enzyme Mix
mieszania polimeraz, np. Taq i Deep Vent do długiego prowadzenia PCR / klonowania dużych framgentów
wystarczy tylko jedna kopia matrycy do powielenia jej fragmentu
Zastosowania:
- powielania DNA do klonowania
- znakowanie fragm. DNA
- cykliczne sekwencjonowanie
- analizy eksperymentalne
- diagnostyka
- identyfikacja genów (RT-PCR)
Hot Spot PCR - poprawia specyficzność aplifikacji
- mieszanka do PCRu znajduje się w lodzie, żeby nie było falstartu
- dodanie polimerazy do mieszaniny na końcu
Asymetryczny PCR
- wymaga tylko jednego startera
- powielana jest jedna nić matrycy
Multipleksowy PCR
- wiele par starterów
klonujemy wiele znanych framgentów DNA naraz
Real-Time PCR
detekcja produktu w czasie rzeczywistym
kolonijny PCR
- matrycą jest kolonia, fragment tkanki
jeżeli zależy nam na szybkości
zdegenerowany PCR - startery są projektowane na podstawie kodowanego przez geny białka (są zdegenerowane)
Mapowanie genomów → badanie genowe organizmu
Przełom XX i XXI w.
2001 - genom człowieka
Genomika - badanie genomu
Genom - całkowite DNA komórkowe
Genomika strukturalna
Genomika funkcjonalna
Strukturalna → uzyskanie kompletnej sekwencji nukleotydowej → fizyczna mapa genowa o największej rozdzielczości → sekwencja nukleotydowa
Funkcjonalna → badania funkcji genomu → korelacja pomiędzy funkcjonowaniem komórki a genomem
Metody wysokoprzepustowe →genomika funkcjonalna → wiele genów naraz jest badanych
Genomika strukturalna
* badanie połączeń pomiędzy genami
* molekularna cytogenetyka
* mapy fizyczne
* sekwencjonowanie, EST
„omiki”
Badanie całego genomu, a nie pojedynczych genów i ich produktów
- globalne spojrzenie na całą komórkę
Jak należy to robić
- poznajemy skład nukleotydów
- transkryptom ( zestawy transkryptów)
- proteom (zestawy białek)
Metody wysokoprzepustowe
1. Transkryptomika
- badanie transkryptów mRNA które pojawiają się w komórce
komórka wyraża konkretne zestawy genów w zależności od stanu fizjologicznego, wieku i funkcji
Badanie transkryptomu jest powiązane z badaniem genomu → informacja o ekspresji w czasie i przestrzeni, informacja o tym które odcinki DNA są genami, etc.
2. Proteomika → zestaw powstających białek
nie każdy transkrypt jest translatowany na białko → z jednego trankskryptu może powstać wiele różnych białek (alternatywny splicing, redagowanie, modyfikacja potranslacyjna), jedno białko, lub wcale nic nie powstać → degradacja RNA, wyciszanie
Proteom → zestaw białek produktowanych w komórce w danym jej stanie fizjologicznym
2 tys. genów
> 1 000 000 białek
Genomika daje nam pełny obraz funkcjonowania żywych komórke i interakcji wewnątrz nich
Porównanie genomów Eukariota i Prokaryota
- wielkość genomu - ilość DNA w haploidalnej komórce - wartość C → constant, characteristic
Im większy organizm, tym większy genom
mikroorganizmy → małe genomy → lecz eukariota mimo że mają większe genomy od prokariota → między sobą ich genomy nie spełniają tej zależności
Paradoks wielkości C → koreluje tylko do pewnego stopnia z wielkością genomu
duży genom =/= złożony organizm
Duży genom = duża ilość materiału genetycznego =/= dużo genów
Genomy mniej złożonych organizmów są bardziej „wyładowane” genami, ponieważ dostępna przestrzeń jest wykorzystywana oszczędniej: geny leżą bliżej siebie, mogą na siebie zachodzić (wirusy)
Genomy prokariotów Genomy eukariotów
- małe - duże
- na ogół koliste, rzadko liniowe - liniowe
- brak centromerów, telomerów - centromery, telomery
- skondensowane geny, brak intronów - mało skondensowane geny, introny
- brak sekwencji powtarzających się - dużo sekwencji powtarzających się
Wraz ze wzrostem złożoności rośnie ilość intronów
Mapowanie fizyczne genomów
- konstrukcja map fizycznych wyskalowanych w jednostkach fizycznych
największą rozdzielczością jest sekwencja nukleotydowa - map mozliwie najlepsza
zajmuje się tym genomika strukturlna
Mapa genetyczna jest niewystarczająca - rozdzielczość zależy tylko od ilości crossing-over; czasami przekłamuje odległość genow, markery muszą być polimorficzne
sposoby podejscia do analizy genomow
- strategia hierarchiczna - robimy cos w okreslonej hierarchii
- strategi shotgun - przypadkowej fragmentacji genomu
wspolnym mianownikem jest to ze musimy rozebrac genom na kawalki, analizowac i poskaldac genom od nowa
do niedawna wydawalo się ze strategia hierarchiczna jest jedynie sluszna w przypadku zlozonych genomow, a przypadkowa fragmentacja nadaje się do gnomow bakteryjnych
teraz już się tak nie uwaza
wszystkie nowoczesne technologie sewkencjonownie next-generation to raczej shotgun
strategia hierarchiczna przestale mieć glowne znaczenie, chociaz z jej uzyciem poznalismy genom czlowieka i wielu organizmow modelowych
kontig klonow - strategia hierarchiczna
dzielenie genomu na mniejsze czesci - dziesiątki lub setki tys pz - zrobimy z nich biblioteke genomowa (wstawiamy fragmenty do specjalnych genomow)
mmay zbior fragmentow i musimy go poukladac tak zeby odtworzyc porządek framgneto DNA na chromosomie - ukladanie w kontigi
wybraniue ilosctam sporsod zbiorow i ich selekcja - badanei ich sekwencji nukleotydowej
umieszczenie w wektorze i kontig zajmuja dużo czasu
na ile fragmentów chcemy podzielić genom
czym podzielić genom
i w jakim wektorze sklonowac
ile klonow do podzielenia kazdego genomu.
wynika to z wielkosci genomu i odcinkow
dlugosc genomu/ dlugosc fragmentow - teoretyczna liczba potrzebnych klonow
ale musi być ich więcej bo klony czasem się powtarzajac
reprezentatywna bibliteka - stwarza prawdopodobienstwo ze znajdziesz tam kazdy, ale to kazdy segment genomu
3x większy nadmiar klonow - 95%
5x - 99%
wybór enzymu do podzielenia
enzym rozpoznający długie sekwencje - enzym ósemkowy, tnie rzadziej
lecz są rozmieszczone bardzo nierównomiernie - nie powstają równe cząstki
czyli enzym szóstkowy lub czwórkowy zmuszony do specjalnego działania - częściowe trawienie
jeżeli będzie dużo DNA a mało enzymu to przetnei tylko niektóre, losowe.
fragmenty nchodza an siebie co jest kluczowe dla kontigu
jaki wybrac wektor
właściwości wektora dotworzeni biblioteki genomowej: jest w stanei przyjąć i replikować się z dużą wstawką - bakteria z plazmidem wysokokopijnym nie wytrzymalaby takiego obciążenia
plazmidy niskokopijne, kosmidy i fosmidy o przeciętnej pojemności kilkudziesięcu tys. pz
sztuczny chromosom drożdżowy - obrzymia pojemność 200-1000 kb - duży, ale niewygodny
najlepsz wektory pośrednie: BAC i PAC
bakteriofag P1 zbudowany na bzie bakteriofaga P1 - usuwamy zbedną cześć i wstawiamy do bakterii - P1 ma pojemność 100 000 pz
miejsce PAC i pakaza - ładujemy DNA do główki
dwa miejsca loxP rozpoznawane pzez fagową rekombinację cre
liniowy DNA przekształca się w kolisty plazmid w E.coli posaidającej cre
p1-derived artifixil chromosomwe PAC
brak pakowania w głowkę
oparty na niskokopijnym plazmidzie F
ma też loxP .
100-300 kpz bo minęliśmy etpa pakowaia w główkę
BAC - szczutczny chormosom bakteryjny
nazwany tak bo wygląda jak mały chromosom ale nie ma nic wsolneog z chomosomem bakteryjnym
opary na pazmidie F
wyjścioo jest to bardzo nieduży plazmid
elementy plazmidu F - parB, parA, repE, oriS
alfa-komplementacja
marker selekcyjny odprosność na chloramfenikol
możliwość prznoesznia bardzo długich czasteczek DNA
biblioteka genomowa zaiwera cały genom
etap drugi: ukłdanie plazmidw - kontig klonów
ptrzymy gdzi wstawki powtarzają się, nachodzą na siebie, etc - potrzeba molekularnej metody ustalania ten sekwencji
jak można wykazać zę dwa fragmenty Dna mają ze sobą cokolwiek wspólnego:
1 - spacery po chrmosomie
hybrydyzacja southerna
docelowe DNA umieszczamy na filtrze lub membranie w postaci takich plamek - każda plamka - jeden zdeterminowany plazmid z innym fragmentem klonu
bierzemy jeden plazmid - z jego wstawki sonda molekularna hybdrydyzacja do reszty plazmidów - jak coś się zhybrydyzuje to znaczy ze swkencja się potwarza, następnie potwarzamy hybdyrzycaje do reszty wstawek.
niedobry sposob bo sekwencje potwarzające się wszystko psują
poza tym czasochłonna i pracochłonna
2. enzymy restrykcyjne
kawalki na siebie nachodza - beda mialy takie same miejsca restrykcyjne - prfil restrykcyjny se naklada w zachodzacym na siebie fragmencie
nakladajace się sekwencje identyfikue na podstawie identycznosci co najmniej 5 kolejnych iejsc trawienia - odscisk palca
jak za dużo miejsce restykrcyjnych to zaczynaja się ze soba zlewac
tylko kiedy fragmenty maja 50-100 kpz
3. metoda najlepsza - wykorzystanei reakcji PCR
etykietki typu STS - sequence tgged sites
jeśli te dwa framgnety lezay oboksiebie w genomie mozemy w ich obrebie powielic dany, znany nam framgnet wystepujacy w nich
odcinek wspolny musimy znac aby zaprojketowac parę starterow
sekwencja t musi być unikalna - nie może się pwotarzac
mamy ilestam klonow i iles sekwencji STS - projektujemy startety i uzywamy klonow do PCRu jak się powtarza etykietka to lezy na tym samym odcinku, ukladanie klonow staje się latwe
STS może być kazdym, dowolnym framgnetem genomu
drugi rodzja etykietek EST - expresed sequence tag - etykietki pochodzace tylko i wylacznie z genow
u eukariota genow jest nieduzo w stosnku do reszty genomow
bibloteka genomowa i rowlnolegle biblioteka genowa - izolacja mRNA - transkrypty genow przepisujemy na cDNA odwrotna tanskryptaza - i z tego robimy biblioteke da samych genow.
EST sluzy do okreslenie gdzie są geny w genomie.
taka jest przewag etykietek EST nad etykietkami STS.
Strategia hierarchiczna - po co to robimy
kontig jest pracochłonny
w przypadku genomu człowika
7 lat - same kontigi
Wybieramy minimalny zestaw sekwencji DNa o których wiemy, że pokrywa cały chromosom
Pozostałe pozwalają nam sprawdzić sekwencję DNA → niezaprzeczalna zaleta strategii hierarchicznej
Jeżeli mamy powtarzające się elementy to wiemy skąd ona się wzięła → bardzo duża zaleta strategii hierarchicznej
Wada: czasochłonność
Strategia shotgun
- zaczynamy od dekonstrukcji genomu
- izolujemy genomowe DNA
- dzielimy na bardzo małe odcinki 1,6 - 2,0 kpz
W NGS fragmenty jeszcze mniejsze
- szatkujemy genom przypadkowo
- najprostsze kawałki wkładmy do wektora pUC → potem sekwencjonujemy DNA → żeby móc odczytać pełną sekwencję genomu 6-8 x więcej niż wielkość genomu
jeszcze więcej w metodach NGS → wady: nie wiemy nic o pochodzeniu badanych fragmentów, jak pojawi się dziura to nie ma jej czym wypełnić
problemem są geny bogate w sekwencje powtórzone → potrzeba dodatkowych analiz
kompromis pomiędzy obiema strategiami
ukierunkowana strategia shotgun
- dzielimy genom na dużo małych fragmentów
szybko sekwencjonujemy genom
80% sekwencji genomu
równocześnie trochę większe fragmenty 10 i więcej kpz → wkładamy do wektorów, mniej niż w sekwencji hierarchicznej i znowu sekwencjonujemy → długie odcinki DNA pomagają nam wypełnić 20-10% sekwencji DNA
Techniki sekwencjonowania DNA
1. Metoda chemicznej degradacji DNA (Maxama i Gilberta - 1977) - rozkład cząsteczki DNA → metoda trudna
2. Klasyczna metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - metoga Sangera lub dideoksy (Sanger i wsp. 1977) → opiera się na syntezie cząsteczek DNA
Obydwie metoday sprowadzają się do uzyskania puli cząsteczek DNA zakończonych określonymi nukleotydami A, C, G lub T różniących się o 1 nt
3. Metody sekwencjonowania „odmienne od tradycyjnych” (klasycznych)
- metody NGS = next generation sequencing np. takie w których nie używa się ddNTP - np. pirosekwencjonowanie
Metoda terminacji łańcucha metodą Sangera lub dideoksy
- do uzyskania cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, C, G lub T stosuje się synteze nowej nici DNA
- matrycą jest jednonicowe ssDNA ( trzeba najpierw namnożyc w wektorze)
- 3' dideoksynukleotydy - nie mają OH przy 3 węglu
- materiałem wyjściowym jest jednoniciowe ssDNA (w tradycyjnej metodzie DNA trzeba sklonować najpierw do wektora umożliwiającego uzyskanie jednoniciowego DNA)
Synteza
- matryca (1 niciowa)
- polimeraza
- starter
- dNTPs w tym jeden wyznakowany radioaktywnie
4 zestawy - do każdej mieszaniny innego rodzaju dideoksynukleotyd - bardzo mało wydajne
rozdzial elektroforetyczny DNA
Ile nukleotydów można przeczytać w jednej reakcji sekwencjonowania?
ok. 650 nt.
Jak długo się to przygotowywało
( = ok. tydzień)
Dzielenie długich fragmentów → rozdzielanie do plazmidów dających jednoniciową matrycę → moglibyśmy użyć następnie tego samego do sekwencjonowania → obecnie nie ma potrzeby już tworzenia jednoniciowej matrycy - cykliczne sekwencjonowanie wykorzystuje denaturację termiczną jak PCR
wędrówka startera → do poznawania brakujących sekwnecji, projektjujemy uniwersalny starter, potem starter z tego co się naaamplifikowało i tak się to przesuwa
można tak uzupełnić luki ok. 600 pz
Modyfikacja metody Sangera
1) rodzaj polimerazy
- wysoka procesywność - zdolność do syntezy odpowiednio długiego łańcucha DNA i dysocjacji dopiero po włączeniu ddNTP
- brak własności korektorskiej egzonukleazy 5' → 3', egzonukleazy 3' → 5'
pierwszą był nieskoprocesowny fragment Klenowa
teraz sekwenaza - zmodyfikowana polimeraza faga T7
2) zamiana radioizotopów 33P (słabsze promieniowanie, mniej wyraźne) na 35S (silniejsze promieniowanie, bardziej wyraźne) a następnie zastąpienie ich fluorescencją → używanie ddNTP do wyznakowania fluorescencyjnego → automatyczny sekwenator DNA
Sekwencjonowanie automatyczne (cykliczne)
Egzamin 30 stycznia 11:30.
Genomika funkcjonalna - jak komórka funkcjonuje, poziom I: analizy transkryptomu
Przed analizami eksperymentalnymi adnotacja genomu - komputerowe opisywanie sekwencji nukleotydowej - próbujemy wyszukać potencjalne geny i przypisać im spodziewane funkcje.
→ i tak jest to zawsze tylko przypuszczenie, trzeba ją potwierdzić eksperymentalnie.
Analiza transkryptomu: transkrytpów, jakie w komórce powstają → jeżeli powstaje transkrypt, dowód że jest to gen a nie pseudogen
Pseudogen - odcinek który wygląda jak gen ale nie transkrybuje się bo za dużo mutacji, popularne u eukariota
Dalsze pytania:
ile powstaje transkryptu, gdzie, pod wpływem jakich czynników, w jakim stanei fizjologicznym, etc.
Test hybrydyzacyjny typu Northern →test oparty na hybrydyzacji kwasow nukleinowych, jedn rodzaj kwasu nukleinowego umieszczony na stałej powieszni, denetruacja, kąpiel w roztworze z komplementarnym kwasem nukleinowym
Z komórki izolujemy RNA - trudniejsze, bo RNA jest nietrwałe, RNAzy są bardzo powszechne, bardzo rygorystyczne warunki,
analiza mRNA eukariotow troche łatwiejsza - poliadenylacja na końcu 3', łatwiej wyłowić je z całkowitego wyizolowanego RNA z komórki
kolumienka z ogokami polit, hybrydyzacja z ogonakami reszta przelatuje.
1-3% to mRNA
większość RNA to rRNA któ¶e jest nam niepotrzebne w tym eksperymencie.
Rozdzielić przez elektroforezę agarozową w warunkach denaturujących → nawet mimo jest jednoniciowy, żeby nie było struktur typu hairpin
czynnikiem denaturującym jest formalina
zdenaturowane RNA przenosimy przez blotowanie na membranę, jak w Southernie,
hybrydyzujemy z sondą molekularną - odcinkiem genomu, który podejrzewamy że jest genem
jeżeli est traknskrypt potencjalnego genu, to sonda go odnajdzie → wskaże miejsce gdzie się przyłączyła, bo jest wyznakowana
hybrydyzacja typu nothern jest dość trudna - bardzo dużo etapów, a RNA jest brdzo nietrwałe
alternatywa: RT-PCR, reakcja PCR połączona z odwrotną transkrypcją,
izolujemy mRNA, wkładamy do probówki, ze składnikami reakcji PCR (startery komplementarne do badanego odcinak DNA) + odwrotka transkryptaza
Jeżeli mamy transkrypt badanego odcinka DNA → odwrotna transkryptaza za pomocą starteru przepisze go na cDNA a następnie polimeraza powieli, wszystko w jednym etapie, żadnej preparatyki poza izolacją RNA
jeżeli mamy RNA do RT-PCR to nie może być domieszek DNA → wtedy wynik jest fałszywie dodatni, bo to DNA jest matrycą→ DNAza
W każdej komórce geny wyrażają się z różną wydajnością - zupełnie różne ilości transkryptów
Jak to pokazać (porównać ilość różnych transkryptów?)
Real-Time PCR (Q PCR) - wykrywanie produktu w czasie rzeczywistym =/= RT-PCR
Pozwala zmierzyć iość powstającego produktu DNA w trakcie amplifikacji. Sama nazwa wyjaśnia jak ona funkcjonuje, zwykle pottzeba elektroforezy ale nie w trakcie Q PCR .
Jest to prawie normalna reakcja PCR, można ją przprowadzić na wiele sposobów → używamy ją tam gdzie musimy zmierzyć ilość powstająceo produktu
Polimeraza musi mieć aktywność egzonuklezay 5'-3' - Taqi nie mają.
Sonda - oligonukleotyd, krótki odcinek pasujący do wnętrza odcinka który chcemy powielić - projektujemy sondę.
Barwnik fluorescencyjny i pochłaniacz fluorescencji, w jednym oligonukleotydzie nie świeci, świeci dopiero po degradacji sondy
Podczas elongacji polimeraza dochodzi do sondy i wycina (aktywność egzonukleazy 5'-3') go, uwolnienie barwnika fluorescencyjnego → barwnik zaczyan świecić → im więcej produktu, tym więcej błysków światła/większe natężenie etc.
Technika umożliwiająca zobaczyć czy się powiela i ile produktu sę powiela → wydajność zależy od ilości matrycy, a więc ilości potencjalnego transkryptu
Porównanie 3 genów →przepisujemy na cDNA, do Q PCR, powielamy, każdy badany fragment ma różny barwnik → im więcej transkryptu tym intensywniejsze świecenie → pokazywanei względnych róznic w poziomie trankrypcji genów.
Geny wyrażają się z różną intensywnością - niektórych białek komórka potrzebuje więcej, innych mniej, co na poziomie molekularnym decyduje? Promotor genu. Zależy od niego to jak często plimeraza DNA będzie inicjowała transkrypcję.
Jak zmierzyć aktywność promotora? Geny reporterowe - manipulacja DNA, w celu określenia poziomu transkrypcji.
Gen, którego efekt fenotypowy łatwo można zobaczyć lub zmierzyć.
Mamy badany gen poprzedzony regionem promotorowym, chcemy zobaczyć jak silny ma promotor. Określamy potencjalny promotor powyżej genu. Następnie wycinamy sobie go, powielamy PCRem, wstawiamy do wektora, gdzie jest gen reporterowy bez promotora, w miejsce promotora genu reporterowego wstawiamy potencjalny region promotorowy, genr eporterowy wyraża się tak jak aktywny jest badany regon promotorowy, więc będziemy mogli to zobaczyć (świecenie, fluorescencja np. GFP) = FUZJA TRANSKRYPCYJNA, łączenie odcinka regulatorowego plus genu reportowego
Gen reportorowy ma kodon start i miejsce wiązania rybosomu, natomiast region regulatorowy zastępujemy regionem badanym.
Przykłady
lacZ- beta-galaktozydaza, rozkłada barwny substrat który robi się niebieski - prosty test histochemiczny, badamy intenstywnośc koloru
lacZ bez promotora a w miejsce promotora MCS gdzie wstawiamy region regulatorowy
uidA - gen kodujący glukouronidaza (GUS), aktywność promotorów w tkankach roślinnych (brak tła)
gen kodujący lucyferazę - świeci przez ultenienie lucyferyny,
GFP i pochodne, promotor
Nobel 2008 chemia
analiza całego transkryptomu
→ macierze DNA, pokazuje jak wszystkie geny w genomie naraz się wyrażają
hybrydyzacja kwasów nukleinowych raz jeszcze → jeden rodzaj kwasu nukleinowego przywiązany do stałej powierzchni, a następnie kąpiemy go z sondą ktroa się przyłączy jeżeli jest komplementarna
macierz DNA - bardzo duży zbiór pojedyncych cząsteczek DNA na stałym nośniku - reprezentują cały genom lub pojedyncze geny z genomu.
Tą macierz poddajemy hybrydyzacji w roztowrze kwasu nukleinowego który wybarwimy.
Duży zbiór pojedynczych cząsteczek które odpowiadają pojedynczym genom z genomu
Nazewnictwo inne niż w tradycyjnych technikach hybrydyzacyjnych;
„probe” - sonda - kwas nukleinowy o znane sekwencji, unieruchomiony na nośniku
„target” - wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, który poddajemu badanaiu
Sporo odmian i rodzajów macierzy
makro i mikromacierze
makromacierz - stara wersja macierzy, mała gęstość genów na macierz, prymitywna wersja macierzy
mikromacierze - wynalzeiono jak zminiaturyzować skalę macierzy → gęsto upakowae geny na małych rozmiarach
chip genowy, chip DNA → niepoprawne synonimy, nie każda macierz jest chipem genomowym
dwa typy mikromacierzy
- rodzaj sondy
- zastosowanie i przeznaczenie
I mikromacierz oligonukleotyodowa - bardzo krótkie, syntetyczne sekwencje DNA 20-80nt, opatentowany przez Affymetrix, Inc → chip genowy
II mikromacierz cDNA
znacznie dłuższe cząsteczki cDNA (odwrotna transkrypcja mRNA) 500~ 5000 pz.
reprezentacja naszych genów z genomu.
różnią się też przenzaczenim
I - mały kartridż kilka milionów którciotkich sekwencji DNA → różne egzony genów
nadaje się do wykazania że w jednej komórce różne geny wyrażają się z różną intensywnością
mamy macierz ze zbiorem olinukleotydów - mogą być to wszystkie geny, egzony,etc
z komórki izolujemy RNA/mRNA, pewnych traksnryptów jest więcej, jendym mniej → przepiscanie na cDNA → powstanei ich proporcjoanie do ilości matrycy → znakowanie, może być ponowna traksprycpjia, dzielenie na fragmenty, hybrydyzacja do macierzy → hybdryzycja do macierzy, macierz będzie w stanei wchłonąć różne ilości wyznakowaych cząsteczek DNA w jednym miejscu, lub mniej w zależności od tego ile teo jest.
Mikromacierze cDNA (format II)
Zastosowanie: porównanie dwóch komórek (np. zdrowej i nowotworowej) o różnych stanach fizjologicznych
macierz - cDNA - dwie komórki z rożnych stanów fizjologicznych, izolacja mRNA, odwrota transkrypcja ze znakowaniem na inny kolor, w jednym stanie fizjologiczym może być więcj jakiegoś mRNA
mieszanie w różnych ilościach, hybrydyzacja do jednej macierzy → hybrydyzacja na zasadzie współzawodnictwa → tam, gdzie jest więcej na taki kolor będzie bardziej świecić - hybrydyzacja kompetycyjna, współzawodnictwo, wygrywa bardziej liczy
Zastosowania technologii macierzy (poza badaniem profili ekpresji genów)
1. Wykrywanie rearanżacji w genomach - duplikacja jakiegoś genu spowoduje zwiększoną hybrydyzację do określonej sondy
2. Wykrywanie mutacji
3. Wykrywanie polimorfizmu SNP
4. Analiza wzorów metylacyjnych w DNA
Globaly (całościowy, kompleksowy) sposób analizy genomu.
Badanie funkcji genu
na poprzednich zajęciach mówiliśmy o analizie transkryptomu.
mówi nam, że dany odcinek genmu jest genem → nie mówi o jego funkcji
dziś będziemy mówili o funkcji
transpozon wprowadzamy do komórki bakterii, wbudowuje się w geny losowo, przerywa ich ciągłośc, fenotyp się zmienia → wymagania pokarmowe, ruchliwość, śluzowatość
z transpozonu robimy sondę molekularną, izolacja DNA, hybrydyzacja Southerna - znajdujemy DNA gdzie był transpozon klonujemy do wektora, identyfikujemy, sekwencjonujemy → mamy gen odpowiadajacy za dana funkcje
nielosowa analiza określonego genu:
- wyłączanie genu (mutacja) - najlepszy sposób, lecz nie wszystkie gey w genomie da się wyłączyć
- wyciszanie genu
- nadekspresja geu
Inaktywacja genu - organizmy takie jak bakterie, drożdże, haploidalny genom, mozliwość selekcji za pomocą antybiotyku
1. Izolacja genu z genomu - łatwe, znamy już genom, wycinamy lub powielamy gen, klonujemy do wektorów
2. Przerabiamy sklonowany gen, przerabiamy go w ten sposób że wyrzucamy jakąś część ('środek', pozostawiając 'końce') - u bakterii pomędzy końce wprowadzamy dodatkowy gen, w środku odporność na antybiotyki - konstrukt do mutagenezy, konstrukt do wyłączaia genu
3. Konstrukt wprowadzamy ponownie do wyjściowego genomu gospodarza na wektorze który nie będzie się sam utrzymywać w komórce ani replikować
4. Selekcjonujemy antybiotykiem wstawionym w konstrukt, komórka ginie lub ulega homologicznej rekombinacji (wbudowuje gen oporności w genom zamiast genu poprzedniego)
Analogiczna rzecz w komórkach eukariotycznych, orgnizm ssaczy np. mysz
- nie ma prostego ukladu jedna cecha - jeden gen - diploidalny genom, mało prawdopodobne że wyłączymy obydwa allele, jeżeli wyłączymi jeden z nich zmiana fenotypu mało widoczna
- nie można hodować myszy na płytce z selekcją na antybiotyk → trudna selekcja rekombinantów
Knockout genowy → nie używa się terminu mutacja przy zamierzonych zmianach.
infekcja wczesnego zarodka specjalnyn wektorem retrowirusowym z okreslonym konstruktem do knockoutu genowego
- najpierw izolujemy gen z genomu, klonujemy w bakteriach, przeksztalcamy w przerwany gen, nastepnei do wektorow wirusowych, do komorek linii pakujacej - mamy efektywne wiriony
izolcja zarodka we wczesnym stadium, infekujemy zarodek
retrowirusy maja tropizm do komorek dzielacych się, więc zarodek się swietnie do tego nadaje, wirus zainfekuje większość komorek, w tych komorkach zajdzie homologiczna rekombinacja w przynajmiej jednym z alleli
zarodek implantuje się do przygotowanej hormonalnie myszy
rodza się myszy chimeryczne, heterozygoty - więcej niż jedna linia komorkowa o roznych genotypach, część komorek ma allel z knockoutem a część nie
następnie krzyzumjmey myszy az knockout dojdzie do komorek generatywnych i otrzymujemy homozygoty z knockoutem
z zaplodnionej myszy izolujemy jajo, izolujemy je - dwa przedjadrza, meskie i zenskie
wkluwamy się do ednego z przedjadrzy wprowadzamy konstrukt do knockoutu, liczymy ze rekombinacja zajdzie - jadro to jest haploidalne, jak mamy rekombinacje to potem ta komorka po fuzji się dzieli mitotycznie - nie ma chimer → jak jest knockout, to heterozygota ma knockout w kazdej komorce
jajo wprowadzamy do matki zastepczej
z wykorzystaniem komorek macierzystych → niezdefiniowany w żadnym stopniu kierunek genetyczny → moze się przeksztalcic w kazda komorke
pozyskiwanie komroek mcierzystych z zarodka: komorki wezl zarodkowego, hodujemy je sobie in vitro, proste
w midzyczasie przygotowjemy konstruk do knockoutu genowego
- konce, srodek pusty, mamy konstrukt → wykorzystywanie antybiotykow jako ze mamy komorki in vitro
wyposazamy konstrukt genetyczny - w srodku mamy neomycyne (kom eukariotyczne są wrazliwe)
dodatkowo gen samobojczy
konstrukt wprowadzamy do linii komorkowej - elektrotransformacja
w komorkach dzieje się rekombinacja homologiczna w zamierzonym przeznasmiejscu, gen ix zostaje wymieniony na gen opornosci na neomycyne → odpornosc na neomycyne
niestety genom eukariotyczny jest duzy a konstrukt niewielki, wiele odcinkow genomu potencjalnie do siebie podobnych → niehomologiczna rekombinacja → wtedy komorka zabiera se soba gen samobojczy, również oporna na neomycyne, ale latwo można ja zabic
po wprowadzeniu konstruktu
- komorki w ktocyh brak rekombinacji w ogole
- komorki w których mamy homologiczna rekombinacje
- komorki z rekimbnincj w losowym miejscu
najpierw neomycyna - gina komorki które nie są rekombinantami
dodajemy gancyklowir → gin rekombinanty niehomologiczne
pozostaja komorki z zamierzonym knockoutem
kolejny zarodek pobrany od myszy, wprowadzamy komorki do zarodka mysiego, ten zarodek będzie chimera, implantacja do zasepczej matki przygotowanej hormonalnie
wybieramy myszy o odpowiednim kolorze siersci → potomstwo m być laciate → wtedy jest cimryczne, następnie krzyzowka wsteczka az calkowicie czarne potomstwo → nokaut dotarl do linii generatywnej.
SCID mouse (Severe Combined Immunodfeiciency Disease) (Immunodeficiency Diseases) - niedobór immunologiczny. Podobnie jak u ludzi, myszy SCID są niezdolne do walki z infekcjami,ale także np. do odrzucania przeszczepów
Crellox System
Cre rekombinaza miejscowo specyficzna, która działa na miejsce loxP (34 pz)
Dlaczego wycinanie DNA za pomocą CrelloxP jest takie użyteczne?
loxP pochodzi z bakteriofaga P1, a zatem nie występuje np. w roślinach czy u zwierząt. Dzięki temu sekwencje loxP mogą być sztucznie wstawiane do zwierząt i roślin w celu precyzyjnego wycinania określonych sekwencji DNA, bez obawy, że przy okazji wytniemy jakąś istotną część genomu.
uzyskujemy dwie linie myszy
1 linia myszy - we wszystkich komórkach swojgo caiał ma rekombinazję cre, pod promotorem wyrażającym się specyficznei wdanej tkance.
2. linia myszy - we wszystkich komórkach ciala dodatkowa kopia genu otoczona miejscami loxP
krzyżujemy dwie linie myszy - czekamy aż urodzi się nam potomstwo, w komórkach ich ciała mamy wszystkie te elementy razem → w specyficznych tkankach ekspresja cre, która wycina gen z komórki, w innych tkankach nic się nie dzieje.
Problem: trudno znaleźć całkowicie tkankowo-specyficzne promotory w eukariotach (wyrażajcych się tylko w jedne tkance)
Dramatyczna zmiana poziomu ekspresji genu
- do komórki trzeba wprowadzić dodatkową kopię genu, żeby pojawiło się znacznie więcej produktu - najlepiej w postaci cDNA - już po obróbce, bz intronów
zamiast 10 kopii białka pojawia się ich tysiąc - duża zmiana metabolizmu komórki → zmiana fenotypu, ta metoda nie zawsze skuteczna, komórka ma mechanizmy obronne (tak samo zresztą z knockoutem)
potranskrypcyjne wyciszanie genu
knockout - wyłączanie genu na poziomie genomu, istnieje ryzyko że wylączymy/popsujemy cos przy okazji
nadekspresja - niekoniecznie widoczna w fenotypie
wyciszanie - nie zmieniamy genomu, zaczajamy się na transkrypt - nie musimy docierac do jadra, tylko do cytoplazmy
antysensowne RNA - wiaze transkrypt i zapobiega translacji
RNAi - pocięcie transkryptu na kawałki
przepisaniu ulega tylko jedna nić (kodująca), jeżeli wprowadzamy spreparowany konstrukt genetyczny gdzie odcinek DNA jest tak zrobiony żeby była transkrybowana druga nić (komplementarna), powstaje ssRNA antysensowny, one hybrydyzują se sobą - dwuniciowa struktura - zablokowanie translacji
Dwuniciowe RNA ulega degradacji przez mechanizmy obronne komórki jako coś nienormalnego
Niemięknący pomidor - zablokowana translacja genu powodującego rozkład pektyn - antysensowne DNA
Interferencja RNA (RNAi)
w latach 80 pewna grupa naukowców pracujaca na petunii chciala uzyskac kwaity o intensywniejszej barwie niż wyjsciowa, dodano więcej kopii gnow odpowiedzialnych za barwe
dodano gen który wyrazal się zle - dużo antysensownego RNA, gen powodowal zanik barwy
molekularny mechanizm - nicien C. elegans - niszczenie transkryptow i blokowanie transkryptu genow
pojawiaja się krociotkie, dwuniciowe RNA, wystajace koncowki dwunukleotydowe 3'
komplementarne do genu odpowiadajacych transkrptow
mechanizm powszechny, tylko u drozdzy go nie ma
male czasteczi RNA z pociecia trawienia większych czasteczek dsRNA → dawna ochrona przez dsRNA wirusami
duza ilosc antysensownego RNA → zdolnosc twoarzenia dwuniciowych struktur sama ze soba → sygnal nienormalnosci dla komorki → wlaczenie genu rybonukleazy Dicer, trawienie dsRNA do siRNA (male, interferujace RNA) charakterystyczne dwunukleotyodowe koncowki → jedna nic komplementarna do transkryptu, kompleks nukleinowo-proteinowy, jedna z nici ulega oddzieleniu, tylko komplementary do transkrytpu RNA zostaje w RISC, ten kompleks przesuzkuje cytoplazme, jak znajduje komplementarny transkrypt to wiaze się z nicia w RISC i slicer rozcina transkrypt.
mozliwosc posttraksrypcyjnego wyciszania genu
- konstrukt geneyczny podowujacy powstawaniw dwuniciowego RNA
- albo wprowadzenie syntetycznego dsRNA lub siRNA
egzamin - forma pisemna, test wielokrotnego wyboru z ujemnymi punktami
pytania otwarte