Spektrofotometria UV-VIS

1. Absorpcja promieniowania a struktura cząstki

Absorpcja to inaczej pochłonięcie części promieniowania przechodzącego przez materię. Warunkiem absorpcji promieniowania przez substancję jest odpowiednia energia promieniowania związana ze zmianami energii towarzyszącymi przejściom elektronów między poziomami zewnętrznych powłok elektronowych.

Zmiany energii związane są z częstością drgań lub dł. Fali:

, gdzie h - stała Plancka

Efekty absorpcji UV i VIS obserwuje się w widmach związków z wielokrotnymi wiązaniami, posiadających ruchliwe elektrony.

Zmiany stanów energetycznych w cząsteczce mają złożony charakter, a na całkowitą energię cząsteczki składają się:

1. Energia rotacji - obroty atomów wokół środka masy

2. E. oscylacji - drgania atomów wokół położenia równowagi

3. E. elektronowa - energia kinetyczna ruchów elektronów i potencjalna związana z przyciąganiem ich przez jądro oraz odpychaniem przez sąsiednie elektrony.
   

Wrażenie barwy substancji związane jest z jej zdolnością pochłaniania niektórych długości fal.

2. Grupy chromoforowe i auksochromowe:

Zjawisko absorpcji światła wiąże się z obecnością w cząsteczce pewnych grup atomów:

1. Auksochromy - zwiększenie intensywności barwy dzięki grupom:
   -OH, -NH₃, -CH₃

2. Chromofory - grupy z wiązaniami podwójnymi, wpływające na powstanie barwy:
   -CH=CH-, -N=N-, =C=O

3. Prawa absorpcji Bougera-Lamberta-Beera. Prawo addytywności.

• Bouger i Lambert stwierdzili że natężenie promieniowania przechodzącego przez ośrodek absorbujący zmniejsza się gdy rośnie grubość warstwy absorbującej.
  
  
  
  

K = 2,3026 k

Stosunek I/I₀ nosi nazwę transmitancji (wartości przepuszczalności)

A w postaci logarytmicznej

, gdzie A nazywa się absorbancją.

• Beer wykrył zależność pomiędzy stężeniem substancji absorbującej w roztworze i natężeniem promieniowania zaabsorbowanego:

• Prawo Bougera-Lamberta-Beera. Łącząc poprzednie prawa uzyskujemy zależność:

Lub

Prawo to odnosi się do przypadku gdy w roztworze jest jedna substancja absorbująca.

• Prawo addytywności absorbcji dotyczy przypadku, gdy w próbce znajduje się n różnych substancji, charakteryzujących się odpowiednio stężeniami:
  c₁,c₂,…,c_n oraz molowymi współczynnikami absorbancji ε₁, ε₂,…, ε_n :

Warunkiem tego prawa jest brak jakichkolwiek reakcji pomiędzy substancją absorbującą a rozpuszczalnikiem oraz między cząsteczkami substancji absorbującej.

Przyczyny odstępstw od tych praw:

• Chemiczne - spowodowane przez reakcje przebiegające w miarę wzrostu stężenia składnika oznaczonego. Mogą powodować je również zmiany stężeń składników, a także tworzenie się kompleksów, polimeryzacja oraz kondensacja wewnątrz próbki.

• Instrumentalne -spowodowane brakiem wystarczająco monochromatycznego promieniowania, rozpraszania się światła, a także niedokładnością aparatur.
  

4. Metody oznaczeń spektrofotometrycznych.
   

• Metoda krzywej wzorcowej:
  Polega na ustaleniu zależności pomiędzy stężeniem substancji oznaczonej w roztworze i absorbancją.
  Absorbancję uzyskuje się przez porównanie pomiarów wykonanych dla roztworu substancji oznaczanej i odnośnika.
  Następnie wybieramy długość fali, która jest najchętniej pochłaniana przez naszą próbkę (ustalenie maksimum absorpcji). Długość tej fali przyjmujemy jako analityczną długość fali.
  Następnie przygotowuje się serię roztworów oznaczanej substancji o różnych, stopniowo wzrastających stężeniach (np. 0,05 ; 0,2 ; 0,6; 0,8 [mM])
  Kolejno bada absorbancję przygotowanych roztworów, a wyniki umieszcza się na wykresie prowadząc krzywą, która przeważnie jest linią prostą.
  Z wykresu możemy teraz odczytać nieznane stężenie substancji na podstawie wykonania pomiaru jej absorbancji.
  

• Spektrofotometria różnicowa:
  Polega na tym, że zamiast rozpuszczalnika, stosuje się roztwory substancji oznaczonej o stężeniach znanych.
  
  Przygotowuje się dwa roztwory porównawcze o stężeniu mniejszym i większym od stężenia substancji oznaczonej. Jeżeli różnica transmitancji tych roztworów w stosunku do odnośnika wynosi 10% to uzyskuje się w ten sposób 10 razy bardziej precyzyjne pomiary.
  

• Miareczkowanie spektrofotometryczne:
  Stosuje się ją w celu ustalenia punktu końcowego miareczkowania, wtedy, gdy zmiana barwy w tym punkcie nie jest wystarczająco wyraźna.
  
  Kiuwetę z roztworem badanym wstawia się do spektrofotometru i mierzy absorbancję po każdym dodaniu porcji titrana. Punkt końcowy miareczkowania można łatwo odczytać z wykresu zależności absorbancji od stężenia.
  

5. Aparatura stosowana w pomiarach….
   
   Do pomiarów spektrofotometrycznych używamy urządzeń zwanych spektrofotometrami.
   
   Spektrofotometr służy do pomiarów ekstynkcji rozcieńczonych roztworów barwnych absorbujących światło. Stosowany jest m.in. w absorpcyjnej analizie spektralnej do pomiaru przepuszczalności lub absorpcji promieniowania w funkcji długości fali.
   Zwykle składa się z 3 podstawowych elementów:
   Możemy wyróżnić następujące składowe typowego spektrofotometru:

• źródło promieniowania - np. lampy: wodorowa lub deuterowa dla zakresu UV, wolframowa lub halogenowa dla zakresu VIS;

• monochromator - jego zadaniem jest rozszczepienie promieniowania polichromatycznego emitowanego przez źródło promieniowania i wyodrębnienie wąskiego zakresu długości fali. Zbudowany jest z kolimatorów (układów przesłon służących do uzyskania równoległej wiązki promieniowania) na wejściu i wyjściu oraz pryzmatu lub siatki dyfrakcyjnej zastosowanych do rozszczepienia światła. Po przejściu przez monochromator promieniowanie pada na odpowiednio wąską szczelinę wyodrębniającą pożądany zakres promieniowania;

• kuweta pomiarowa - specjalne naczynie zawierające roztwór badany lub odnośnik.

• detektor - przetwarza energię padającego promieniowania elektromagnetycznego na energię elektryczną. Funkcję tę spełnia fotokomórka, fotopowielacz, fotoopornik lub fotodioda.

• układ pomiarowy (rejestrator) - galwanometr lub mikroprocesor.

Schemat blokowy spektrofotometru:

rys.72.5

6. Spektrofotometryczne oznaczanie żelaza w postaci kompleksów z o-fenantroliną metodą krzywej kalibracyjnej.
   
   Jony żelazowe tworzą z bezbarwną 1,10-fenantroliną pomarańczowoczerwony kationowy kompleks chelatowy.
   Kompleks ten jest trwały i może istnieć w zakresie ph 2-9.
   Reakcje przeprowadza się zazwyczaj w środowisku buforu octanowego lub cytrynianowego.
   Najpierw należy jednak zredukować jony Fe(III) do Fe(II) za pomocą reduktora hydroksyloaminy lub kwasu askorbinowego.
   
   
   Sporządzenie krzywej wzorcowej:
   
   - Do 5 kolbek miarowych poj. 50 cm³ odmierzyć kolejno: 2;5;10;15;20 cm³ roztworu wzorcowego żelaza (III)
   - do każdego roztworu dodać 1cm³ chlorku hydroksyloaminowego, 5 kropli cytrynianu sodu i 5cm³ roztworu 1,10-fenantroliny
   - uzupełnić wodą do kreski i dobrze wymieszać
   
   Jako odnośnik („ślepą próbę”) sporządzić roztwór zawierający wszystkie odczynniki wywołujące reakcje barwną w ilościach podanych powyżej i rozcieńczony w kolbie miarowej wodą do kreski.
   
   Pomiar należy wykonać w zakresie długości fali 400-600nm po 10 minutach od chwili sporządzenia roztworu, stosując roztwór odnośnika. Następnie odczytać analityczną długość fali (długość najchętniej pochłanianą), wykorzystując do tego zależność absorbancji od długości fali.
   
   Wykonać następnie pomiary zależności absorbancji od stężenia stosując przygotowane wcześniej roztwory wzorcowe.
   
   Oznaczanie zawartości żelaza w badanej próbce:
   
   - otrzymaną próbkę rozcieńczyć wodą destylowaną do kreski w kolbie miarowej o poj. 100cm³ i dokładnie wymieszać.
   - pobrać 20cm³badanego roztworu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 50cm³, dodać 1cm³ chlorku hydroksyloaminowego, 5 kropli cytrynianu sodu i 5 cm³ roztworu 1,10-fenantroiny, następnie uzupełnić wodą do kreski i dobrze wymieszać.
   - dokonać pomiaru absorbancji przy wyznaczonej wcześniej długości fali analitycznej, stosując jako odnośnik „ślepą próbę”
   - odczytać zawartość żelaza z krzywej wzorcowej.
   

---