INZYNIERIA GENETYCZNA - WYKŁADY

4.X.2011r.

Wykładu nie było, krótkie wprowadzenie i furda do domu.

11.X.2011r.

- Inżynieria genetyczna - zespół technik badawczych pozwalających na modyfikację materiałem genetycznym w celu wyizolowania i modyfikacji określonych genów oraz do zmiany właściwości dziedziczonych.

- Pozwala na:

- izolowanie fragmentów, przenoszenie

- Biotechnologia opiera się bardzo na inżynierii genetycznej (np. produkcja insuliny)

- Inżynieria narodziła się koło lat '60 podczas odkrycia zjawiska restrykcji, a pierwsze geny przeniesiono w 1974

Enzymy restrykcyjne

- Główne narzędzie w IG

- Są to endonukleazy przecinające wiązanie cukier - fosforan w DNA

1) Endonukleazy I klasy

- do działania potrzebują ATP; Mg²⁺; S-adenozylometioniny

- dwuniciowy DNA (sekwencja kilkunastu nukleotydów)

- Enzym rozpoznaje sekwencje, nacina obie nici w pewnej odległości od sekwencji

- system restrykcji i metylacji - 1 polipeptyd

2) Endonukleazy II klasy

- nazewnictwo - od organizmu z którego pochodzą

- do działania Mg^2+; dsDNA (kilkunukleotydowa sekwencja specyficznie rozpoznawana)

- na dsDNA

- nie trawią DNA na miejscu metylacji

- przecięcie obu nici, zwykle w obrębie tej sekwencji (w pobliżu jej - tylko klasa IIS)

- system restrykcji restrykcji niezależny od systemu metylacji

- Wykrywają specyficzne (często palindromowe) sekwencje nukleotydów.

- tnie zawsze w określony sposób, więc możemy spodziewać się określonego produktu

- Im krótsza sekwencja, tym częstsze cięcie i tym więcej małych cząsteczek powstaje.

- 4 nukleotydowe - cięcie raz na kilka setek nukleotydów

- 6 nukleotydowe - cięcie raz na kilka tysięcy nukleotydów.

- 8 nukleotydowe - ciecie raz na kilkadziesiąt tysięcy nukleotydów.

- Izozchizomery - te same sekwencje, takie same cięcie, różne pochodzenie enzymu.

- Neoizozchizomery - te same sekwencje, różne cięcie, różne pochodzenie enzymu.

- Enzymy rzadko tnące - duże odcinki, lub odcinki o niezwykłej strukturze (dużo reszt GC)

- Enzymy restrykcyjne działają jak dimery.

- Cięcie enzymem restrykcyjnym tworzy wolne końce DNA.

- Lepkie końce (nadmierności) - powstają gdy cięcie na obu niciach nie jest równoległe.

- Zwykle są to nadmierności 2 i 4 nukleotydowe, rzadziej 1 i 3.

- Tępe końce - powstają gdy cięcie na obu niciach powstaje naprzeciwko siebie.

- Zgodne lepkie końce (komplementarne nadmierności) łatwo się łączą.

- Zgodne lepkie końce w zrekombinowanym DNA możemy rozdzielić (rozciąć) ale nie zawsze rozkleić.

- Czasami inne enzymy tworzą takie same lepkie końce.

- na jednym końcu HPO₄ a na drugim OH

• Czynniki wpływające na aktywność enzymów restrykcyjnych.

- określone środowisko (bufor reakcyjny)

- temperatura - około 37 stopni

- ilość enzymu - określona. W jednostkach aktywności

• Aktywność gwieździsta.

- rozluźnienie specyficzności

- złe warunki

- zły bufor

- zła ilość pH, soli

- zła temperatura

- za dużo/mało enzymu w stosunku do DNA

- za długi czas inkubacji

(- np. enzym zamiast GTCCAC trawi NTCCAC. Gdzie N to C/G/A/T)

- czystość DNA

- rodzaj DNA

• Zastosowania enzymów restrykcyjnych.

- Izolacja i identyfikacja genów

- Rekombinowanie i klonowanie genów

- Mapowanie fizyczne genomów

- Diagnostyka (chorób) i identyfikacja (pokrewieństwa)

3) Klasa III

- do działania wymaga ATP i

- pewne właściwości katalityczne w obecności S-adenozylometioniny

- rozpoznawana sekwencja nie jest równocześnie miejscem przecięcia

18.X.2011

Elektroforeza DNA

• Użycie:

- pozwala bezpośrednio identyfikować (wizualizować) cząsteczki DNA.

- rozdzielanie fragmentów DNA według ich wielkości (można w przybliżeniu podać ich wielkość)

- oczyszczanie DNA (np. od białka)

• Podział technik:

- Agarozowa (horyzontalna) w stałym polu elektrycznym/ zmiennym polu elektrycznym.

- Akrylimidowa (wertykalna) SDS/ nie SDS

- Funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego

- polimer o określonej wielkości oczkach, przykladamy napięcie. Małe cząsteczki przechodzą przez oczka szybciej. Duże bardzo wolno

• Agaroza - polimer z krasnorostów (naturalny)

Zalety:

- duży zakres rozdzielania (kilkaset pz do 40kpz; w zmiennym polu nawet do Mpz)

- nietoksyczna

- łatwość przygotowania żelu i elektroforezy

Wady:

- mała zdolność rozdzielcza (nie mylić z zakresem rozdzielania! W zdolności chodzi o to że np. kawałków 40pz i 44pz nie rozdzielimy od siebie)

- stosunkowo droga

25.X2011r.

Elektroforeza kwasów nukleinowych

- Pozwala bezpośrednio identyfikować (wizualizować) cząstki DNA i jest stosunkowo czuła.

- bufor próbkowy - zagęszcza, obciąża i wybarwia. NIE MA buforu denaturującego

- bromek etydyny - najczęściej używany do barwienia. Mała czułość. Tani.

- barwniki fluorescencyjne - b. drogie, b. czułe, nieszkodliwe

- dsDNA liniowe migruje z szybkością odwrotnie proporcjonalną do wielkości

- wielkość

- konformacja

- stężenie Agarozy ( im mniejsze, tym lepszy rozdział, ale mniejsze stężenie to mniejsza stałość)

- obecność bromku etydyny

- napięcie prądu

- W zależności od komformacji:

- forma CCC najszybsza

- liniowa

- otwarto kolista (z jedną przeciętą nicią)

- ale! Nie można porównywać szybkości migracji cząstek liniowych i kolistych i odwrotnie, migrują inaczej, mają inne konformacje

- zaleca się 5V na 1cm odległości między elektrodami

- Trisboanowy bufor - uważa się za najlepszy. Bromek wlazi pomiędzy zasady DNA, rozpycha je, zmniejsza skręcanie

- 75°C - niszczenie białek, inaktywacja proteinazy K.

• Izolacja DNA z żelu agarozowego.

- Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (pulsacyjnym) (PFGE)

- reorientacja - zmiana przepływu prądu  zmiana konformacjo  duże cząsteczki robią to dłużej

- wybieramy enzymy rzadko tnące (8 parowe, specyficzność)

• Stosowanie - rozdzielanie DNA 50kpz - 10Mpz np.. przy konstrukcji bibliotek genomowych.

- > 50 tys pz - do dużych cząsteczek

- cząsteczka DNA musi mieć określona konformację

- idzie w jednym kierunku jeśli prąd jest stały

- puszczamy prąd w równych kierunkach - muszą się rekonfigurować (obracać^^) zajmuje im to czas

- dużo szybsza reorientacja cząsteczek małych względem reorientacji dużych

- CHEF - kilkadziesiąt elektrod; różne ustawienia pola elektrycznego, różnica w koncie reorientacji wpływa na skuteczność rozdziału

- dłuższy rozdział (kilkanaście godzin)

- duże całe cząsteczki -> hodowlę zatapiamy w bloku agarozowym -> liza komórek aby wyszło DNA -> nakładamy kawałek agarozy do studzienki.

- gdy chcemy duże na mniejsze - enzymy rzadko tnące

- możemy określić wielkość cząsteczek przy specjalnym markerze

- Wykorzystanie PFGE

- Biblioteki genomowe

- konstruowanie map fizycznych

-

• Elektrofereza w żelu poliakrylamidynowym

- ZAJEBISTA zdolność rozdzielcza

- można rozdzielić większe ilości DNA bez utraty zdolności rozdzielczej

- można odzyskać DNA, bardzo czyste

- używa się barwników fluorescencyjnych.

- żele denaturujące (mocznik, formamid, formaldehyd ) - by rozdzielić dsDNA na ssDNA

- niedenaturujące - rozdział i oczyszczanie dsDNA

- EMSA - oddziaływanie białko - DNA

- markery wielkości - nieznane wielkości porównujemy do znanych

Wektory - rekombinacja i klonowanie molekularne DNA

- restryktaza + wektor - przenoszenie DNA

- Wektor - musi się potrafić utrzymać - przetrwać (w komórce czy innym nośniku w który go wsadzimy) oraz umiejętność autonomicznej replikacji

- DNA wbudowany do wektora to wstawka

- klonowanie molekularne

- klonowanie u prokaryota jest proste

- wektory - plazmidy, fagi i kosmidy

• Wektory plazmidowe

- ogólne przeznaczenie - proste powielanie genu

- do „zadań specjalnych” :

- wydajna ekspresja genu

- badanie funkcji

- klonowanie produktów PCR

- jednoniciowe matryce

- przechowywanie dużych fragmentów DNA

• Cechy dobrych wektorów

- niezależna autoreplikacja; plazmid obok chromosomu;

- własne origin replikacji - ilość jego kopii, jeżeli jest wysokokopijny (łatwo pozyskać); uwaga na niezgodność plazmidów - chcemy wprowadzić parę wektorów i musimy sprawdzić ich origin replikacji, gdyż niektóre zwalczają się nawzajem

- posiadać marker selekcyjny - pozwala zobaczyć bakterie które go mają wbudowane (np. odporność na antybiotyki - resztę zabija)

• MCS (polimarker)

- swobodniejszy dobór odpowiedniego do klonowania plazmidu. Miejsca muszą być unikalne.

- niezdolny do przeżycia poza komórkę gospodarza

- wysokokopijny - łatwy do pozyskania

- niezgodność plazmidu - musi być inne origin by się nie gryzły.

• Puc18/19 - polilinker obrócony o 180°

- wizualna identyfikacja klonów zrekombinowanych - α-komplementacja enzymu (niezrekombinowany enzym wektora rozkłada „x-pol” na produkty o zabarwieniu niebieskim; zrekombinowany wektor ma gen tego enzymu podzielony przez wstawkę i go nie wytwarza, przez co zrekombinowane bakterie nie produkują zabarwienie)

- gen letalny - do wektora oby fragment i nie ganie bo rozerwano letalny gen!

• Wektory „specjalne”

- Wektory ekspresyjne - nadekspresja białka w komórkach

- silny (wielokrotna transkrypcja w specjalnych warunkach), regulowany promotor - można go włączyć i wyłączyć

- sztuczny START, miejsce wiązania rybosomu, sztuczny STOP (elementy niezbędne do translacji obcego DNA)

- znacznik (dodać do białka które chcemy otrzymać)

8.XI.2011r.

Wektory i rekombinacja

• Inne klasy wektorów:

- bakteriofag λ

- osobno RNA fagowy, osobno główka, osobno ogonek

- delacyjne formy bakteriofagów λ i P1.

- zamiast własnego DNA można wykorzystać DNA inne. Enzymy pakujące nie rozpoznają rodzaju DNA - wykorzystanie terminazy - rozpoznaje sekwencji cos

- P1 - do 125kpz wolnego miejsca, większe fragmenty da się klonować.

• Klonowanie:

- DNA z którego mamy zrobić bibliotekę

- wektor

- region wymienialny jest usuwany zaś wektor jest zakończony lepkimi końcami, tak samo z DNA .............. z lepkimi końcami

- zmieszanie fragmentów, ligacja ligazą DNA

- odpowiednia wielkość cząsteczek które mają być zapakowane do główki przez terminazę - wielkość genomu bakteryjnego

• Inne fagowe wektory

- pochodne faga P1 podobne do faga λ oparte na wersjach delecyjnych genomu faga P1. Ma większy genom niż λ. Pozwala konstruować większe biblioteki

- Kosmidy - wektory plazmidowe wyposażone w sekwencję „cos” faga λ, ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz --> można do niego sklonować 35-45 kpz

- zastosowanie:

- biblioteki genowe

- klonowanie genów eukariotycznych zawierających liczne i długie introny.

- Fosmidy - Zawierają miejsca startu replikacji z plazmidu F, oraz sekwencję cos z faga λ.

- Autonomiczne wektory drożdżowe.

- drożdże jako gospodarze są ok.!

- struktury typowe dla eukaryota

- geny klonowane w nich mogą zawierać sekwencje intronowe bo proces obróbki mRNA jest zbliżony do tego u Eukaryota

- białka ulegają modyfikacjom potranslacyjnym

- Wahadłowe

- odmienne miejsca startu - zarówno drożdże jak E. coli (oraz miejsca markerowe dla obu organizmów)

- utrzymanie wektora w bakteriach i ekspresja eukariotycznych genów w drożdżach.

- Część eukariotyczna

- ori ARS

- centromer CEN

- telomery

- geny selekcyjne (his3, trp1, ara3) - ale nie geny odp. Na antybiotyki.

- jedno unikalne miejsce restrykcji do klonowanie obcego DNA.

- system wizualnej selekcji sup4 (ale nie α-komplementacja)

- część prokariotyczna

- plazmidowe ori

- marker selekcyjny (np. odporność na antybiotyki)

- np. w YAC można sklonować DNA do 1Mpz, standardowo 600kpz

- wada - niestabilność wstawianego DNA, tendencja do rearanżacji.

- wektory te powielają się w organizmach eukariotycznych i są oparte na plazmidach ................ ale na chromosomach

- wektory do komórek wyższych eukariontów stosowane w terepii genowej

- systemy dostarczania gotowego konstruktu DNA lub transgenu

- wektory wahadłowe

- YAC i BAC nie mogą utrzymywać się poza ich właściwymi gospodarzami

- U wyższych eukariontów DNA z insertami mogą wystepować jedynie w formie zintegrowanej z chromosomem gospodarza.

- niewygodne w badaniach funkcji sekwencji sklonowanej - integracja może prowadzić do rozerwania chromosomu a integralny DNA zniszczony

- HAC - liniowa bo ma telomery, liniowe sekwencje

- Wektory do komórek wyższych eukariontów (zwierząt i ludzi) stosowane w terapii genowej

- są to systemy dostarczające gotowego konstruktu DNA lub transgenowego

- wektory wahadłowe

- oparte głównie na wirusach otoczki zrekombinowanego DNA

- Podstawowe wirusowe systemy ........ genów

- rekombinowane wektory retrowirusowe oraz lentiwirusowe

15.XI.2011r.

Wektory dla organizmów wyższych

- zastosowanie - badanie podstawowe

- podstawowe kryteria do formowania wektorów wirusowych:

- bezpieczeństwo

- specyficzność, stabilność dostarczania genów

- efektywność namnażania się w liniach komórkowych

- prosty system produkcji

- możliwość dostarczania materiału o dużych rozmiarach

- brak immunogenności

- aktualnie nie ma jednego uniwersalnego nośnika wirusowego

- funkcje (i geny) wirusowe

- cis - które nie mogą być usunięte z genomu wirusa; miejsce startu repliki lub sygnał "pakujący" DNA

- trans - komórkowych których funkcje mogą zostać zastąpione przez analogi pochodzące od zmodyfikowanych linii

- bezpieczne układy złożone to takie, w których istnieje przestrzenne rozdzielenie części cis i trans

- po to by wprowadzić DNA do eukariota, by wywołać efekt fenotypowy

- powlekają DNA, ale nie po to są tak naprawdę

- terapia genowa; trans geneza

• Retrowirusy

- LRT-gag-pol-evn-LTR

- gag - struktura płaszcza białkowego

- pol - odwrotna transkryptaza

- env - glikoproteiny otoczki wirusa

- LTR - sekwencja promotorowo-regulatorowa (oba końce wirusa)

1) W plazmidzie z genomu retrowirusa daliśmy odwrócony terminalny LTR

- wektor bipunkcjonalny

2) skł. Specjalne komórki eukariotyczne - pakujące mają wszystkie pozostałe geny retrowirusa (gag, pol, env). Otrzymujemy gotowy wirion

- rekombinowane wektory retrowirusowe - bezpieczne układy złożone

- LTR; psi - potrzebne do sygnału namnażania. Gag + pol - do życia

- linia komórek pakujących z prowirusem (bez sekwencji psi)

- herpeswirusy - do około 50kb

- Epistoin Barr Virus - kmba, 4to cis, 168 można przebudować

- Eukariotyczne markery selekcyjne

- markery dominujące - w każdym tle genetycznym.

PCR - łańcuchowa reakcja polimeryzacji - technika amplifikacji fragmentów DNA

• Otrzymywanie dużej ilości kopi specyficznych fragmentów DNA

• Oparta na replikacji DNA in vitro

• Częściowo uwalnia od klonowania molekularnego

• Umożliwia uzyskanie dużej liczby kopii DNA - amplifikacja DNA.

- polimeraza DNA wykorzystuje jednoniciowe DNA jako matrycę do syntezy nici komplementarnej.

- ssDNA uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe do 94° - 100°

- polimeraza wymaga końców 3' wolnych, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 3'--> 5', które przechodzą z oligonukleotydowych primerów

- primery wiążą się specyficznie na zasadzie komplementarności

- starter górny - forward - up stream

- starter dolny - down stream

- po 1 cyklu - produkty pierwszorzędnie

- po 2 cyklu - produkty drugorzędnie

- po 3 - produkty trzeciorzędnowe - po raz pierwszy oczekiwane, właściwe produkty

- po 30 cyklach - 1mld kopii produktów trzeciorzędowych, i kilkaset I i II rzędowych.

- reakcja odbywa się w "termocyklerze"

• Składniki PCR

- startery

- polimeraza

- substraty dla polimerazy (dNTP)

- bufor

- jony Mg²⁺

PCR - wymagania

- dobór warunków (temperatura, czas trwania cykli, ilość cykli)

- dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

- dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej, tj: stężenie dNTP, polimerazy, starterów, Mg²⁺

• Polimerazy DNA

- zwykła polimeraza po denaturacji zdycha, trzeba było nowej

- Termostabilne polimerazy:

- Taq (thermus aquaticus)

- dostępna jako rekombinowana

- wytrzymuje temperaturę do 100°C; optimum działania osiąga przy 72-75°C

- nie posiada aktywności egzonukleazy 3'-5' (sprawdzającej) - popełnia dużo więcej błędów (2x10^-4 do 2x1^-5)

- na końcu dodaje końcówki adeninowe

- Pfu (pynococcus furiosus)

- rzadko się myli, ma aktywność korekcyjną 3'-5'

- tempo zakończone końce

- Tth (thermus thermophilus)

- właściwości odwrotnej transkryptazy oraz zależnej od DNA, DNA polimerazy

- te 2 aktywności zależne od Mg2+/Mn2+

- pozwala uniknąć problemów np. ze "szpilkami do włosów" w RNA

- Deep Vent

- stabilna, bardzo termostabilna - 480 minut w 100°C

- zdolność polimeryzacji długich odc. DNA - duża procesywność

- aktywność sprawdzająca

- Long PCR enzyme mix - mieszanie polimeraz ze sobą - powielanie długich fragmentów np:

- Deep Vent + Taq - można powielać fragmenty do 200 kpz

Odmiany techniki PCR:

- Hot start PCR

- czyli zaczynamy reakcję już przy właściwej temperaturze, dodając jeden z koniecznych składników na koniec. (usta mówią, ale umysł nie ogarnia)

- Asymetryczny PCR

- jeden starter, lub dwa w nierównych stężeniach

- np. w cyklicznym sekwencjonowaniu DNA

- Multipleksowy PCR

- dwa lub więcej starterów w jednej mieszaninie

- różnice w prążkach

- Real - Time PCR - (to nie jest to samo co TC PCR!!)

- wykrywanie produktów w czasie rzeczywistym

- para starterów, obecna jest sonda

22.XI.2011r.

Rekombinacje in vitro i wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek

Rekombinowanie DNA in vitro w wektorach np. plazmidowych:

1. fragment DNA

2. fragment wektora do klonowania

3. ligacja wektora i wstawki

4. wprowadzenie do komórki

d

1) - DNA pocięte odpowiednią restryktazą

- elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia

- opcjonalnie - inne

2) - wektor do klonowanie musi być pocięty enzymem restrykcyjnym

- kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia.

- opcjonalnie defosforylacja '5 końców wektora która zapobiega autofagii DNA wektora.

3) - ligaza DNA (skleja też lepkie końce jeśli E. coli z fagiem T4)

- ligazy działają najlepiej w 15-25°C

- stosunek ilościowy -- wstawka 3 : 1 wektor

4) - ze względu na naturę procesu wprowadzania:

- biologiczna - z wykorzystaniem wektorów

- fizyczne (bezwektorowe)

- elektroporacja; mikroprecypitacja; mikroiniekcja; lipofekcja; biobalistyka

- ze względu na gospodarza:

- transformacja - bakterie, drożdże, rośliny

- transfekcje - zwierzęta, ludzie

Transformacja metodą chemiczną:

- zdolność transformacji zależy od stanu kompetencji (właściwość genetyczna głównie bakterii G+)

- sztuczna kompetencja (metoda chemiczna)

Opisowo:

Strefa adhezyjna - pory w komórce, głównie w fazie logarytmicznego wzrostu.

DNA ma ładunek "-", błona także ma "-", dlatego nie może wejść przez strefę adhezyjna - odpychana przez błonę.

Dodajemy Ca2+ i oziębiamy - Ca2+ opłaszcza błonę redukując jej ładunek ujemny, zaś zmniejszeniem temperatury, oszałamiamy membranę.

Na koniec, poddajemy komórki szokowi cieplnemu w 42°, przez co pory momentalnie się otwierają i wciągają DNA w głąb komórki.

- bakterie nie mogą posiadać plazmidów (chociażby odporności na antybiotyki)

- wyłączone systemy rekombinacji

- wyłączone systemy restrykcji

- wbudowane systemy wizualizacji

- małe w formie CCC (wstawka?)

- uwaga! Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe. Bardzo bardzo! Jak małe szczeniaczki!

Elektrotransformacja:

- wysokie napięcie 1250 - 2500V - powstanie porów do 2nm

- bardzo wysoka wydajność transformacji

- można wprowadzać b. duże cząsteczki DNA

- musi być ich bardzo dużo (faza log) - po takim kopie prądu, większość padnie na "hello"

- bardzo czyste DNA (bez soli itd)

- tutaj też wrażliwość, i to na poziomie córeczek królów, czyli księżniczek

- nadaje się do wszystkich typów komórek

Inne metody:

- Mikrowstrzeliwanie

- do roślin - nie trzeba usuwać ściany komórkowej

- u dwuliściennych można użyć komórek bakterii Rhizobium

- gen gun - "pistolet genowy"

- kulka ze szlachetnego metalu jako pocisk (Człowieka ze złotym pistoletem z Bonda 007 pamiętacie? :)

- kulkę zanurzamy w DNA

- strzelamy (ognia!) DNA wbija się do komórki

- Liposomy i ipopleksony - lipofekcja

- liposomy to pęcherzyki lipidowe

- łączą się z błoną

- niby fajne, ale bez zbytniego hura!, w końcu dostać się do cytoplazmy to dopiero polowa roboty, a już z przedostaniem się do jądra jest baaardzo duży problem. W ciemności czają się nukleazy!

- Mikroiniekcja:

- zwierzątka i ludzie

- do komórki jajowej w której nie doszło jeszcze do połączenia DNA, wstrzykujemy nasze wektorowe DNA. Coś takiego?

Po co to wszystko?

- Transgeneza

- Terapia genowa

29.XI.2011r.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

- Potrzebujemy/wyszukujemy fragmenty genu z większej całości

- lokalizacja genu na chromosomie

- Hybrydyzacja - powstanie stabilnych cząsteczek dwuniciowych z komplementarnych pojedynczych; hybrydy:

- DNA - DNA

- RNA - RNA

- DNA - RNA

- zachodzi gdy odcinki są bardzo krótkie

- Dwa warunki:

- sonda molekularna - odpowiedni fragment DNA

- umieszczenie interesującego nas kwasu nukleinowego na stałym nośniku - filtrze (prawie w 95% przypadków)

- Sonda molekularna:

- wyznakowana - wyposażona w znacznik który umożliwi jej lokalizację, a tym samym interesujące nas odcinki DNA.

- znacznik radioaktywny - ³²P; ³⁴S; autoradiografia

- znaczniki nieradioaktywne - fluorescencyjne; immunochemiczne; hapteny - widoczne dzięki specjalnie znakowanych przeciwciał

- Sposoby znakowania sondy:

- znakowanie końców

- transkrypcja in vitro

- znakowanie w reakcji PCR

- reakcji przypadkowego startu

- Przygotowanie docelowego DNA

- Izolacja genomowego DNA

- Trawienie

- Rozdział w żelu agarozowym

- Transfer na specjalną membranę (stały nośnik)

- 1975 - Edwin Southern - Metoda Southtern - transfer kapilarny do góry

- przenoszenie DNA z żelu na membranę to tzw. "bolting": - klonalny transfer

- Bufor alkaliczny - w nim zmiana dsDNA na ssDNA

- żel; na żel membrana; na membranę papier (membrana z nitrocelulozy, nylonowa)

- papier ciągnie bufor, z buforem ssDNA wędruje do góry, i osadza się na membranie.

- Elektrotransfer - inny typ hybrydyzacji, z użyciem prądu

- koniecznie w żelu piliakrylamidowym

- membranę wkładamy do naczynia z roztworem wyznakowanym sondą która była wcześniej gotowana żeby była ss, a nie ds

- do ssDNA dolewamy zdenaturowaną sondę molekularną

- znacznik pokaże gdzie sonda przyczepiła się do konkretnej cząsteczki

- Inne zastosowania hybrydyzacji kwasów nukleinowych:

- Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ - FISH - pokazuje marker w cząsteczce DNA np. na chromosomie

- wykrywanie defektów genetycznych

- pokazanie w jakim narządzie lub tkance wyznacza się dany gen - celujemy w produkt genu (docelowe RNA - ss)

- Southern - DNA-DNA; Northern RNA-DNA;

- Western

- rozdział białek SDS PAGE (co innego niż southern i northeen bo odnosi się do białek, ale podobna zasada użycia!)

- elektrotransfer na membranę nylonową

- oddziaływania białko - przeciwciało

- przeciwciało I-rzędowe (poli lub monoklonalne)

- inkubacja z przeciwciałem II rzędu - fluorescencja/znakowanie radioaktywne

- Screening - przeszukiwanie dużej ilości rekombinantów/klonów w celu znalezienia właściwego, zawierającego poszukiwany gen

- mieszanina różnych fragmentów i chcemy odnaleźć jakiś konkretny

- do wektora plazmidowego

- każda z kolonii może mieć co innego w plazmidzie a my chcemy wciąż coś konkretnego

- hybrydyzacja kolonijna - kolonie bakteryjne

- hybrydyzacja łysinkowa - wektor fagowy

- Hybrydyzacja kolonijna/łysinkowa - wyodrębnienie pojedynczego, konkretnego genu.

- sonda - do płytki dodajemy membranę do której przylepiają się bakterie. Membranę płuczemy w żelu lizującym. Do roztworu sondy molekularnej

- Warunki hybrydyzacji

- sonda minimum 17 nukleotydów

- stężenie kwasów nukleinowych - dużo DNA/RNA, mało sondy

- temperatura - minimum 45° - inaczej reakcja z sondą nie zajdzie specyficznie

- siła jonowa - im niższe stężenie tym niższa stabilność. Optymalnie 1.5M NaCl

- odpowiednie stężenie substancji destabilizujących helisę - np. formamidu

Analizy genomów

Genom - całkowite DNA komórkowe

- genomika strukturalna - tworzenie mapy fizycznej, całkowita struktura

- genomika funkcjonalna - wyszukiwanie funkcji danego genu

- wspólna cecha - globalne podejście do analizowania problemu. "-omica"

- transkryptomika - kompletny zestaw transkryptów

- proteonika - kompletny zestaw białek

- metabolika - globalne analizy produktów metabolizmu

- glikonika - globalne profilowanie składu cukrowego

6.XII.2011r.

Analizy genomów cd.

- "omiki" - dają nam pełniejszy niż dotychczas obraz działania żywych organizmów

- Porównanie genomów eukariotycznych i prokariotycznych

- "C" - ilość DNA w genomie, ale także "characteristic" czyli stosunkowo stała ilość DNA w danym genomie

- paradoks wielkości C - wielkość genomowa nie jest skorelowana z wielkością organizmu.

Prokariota	małe	koliste	nie	nie	dużo genów	prawie brak
eukariota	duże	liniowe	tak	tak	DNAśmieciowe	wiele
cecha	wielkość	chromosom	centrosomy	telomery	organizacja	powtórzenia

- Mapowanie fizyczne genomów

- genomika strukturalna - najdokladniejsza mapa / sekwencja nukleotydów

(- mapa genetyczna - niedokładna, zbyt mała rozdzielczość)

- tworzenie map fizycznych o wysokiej rozdzielczości - sekwencjonowanie genów

- jest to dekonstrukcja genomu, a następnie jego rekonstrukcja

- strategia hierarchiczna - conting klonów - do niedawna uważana za najlepszą

- strategia przypadkowej fragmentacji genomu "shotgun" - ostatnio, przy wprowadzaniu nowej generacji badań, coraz bardziej uznawana

- Strategia hierarhiczna:

- dzielimy genom na "mniejsze" fragmenty i klonujemy do odpowiednich wektorów - tworzymy tzw. Biblioteki genomowe.

- tworzenie contigów

- biblioteka genomowa - całe genomowe DNA, tylko że w kawałkach i na wektorach.

- genom podzielić trzeba na np. 2,8 x 10⁶pz, przy wielkości 20kpz potrzeba n = 140

- ale! N musi być większe, bo klony się powtarzają i wykluczają

- dla 95% pewności n x 3

- dla 99% n x 5 - biblioteka reprezentatywna.

- krótko mówiąc musi być nadmiar, i to duży

- Wybór enzymu:

- zasada - im większa wstawka, tym mniej klonów do porządkowania

- jak się jednak okazuje, najlepsze są jednak enzymy 4kowe i 6kowe, ale robimy nimi "cięcie ograniczone" (dużo DNA, mało enzymu, czyli na danym kawałku DNA przecięte zostanie np. losowo 3 z 5 możliwych miejsc) co da nam dużo bardzo różnych kawałków.

- Wybór wektora:

- Kosmidy, BAC, sztuczny chromosom drożdżowy YAC, PAC

- PAC

- wektor pochodny z bakteriofaga P1

- dwa miejsca loxP - pozwala na kolistość

- system klonowania PAC, P1

- P1 - plazmid F, wszystkie cechy wektora P1, ale zamiast pakowania w główki, wprowadzamy elektroporacją.

- wstawki 100-300kpz

- sztuczny chromosom bakteryjny BAC

- na plazmidzie F

- duża stabilność DNA

- łatwy do manipulacji

- niechimeryczny

- wysoka wydajność transformacji

- conting - ciąg - seria zachodzących klonów lub sekwencji, które wspólnie pokrywają jakiś region chromosomu, cały chromosom lub cały genom.

- spacery po chromosomie - wstawki które nachodzą na siebie, używamy markera, sondę specyficzna. Metoda praktycznie na nic:) i to rozumiem :p

- mapowanie restrykcyjne, metoda "odciska palca" enzymów restrykcyjnych

- najmniej 5 kolejnych fragmentów by uznać je za podobne

- maksymalnie fragmenty 50 - 100kpz

- mapowanie sekwencji markerowych STS i ETS

STS:

- Mapowanie przez miejsca znaczone sekwencyjnie (STS - krótka sekwencja 100-500pz)

- z PCR bo łatwo ją zautomatyzować

- powielanie się etykietek, czyli fragment się powtarza

EST:

- sekwencyjne znaczniki ekspresji - specyficzne STS

- krótkie sekwencje uzyskiwane analizą klonów cDNA, postaje w wyniku odwrotnej transkrypcyjnej mRNA

- EST wykazuje od razu powiązanie z genami

20.XII.2011r.

HGP i inne projekty sekwencjonowania genów - czytanie DA na dużą skalę

- NCBI - bank informacji

- 132 067 413 372 baz genów

- 144 458 648 sekwencji

- jako pierwszy Fleishmann i wsp. 1995 - Shotgun strategy w 6 miesięcy

- Froster i wsp. 1995 - Mycoplasma genitalium

- bez ściany kom

- małe genomy

- pasożyty ludzi, zwierząt i owadów

- genomika porównawcza

- escherichia coli - miała być pierwsza (w końcu tak znana i lubiana)

- 4,6 Mpz

- 4288 potencjalnych genów

- 11% - odcinki regulatorowe

- średni gen 951 nukleotydów, najdłuższy ma 7149

- drożdże

- gen na 2kb

- 70% genomu koduje

- 4% genów mających introny

- genomy eukariotyczne elegans (ten włośnik) i muszka owocowa

- c. elegans

- 96mln par nukleotydów

- 19 tys. Genów

- muszka

- 180mln pz

- 13 tys. Genów

- projekt poznania ludzkiego genomu (HGP)

- Celer i jego kompania - tworzenie mapy genomowej

- co mamy w genach?

- HGP - 24 500 genów + ok. 5000 podejrzanych

- Celer - 26 000 genów + 100 podejrzanych

- teraz uważa się że genów jest 26 473 z czego 18 471 pewnych

- odczytywanie Y trwało 13 lat

- jesteśmy bardzo podobni na poziomie DNA - 99,9%

- obce geny - horyzontalny transfer genów

- czego nie wiemy?

- dokładnej liczby, lokalizacji i funkcji genów nie znamy

- regulacji genów nie znamy

- 2007 - pierwszy indywidualny genom

- po 4 miesiącach za 1,5 mln dolców następny, nowymi technikami

- z szympansami rozdzieliliśmy ok. 5-7mln lat temu.

- porównanie z szympansami możemy wykryć co nam daje człowieczeństwo

- różnimy się 1,23% genomu. Różnica mała ale wielka ;)

` - metagenomika - genomika całych populacji

3.I.2012

Genomika funkcjonalna - jak działają geny i genomy?

1) Analizy transkryptomu

- Adnotacja:

- pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydowej genomów - analiza bioinformatyczna. Etap przeprowadzany kompterowo.

- identyfikacja genów sekwencji regulatorowych i przypisywanie im funkcji (hipotetycznych)

- nie jest to etap ostateczny, musi być potwierdzony eksperymentalno.

- np. potranslacyjne sprawdzanie działania genów.

- Analiza transkryptu komórki (globalne, czy wybranych genów) dostarcza wiele cennych informacji dotyczących sposobu działania genomu.

- umożliwia lokalizować granice intron-egzon w przypadku genów nieciągłych

- ukazuje poziom i czas ekspresji genów

- mapowanie we fragmentach DNA pozycje transkrybowane mówią nam, że w konkretnym rejonie znajdują się geny. Wykorzystywanie transkryptu

- Test typu Northern - najprostsza metoda sprawdzenia czy dane fragmenty zawierają sekwencje ulegającą ekspresji.

- ekstrakcja RNA z komórki (uwaga RNAzy, rola DEPC)

- elektroforeza w warunkach denaturujących

- łatwa u eukariontów - ogonki poly(A)

- trudna u bakterii - szybka degeneracja, krótki okres półtrwania.

- żel agarozowy musi być z dodatkiem formaldehydu - zapobiega tworzeniu dsRNA

- Transfer na membranę - jak w southern, różnice w transferze

- przygotowanie sondy - najczęściej wyznakowane DNA, który podejrzewamy o bycie genem.

- hybrydyzacja i detekcja

- RT-PCR

- izolacja z komórki calkowitego mRNA lub RNA

- startery do PCR do genu którego poszukujemy

- bierzemy odwrotną transkryptazę - robimy cDNA i powielamy

- na żelu widzimy prążek z transkryptem mRNA

- Real-Time PCR

- PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym, bez potrzeby np. elektroforezy.

- od normalnego PCR różni się polimerazą

- dodatkowo - krotki odcinek DNA, który pasuje do wewnętrznej części nici.

- ten kawałek powinien mieć dwa przyczepy - jeden odpowiadający za fluorescencję, drugi za jej blokowanie.

- tylko po fizycznym odłączeniu blokera od cząsteczki, następuje fluorescencja.

- na żywo, oznacza to, że jeśli się świeci, to amplifikacja się odbyła.

- wydajność tej amplifikacji możemy już zmierzyć, przez pomiar fluorescencji.

- więcej powtórzeń genów - więcej fluorescencji.

- Badanie promotorów i innych sekwencji regulatorowych za pomocą genów receptorowych pozwala pokazać różnice w poziomie ekspresji genów

- gen receptorowy - łatwo zaobserwować jego ekspresję w fenotypie

- aby gen receptorowy mógł wiarygodnie wykazać gdzie i kiedy ulega ekspresji tworzymy "fuzję transkrypcyjną"

regulator

badany gen

|

|

|

V

regulator

gen receptorowy

- fuzja transkrypcyjna, widzimy aktywność danego genu i jego ekspresji pod wpływem regulatora.

- lacZ - β-galaktozydazy --> detekcja - test histohemiczny

- GUS - dobry receptor u roślin, bo nie posiadają go one

- Lucyferyna - Lux, bioluminescencja - u bakterii i eukariota.

- GFP - białko zielonej fluorescencji - działa wszędzie, jest zajebista, Nobel normalnie.

- Globalne - (duża liczba genów) analizy transkryptomu - macierze DNA

- macierz DNA - zbiór fragmentów DNA prezentujące kodujące odcinki DNA

- Inne nazewnictwo

- "probe" - sonda - kwas nukleinowy o znanej sekwencji unieruchomionej na nośnikach

- "target" - wolny, pływa sobie.

- Macierz DNA - globalne analizy transkryptomu. Takie ułożenie cząsteczek DNA reprezentujące kodujące odcinki genomu czyli geny badanego organizmu, przeznaczone do równoległych analiz hybrydyzacyjnych, za pomocą których możemy pokazać np. wyrażanie danego genu w komórce; wszystkie lub prawie wszystkie geny na raz

- makro (mało sond; mała pojemność) macierz

- mikro (dużo sond; zmieści wszystkie geny genomu) macierz

- cDNA

- oligonukleotydowa

1) mikromacierz cDNA

- mRNA na cDNA, i na stały nośnik, długość 500-5000pz

- zastosowanie - porównywanie ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami

- przygotować trzeba też 2 targety - kontrolny i badany target rywalizują o macierz, gdzie więcej wyznakowanego targetu, tym bardziej widoczny dany target.

2) mikromacierz oligonukleotydowa

- na stałej powierzchni, bardzo krótkich odcinków (20-80pz) bez ekstrakcji

- tak zwany Gene Choip ® ;)

- ilość mRNA różnych genów w pojedynczej próbce

- gdzie więcej powtórzeń danego genu, tym lepiej widać oznakowanie.

10.I.2012r.

• Analiza przypadkowa - bakteria na płytke -> naświetlanie UV i obserwacja, jak zmienił się fenotyp i jakie geny się zmieniły

• Analiza ukierunkowana - mamy konkretny gwn, odcinek genu i wyłączamy go i sprawdzamy jak to działa na komórkę - obecne badania

- Do czego służył ten gen

- wprowadzić mutację w genie - nie działa gen

- niektórych nie da się wyłączyć, dlatego bada się je za pomocą:

- zmiany poziomu jego ekspresji

- blokoowanie genu na etapie gdy powstał już trankrypt

1) Inaktywacja - odcinek DNA w wektorze zostawiamy końce genu i wyrzucamy - kontrakt

2) mikroinekcja in vitro DNA do jednego przedjądrzy zapłodnionej komórki janowej, przed ich połączeniem.

3) zastosowanie zarodkowych komórek macierzystych ES - totipotencjalnych, tzn. takie które mogą zamienić w każde inne

- uzyskanie konstruktu do do mutagenezy

- tylko pewien procent transgenów włącza się we właściwej pozycji genomowej w wyniku homologicznej rekombinacji

- pozwala to na celowe uszkodzeniu badanego genu i uzyskanie tzw. Myszy transgenicznych z "knock-outowych" dzięki którym możliwe staje się badanie funkcji genów

- SCID - transgenomiczna mysz - złożony niedobór immunologiczny, bezwłosa

- dlaczego wycinanie DNA za pomocą Creilox P jest takie użyteczne?

- Cre rekombinaza miejscowo specyficzna, która działa na miejsce loxP

- jak spotka dwa razy blisko siebie loxP, to między nimi wycina kawałek

- Cre - z faga P

- jak za tego pomocą zablokować ekspresje określonego genu w określonej tkance/narządzie

Wprowadzenie precyzyjnych zmian do sekwencji genomu np. zmiany poj. Nukleotydów

- nadekspresja genu - cel to ustalenie czy znacząco zwiększona ekspreska badanego genu ma wpływa na fenotyp organizmu

- cDNA - wyklucza zjawisko degradacji transkryptów

- potranskrypcyjne wyciszenie genu

- antysensowane RNA (aRNA)

- ssRNA może tworzyć struktury dsRNA za pomocą drugiej nici komplementarnej

- ta druga nić to aRNA

- utworzenie dsRNA zahamuje ekspresję genu

- interferentne RNA (RNAi)/PTGS

- duża ilość 2-niciowego RNA

- jest to niecodzienne; komórka zaczyna się bronic - rybonukleaza Dicer tworzy siRNA

- siRNA + inna rybonukleaza łączą się, jedna nić się odczepia a pozostały kompleks "czyha" ten kompleks to RISC

- jak znajdzie komplementarny mRNA to się łączy i rozcina

- powszechne u eukaryta

- drogi wprowadzania - wstrzyknięcie dsRNA syntetyzowanych enzymatycznie

-

-

-

---