Nowiny Lekarskie 2007, 76, 1, 70-72

MAGDALENA RUTKOWSKA, MARIA ISKRA

HISTORIA BADAŃ NAD WPŁYWEM STRESU OKSYDACYJNEGO

NA MODYFIKACJĘ BIAŁEK

HISTORY OF THE EFFECT OF OXIDATIVE STRESS ON MODIFICATION OF PROTEINS

Zakład Chemii Ogólnej

Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej

Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Maria Iskra

Streszczenie

Artykuł ukazuje historię badań nad wpływem stresu oksydacyjnego i reaktywnych form tlenu na utleniającą modyfikację białek od 1906 roku

do współczesności. Szczególna uwaga poświęcona została mechanizmom powstawania pochodnych karbonylowych w uszkodzonych wolnych

aminokwasach i białkach.
SŁOWA KLUCZOWE: historia stresu oksydacyjnego, reaktywne formy tlenu, utleniająca modyfikacja białek.

Summary

This paper presents a history of the effect of oxidative stress, and reactive oxygen species on oxidative modification of proteins since 1906 until

now.
KEYWORDS: history of oxidative stress, reactive oxygen species, oxidative modification of proteins.

Historia badań

nad wpływem stresu oksydacyjnego

na modyfikację białek

Tlen

Pojęcie stresu oksydacyjnego pojawiło się w świecie

nauki w połowie lat 80-tych ubiegłego stulecia. Jednak

procesy związane z tym zagadnieniem były znane i

badane dużo wcześniej. Pojęcie stresu oksydacyjnego

jest ściśle związane z tlenem i jego reaktywnymi

formami (RFT). Jako pierwiastek wszechobecny, jest

on niezbędny komórkom do wytwarzania energii w

procesach utleniania, z drugiej strony, jest czynnikiem,

który je również uszkadza. Tlen obecny w atmosferze

jest cząsteczką trypletową, co oznacza, że jego orbitale

molekularne posiadają dwa niesparowane elektrony o

tym samym spinie [1]. Konsekwencje tego są niezwykle

istotne, ponieważ nie ma praktycznie drugiej cząstki, która

mogłaby sparować takie dwa elektrony. Jedynie 4-elektro-

nowa redukcja jest procesem całkowitej redukcji cząsteczki

tlenu, w wyniku której powstają dwie cząsteczki wody.

Niestety, bardzo często ma miejsce niepełna, częściowa

redukcja tlenu poprzez przyłączenie jednego elektronu,

co w rezultacie owocuje powstaniem anionorodnika

ponadtlenkowego, inicjującego powstawanie szeregu

aktywnych pochodnych oraz niebezpiecznych uszkodzeń

cząsteczek biologicznych. Około 2% tlenu jest

przekształcana w organizmie do RFT z czego w ciągu

sekundy 1/100 uszkadza związki biologicznie czynne, a

w szczególności białka [1, 2].

Stres oksydacyjny i wolne rodniki

Historia badań nad wolnymi rodnikami sięga roku

1948, kiedy to Stein i Weiss opublikowali w Nature

wyniki badań wskazujące, że podczas radiolizy wody

generowany jest rodnik hydroksylowy, a kilka lat

później w 1954 roku Commoner zidentyfikował go

w żywej materii [3, 4]. Chemik Pryor prowadzący w

latach 50-tych badania kliniczne nad wolnymi rodnikami

sugerował, że wytwarzane są one w organizmie w czasie

przebiegu szeregu procesów biochemicznych lub pod

wpływem czynników zewnętrznych [5]. Nie skłaniał się

on jednak w kierunku teorii Harmana, który w 1956 roku

wysunął hipotezę jakoby organizmy żywe generowały

wolne rodniki tlenowe przy okazji enzymatycznych

reakcji redoks [6]. Sugerował, że enzymy biorące udział

w tych reakcjach zawierają żelazo, ponadto uważał,

że śladowe ilości jonów żelaza lub innych metali

katalizują reakcje utleniania in vivo. Harman twierdził,

że wolne rodniki przyspieszają procesy starzenia

oraz powstawanie schorzeń degeneracyjnych [6].

Większość z tych przypuszczeń potwierdziła się w ciągu

kilkudziesięciu następnych lat. Identyfikacja dysmutazy

ponadtlenkowej (SOD) przez Fridovicha i McCorda w

1968 roku uwiarygodniła wolnorodnikową teorię starzenia

się Harmana [7]. Badając redukcję cytochromu c przez

oksydazę ksantynową stwierdzili, że nie jest ona następstwem

bezpośredniego kontaktu obu białek, lecz zachodzi pod

wpływem uwalnianego przez oksydazę ksantynową

anionorodnika ponadtlenkowego. Odkrycie to dowiodło

71

Historia badań nad wpływem stresu oksydacyjnego na modyfikację białek

w pełni, że głównymi utleniaczami komórki są rodniki

tlenowe, szczególnie rodnik hydroksylowy tworzący się w

reakcji Fentona [8] przy udziale jonów metali przejściowych.

Dopiero rok 1985 przyniósł definicję stresu oksydacyjnego

utworzoną przez Siesa, opisującą stan fizjologiczny związany

z wytwarzaniem wolnych rodników i reaktywnych form

tlenu. Obecność tych czynników powoduje zaburzenia

równowagi prooksydacyjnej i antyoksydacyjnej organizmu

z przewagą stanu prooksydacyjnego [9]. Powoduje to w

efekcie powstanie niekontrolowanych zmian prowadzących

do szeregu komplikacji w funkcjonowaniu organizmu, a

nawet do jego degeneracji.

Utleniająca modyfikacja białek

Wolne aminokwasy i białka są niezwykle wrażliwe na

utlenianie przez RFT znajdujące się w atmosferze, generowane

jako produkty uboczne w procesach metabolicznych lub

tworzących się podczas ekspozycji na promieniowanie

X-, γ- lub UV [10]. Zainteresowanie mechanizmami tych

procesów niezwykle wzrosło po opublikowaniu w Nature

wyników badań identyfikujących rodniki tlenowe w żywej

materii w połowie lat 50-tych [4].

Badania nad uszkodzeniem białek prowadzone były

już w pierwszej dekadzie XX wieku. Dużą część wiedzy

chemicznej dotyczącej utleniania białek powstała dzięki

Dakinowi, który w roku 1906 badał mechanizmy zmian,

jakim ulegają produkty degradacji białek w organizmie

zwierzęcym [11]. Prowadził on proste eksperymenty na

leucynie i innych aminokwasach poddając je działaniu

jonu metalu przejściowego w obecności nadtlenku wodoru,

reakcji Fentona. Dakin zauważył, że aminokwasy ulegają

transformacji do pochodnych z grupą karbonylową.

Przypuszczał, że w organizmie żywym reakcje te

katalizowane są przez specyficzne enzymy [11]. Ze

względu na stan ówczesnej wiedzy nie brał pod uwagę

roli jaką odgrywają w nich RFT. W roku 1925, wkrótce po

odkryciu glutationu, Hopkins badając jego właściwości

pro- i antyoksydacyjne zaobserwował, że obecność

jonów metali przejściowych sprzyja charakterowi

prooksydacyjnemu glutationu, a tym samym – inaktywacji

białek [12]. Rok 1954 przyniósł nowe fakty związane

z rodnikiem hydroksylowym (OH

•

) w żywej materii,

co zachęciło wielu badaczy do podążenia tym śladem.

Wpływ OH

•

na modyfikacje aminokwasów aromatycznych,

w tym tyrozyny i fenyloalaniny, badali w tym czasie

Dale i Jayson [13, 14]. Wyniki ich badań wskazywały

na powstanie hydroksypochodnych aminokwasów

aromatycznych. Na początku lat 60-tych Garrison

rozpoczął ilościowe badania utleniającej modyfikacji

białek. Zaproponował mechanizm, utleniającego rozpadu

wiązania peptydowego w łańcuchu bocznym tzw. peptide

α-amidation, z utworzeniem grup amidowych [15, 16].

Uważa się, że schemat ten występuje najczęściej podczas

fragmentacji łańcucha polipeptydowego. W roku 1963

Kopodlova i współpracownicy odkryli, że utlenianie

alifatycznych aminokwasów rodnikiem hydroksylowym

również prowadzi do powstania hydroksypochodnych

w łańcuchu bocznym aminokwasu [17]. W 1976

roku Aeschelbach wykazał, że podczas utleniania

aromatycznych aminokwasów w tym tyrozyny, dochodzi

do powstania rodnika fenoksylowego, a także rodników

tyrozylowych, które mogą ulegać dalszym reakcjom, np.

tworząc dityrozynę i inne związki [18]. Sytuacja ta ma

miejsce szczególnie wtedy, gdy nie są obecne związki

redukujące (tiole lub wit. E), które mogłyby zregenerować

tyrozynę. Lata 80-te przyniosły ogromną liczbę badań

nad utleniającą modyfikacją białek, prowadzonych

na różnych płaszczyznach tego zagadnienia. Szcze-

gólna uwaga poświęcona została mechanizmom

powstawania pochodnych karbonylowych, nad którymi

pracowali w latach 1983–1990 Levine, Stadtman i

Amici. Badali oni mechanizm utleniania łańcuchów

bocznych aminokwasów w białkach katalizowany

jonami metali (MCO, metal–catalyzed oxidation) [10,

19, 20]. Dowiedli, że modyfikacja łańcucha z lizyną,

argininą, tyrozyną lub proliną prowadzi do powstania

karbonylowych pochodnych tych aminokwasów. Badania

prowadzone na E. coli wykazały, że łańcuchy boczne

aminokwasów w enzymie syntetaza glutaminowa są szcze-

gólnie wrażliwe na utlenianie jonami metali [21].

Niezwykle ważną rolę odegrały badania zainicjowane

przez Cerami i Lee, którzy śledzili powstawanie grup

karbonylowych w reakcji pierwszorzędowej grupy

aminowej lizyny z cukrami redukującymi lub ich

pochodnymi [22]. Reakcja ta przebiega drugorzędowo z

etapem pośrednim, w którym tworzy się zasada Schiffa

a produkt końcowy, nazwany produktem Amadoriego,

jest związkiem ketoaminowym. Badania przeprowadzone

w latach 1986–1987 przez Gutteridge’a i innych nad

utleniającą modyfikacją białek przez MCO wyjaśniają,

że katalityczne właściwości żelaza i miedzi są powodem,

dla którego komórki posiadają białka chelatujące jony

metali, np. ferrytyna i transferyna, redukujących stężenia

tych reaktywnych metali [23]. W roku 1995 Koster

zaobserwował u ludzi, że zawartość żelaza wzrasta wraz z

wiekiem [24]. Sugeruje się, że proces ten może zwiększać

ryzyko utleniającego uszkodzenia białek a w rezultacie

przyspieszenia rozwoju chorób degeneracyjnych i procesu

starzenia się.

Pochodne karbonylowe stały się w ciągu ostatnich

lat jednym z najczęściej stosowanych markerów stresu

oksydacyjnego, a dokładniej – utleniającej modyfikacji

białek [25]. Przeprowadzone badania wskazują na istotną

rolę uszkodzenia białek w etiologii szeregu chorób.

Wzrost stężenia grup karbonylowych zaobserwowano w

miażdżycy, zapaleniu jelit, chorobie Alzheimera, zespołach

przyspieszonego starzenia oraz wielu innych [25–30].

Dalsze badania nad mechanizmami uszkodzenia białek oraz

udoskonalanie metod oznaczania produktów utleniania są

prowadzone w wielu laboratoriach na całym świecie.

72

Magdalena Rutkowska i inni

Piśmiennictwo

1. Beckman K., Ames B.: The free radical theory of aging ma-

tures. Physiol. Rev., 1998, 78, 2, 547-581.

2. McCord J.: The evolution of free radicals and oxidative stress.

Am. J. Med., 2000, 108, 652-659.

3. Stein G., Weiss J.: Chemical effects of ionizing radiations. Na-

ture, 1948, 161, 650.

4. Commoner B., Townsend J., Pake G.: Free radicals in biologi-

cal materials. Nature, 1954, 174, 689-691.

5. Pryor W.: Free radical reactions and their importance in bio-

chemical systems. Fed. Proc., 1953, 32, 1862-30.

6. Harman D.: Aging: a theorybased on free radical and radiation

chemistry. J. Gerontol., 1956, 2, 298-300.

7. McCord J., Fridovich I.: Superoxidae dismutase. An enzymic

functionfor erythrocuprein (hemocuprein), J. Biol. Chem.

1969, 244, 6049-6055.

8. Fenton J.: Oxidation of tartaric acid in presence of iron.

J. Chem. Soc., 1894, 65, 899-910.

9. Sies H., Cadenas E.: Oxidative stress:damage ti intact cells and

organs; Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1985, 1152,

617-31.

10. Stadtman E., Levine R.: Free radical-mediated oxidation of

free amino acids and amino acisd residues in proteins. Amino

Acids, 2003, 25, 207-218.

11. Dakin H.: The oxidation of amido-acids with theproduction of

substances of biological importance. J. Biol. Chem., 1906, 1,

171-176.

12. Hopkins F.: Glutathion. Ist influence in the oxidation of fats and

proteins. Biochem. J. 1925, 19, 787-819.

13. Dale W., Davies J., Gilbert C.: The formation of hydrogen

peroxide by alpha-radiation in the presence of the enzyme car-

boxypeptidase. Biochem. J., 1952, 51, 268-70.

14. Jayson G., Scholes G., Weiss J.: Formation of formylkynuren-

ine by the action of x-rays on tryptophan in aqueous solution.

Biochem. J., 1954, 57, 386-390k.

15. Garrison W., Jayko M., Bennet W.: Radiation-induced-

oxidation of protein in aquueous solution. Radiat. Res., 1962,

16, 483-502.

16. Garrison W.: Reaction mechanisms in radiolysis of

peptides,polipeptides and proteins. Chem. Rev., 1987, 87, 381-

398.

17. Kopodlova J., Liebster J., Babicky A.: The mechanism of ra-

diation chemical degradationof amino acids. Int. J. App. Radiat.

Isot., 1963, 14, 455-460.

18. Aeschelbach R., Amado R., Neukom H.: Formation of dityro-

sine cross-links in proteins by oxidation of tyrosine residues.

Biochim. Biophys. Acta, 1976, 439, 291-301.

19. Stadtman E.: Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: bio-

chemical mechanism and biomedical concequences. Free. Rad.

Biol. Med., 1990, 9, 315-325.

20. Amici A., Levine R., Stadtman E.: Conversion of amino acids

residues in proteins and amino acids homopolymers to car-

bonyl derivatives by metal-catalyzed oxidation reaction.

J. Biol. Chem., 1989, 264, 3341-3346.

21. Levine R.: Oxidative modification of gluthamine synthetase.

J. Biol. Chem., 1983, 258-11828-11833.

22. Lee A., Cerami T.: Handbook of the biology of aging, 3rd edn;

Academic Press, New York, 1990, 116-130.

23. Halliwell B., Gutteridge J.: Oxygen free radicals and iron in

relation to biology and medicine: some problems and concepts.

Arch. Biochem. Biophys., 1986, 246, 501-514.

24. Koster J., Sluiter W.: Is increased tissue ferritin a risk factor for

atherosclerosis and ischaemic heart disease? Br. Heart J., 1995,

73, 208-209.

25. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D. et al.: Protein carbonyl

groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta,

2003, 329, 23-38.

26. Fu S., Davies M., Stocker R. et al.: Evidence for roles of radi-

cals in protein oxidation in advanced human atherosclerotic

plaque. Biochem. J., 1998, 333, 519-525.

27. Berlett B., Stadtman E.: Protein oxidation in aging, disease, and

oxidative stress. J. Biol. Chem., 1997, 272, 20313-6.

28. Smith C., Carney J., Starke-Reed P. et al.:: Excess brain protein

oxidation and enzyme dysfunction in normal aging and in Al-

zheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10540-

4.

29. Dominguez C., Ruiz E., Gussinye M. et al.: Oxidative stress

at onset and in early stages of type 1 diabetes in children and

adolescents. Diabetes Care, 1998, 21, 10, 1736-42.

30. Lih-Brody L., Powell S., Collier K. et al.: Increased oxidative

stress and decreased antioxidant defenses in mucosa of inflam-

matory bowel disease. Dig. Dis. Sci., 1996, 41, 2078-86.

72