MODYFIKACJA

MODYFIKACJA

FIZYCZNA I

FIZYCZNA I

CHEMICZNA

CHEMICZNA

BIAŁEK

BIAŁEK

Denaturacja

Denaturacja

Denaturacją białka możemy przeprowadzić metodami

Denaturacją białka możemy przeprowadzić metodami

fizycznymi lub chemicznymi, zmian w strukturze białka,

fizycznymi lub chemicznymi, zmian w strukturze białka,

które prowadza do mniejszej lub większej utraty

które prowadza do mniejszej lub większej utraty

aktywności biologicznej białka, przy czym jego struktura

aktywności biologicznej białka, przy czym jego struktura

pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona. Podczas

pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona. Podczas

denaturacji w dużej mierze zniszczeniu ulegają wiązania

denaturacji w dużej mierze zniszczeniu ulegają wiązania

wodorowe, a w obecności odczynników redukcyjnych

wodorowe, a w obecności odczynników redukcyjnych

rozszczepieniu ulegają wiązania disiarkowego. Często

rozszczepieniu ulegają wiązania disiarkowego. Często

denaturacja jest odwracalna i po usunięciu czynnika

denaturacja jest odwracalna i po usunięciu czynnika

denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci.

denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci.

Proces ten nazywa się renaturacją. Renaturacja jest też

Proces ten nazywa się renaturacją. Renaturacja jest też

możliwa w przypadku denaturacji redukcyjnej. Podczas

możliwa w przypadku denaturacji redukcyjnej. Podczas

denaturacji zachodzą takie zmiany jak: zmniejszenie

denaturacji zachodzą takie zmiany jak: zmniejszenie

rozpuszczalności, może się w wyniku wyeksponowania

rozpuszczalności, może się w wyniku wyeksponowania

nowych zjonizowanych grup przesunąć pH punktu

nowych zjonizowanych grup przesunąć pH punktu

izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha może prowadzić

izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha może prowadzić

do zwiększenia się lepkości, a także absorpcji w

do zwiększenia się lepkości, a także absorpcji w

nadfiolecie. Obserwuje się też procesy agregacji i

nadfiolecie. Obserwuje się też procesy agregacji i

wytrącania, co jest związane z ze zmianą stopnia

wytrącania, co jest związane z ze zmianą stopnia

hydratacji i rozpuszczalności białek, a także zmianami w

hydratacji i rozpuszczalności białek, a także zmianami w

mostkach disiarkowych.

mostkach disiarkowych.

•

Fizycznymi metodami denaturacji białek

Fizycznymi metodami denaturacji białek

są:

są:

Silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie

Silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie

promieniami UV, rentgenowskimi lub

promieniami UV, rentgenowskimi lub

działanie ultradźwiękami.

działanie ultradźwiękami.

•

Denaturacja chemiczna zachodzi pod

Denaturacja chemiczna zachodzi pod

wpływem takich związków jak:

wpływem takich związków jak:

Roztwór mocznika (6-8 mol/dm3) lub

Roztwór mocznika (6-8 mol/dm3) lub

guanidyny (4 mol/dm3), na skutek działania

guanidyny (4 mol/dm3), na skutek działania

kwasów lub zasad (pH poniżej 3 lub powyżej

kwasów lub zasad (pH poniżej 3 lub powyżej

9), na skutek działania detergentów,

9), na skutek działania detergentów,

roztworów soli ciężkich lub niektórych

roztworów soli ciężkich lub niektórych

substancji organicznych takich jak: aceton,

substancji organicznych takich jak: aceton,

benzen, formaldehyd, benzyna. Poszczególne

benzen, formaldehyd, benzyna. Poszczególne

białka różnią się zdolnością do denaturacji.

białka różnią się zdolnością do denaturacji.

Hydroliza

Hydroliza

•

Hydroliza białek polega na depolimeryzacji białek na

Hydroliza białek polega na depolimeryzacji białek na

poszczególne aminokwasy. Hydrolizę białek można

poszczególne aminokwasy. Hydrolizę białek można

przeprowadzać na trzy sposoby: pod wpływem

przeprowadzać na trzy sposoby: pod wpływem

kwasu, zasady lub enzymu.

kwasu, zasady lub enzymu.

Hydroliza kwasowa polega na ogrzewaniu białka w

Hydroliza kwasowa polega na ogrzewaniu białka w

roztworze HCl o stężeniu 2 mol lub roztworze H2SO4

roztworze HCl o stężeniu 2 mol lub roztworze H2SO4

o stężeniu 4 mol przez 18-24 h. Jednak w warunkach

o stężeniu 4 mol przez 18-24 h. Jednak w warunkach

tych całkowitemu rozkładowi ulega tryptofan.

tych całkowitemu rozkładowi ulega tryptofan.

Podczas hydrolizy zasadowej najczęściej ogrzewa się

Podczas hydrolizy zasadowej najczęściej ogrzewa się

białko z NaOH o stężeniu 2 mol. Metoda ta jest

białko z NaOH o stężeniu 2 mol. Metoda ta jest

praktycznie nie stosowana, ponieważ zupełnie

praktycznie nie stosowana, ponieważ zupełnie

niszczy argininę, cysteinę i treoninę.

niszczy argininę, cysteinę i treoninę.

Najlepszą metodą hydrolizy białek jest hydroliza

Najlepszą metodą hydrolizy białek jest hydroliza

enzymatyczna, gdyż zniszczeniu nie ulegają żadne

enzymatyczna, gdyż zniszczeniu nie ulegają żadne

aminokwasy. Wadą tej metody jest powolność

aminokwasy. Wadą tej metody jest powolność

procesu, a co za tym idzie długi czas

procesu, a co za tym idzie długi czas

depolimeryzacji białka.

depolimeryzacji białka.

Metoda hydrolizy enzymatycznej znalazła

Metoda hydrolizy enzymatycznej znalazła

zastosowanie w określaniu sekwencji białek.

zastosowanie w określaniu sekwencji białek.

Reakcja plasteinowa

Reakcja plasteinowa

Kazeinę enzymatyczną wykorzystuje się do

Kazeinę enzymatyczną wykorzystuje się do

przekształcania białek w reakcji polegającej na

przekształcania białek w reakcji polegającej na

amidowym wiązaniu pożądanych reszt

amidowym wiązaniu pożądanych reszt

aminokwasów do peptydów hydrolizatu białkowego.

aminokwasów do peptydów hydrolizatu białkowego.

Za pomocą reakcji plasteinowej można z białka o

Za pomocą reakcji plasteinowej można z białka o

składzie ubogim z reszty aminokwasów

składzie ubogim z reszty aminokwasów

niezbędnych wytworzyć produkt o większej wartości

niezbędnych wytworzyć produkt o większej wartości

biologicznej. Można zmniejszyć gorzkość hydrolizatu

biologicznej. Można zmniejszyć gorzkość hydrolizatu

przez „ukrycie” hydrofobowych aminokwasów w

przez „ukrycie” hydrofobowych aminokwasów w

długich peptydach plastein. Stosując reakcję

długich peptydach plastein. Stosując reakcję

plasteinową katalizowaną papainą wobec

plasteinową katalizowaną papainą wobec

dietylowego estru kwasu glutaminowego można

dietylowego estru kwasu glutaminowego można

około dwukrotnie zmniejszyć gorzkość hydrolizatu z

około dwukrotnie zmniejszyć gorzkość hydrolizatu z

krwinek.

krwinek.

Schemat technologiczny otrzymywanie plastein.

Schemat technologiczny otrzymywanie plastein.

Reakcje katalizowane

Reakcje katalizowane

transglutaminazą

transglutaminazą

Transglutaminaza katalizuje reakcję przeniesienia acylu, w której

Transglutaminaza katalizuje reakcję przeniesienia acylu, w której

donorem jest grupa karboksyamidowa reszty glutaminy, a

donorem jest grupa karboksyamidowa reszty glutaminy, a

akceptorami mogą być pierwszorzędowe grupy aminowe w różnych

akceptorami mogą być pierwszorzędowe grupy aminowe w różnych

związkach.

związkach.

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – R→transglutaminaza→ Białko –

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – R→transglutaminaza→ Białko –

(CH2)2 – CONHR + NH3

(CH2)2 – CONHR + NH3

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – (CH2)4 – Białko→transglutaminaza→

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – (CH2)4 – Białko→transglutaminaza→

Białko – (CH2)2 – CONH(CH2)4 – Białko + NH3

Białko – (CH2)2 – CONH(CH2)4 – Białko + NH3

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2O →transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 –

Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2O →transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 –

COOH + NH3

COOH + NH3

Jeśli akceptorem jest wolny aminokwas, następuje wzbogacenie białka

Jeśli akceptorem jest wolny aminokwas, następuje wzbogacenie białka

o ten aminokwas, natomiast reakcja z grupą aminową reszty lizyny

o ten aminokwas, natomiast reakcja z grupą aminową reszty lizyny

związanej w białku powoduje sieciowanie. Istnieje również możliwość

związanej w białku powoduje sieciowanie. Istnieje również możliwość

deaminacji reszt glutaminowych, jeśli w nieobecności wolnych grup

deaminacji reszt glutaminowych, jeśli w nieobecności wolnych grup

aminowych acylu jest woda.

aminowych acylu jest woda.

Alkilowanie

Alkilowanie

Reakcje z grupami karbonylowymi wykorzystuje się

Reakcje z grupami karbonylowymi wykorzystuje się

do modyfikowania białek. Aldehydy glutarowy i

do modyfikowania białek. Aldehydy glutarowy i

mrówkowy służą do wiązania enzymów na

mrówkowy służą do wiązania enzymów na

nośnikach. Traktowanie aldehydem mrówkowym

nośnikach. Traktowanie aldehydem mrówkowym

zapobiega nadmiernej hydrolizie i deaminacji białek.

zapobiega nadmiernej hydrolizie i deaminacji białek.

W reakcjach z innymi związkami karbonylowymi

W reakcjach z innymi związkami karbonylowymi

wytwarzanie w swerze przez bakterie kwasu

wytwarzanie w swerze przez bakterie kwasu

mlekowego tworzą się inne pochodne. W kąpielach

mlekowego tworzą się inne pochodne. W kąpielach

do utwardzania włókien przy teksturowaniu biełek

do utwardzania włókien przy teksturowaniu biełek

roślinnych stosuje się róne aldehydy, np. skrobię

roślinnych stosuje się róne aldehydy, np. skrobię

dialdehydową.

dialdehydową.

Reakcje z aldehydami i cukrami redukującymi, w

Reakcje z aldehydami i cukrami redukującymi, w

warunkach redukujących wykorzystuje się do

warunkach redukujących wykorzystuje się do

alkilowania białek.

alkilowania białek.

Do alkilowania grup aminowych, hydroksylowych,

Do alkilowania grup aminowych, hydroksylowych,

imidazolowych, tiulowych i tioeterowych w resztach

imidazolowych, tiulowych i tioeterowych w resztach

aminokwasów służą również reakcje z kwasami

aminokwasów służą również reakcje z kwasami

chlorowcooctowymi lub chlorowcoacetamidami.

chlorowcooctowymi lub chlorowcoacetamidami.

Reakcje z polisacharydami

Reakcje z polisacharydami

Kowalencyjne wiązanie z odpowiednim polisacharydem

Kowalencyjne wiązanie z odpowiednim polisacharydem

może znacznie polepszyć właściwości funkcjonalne

może znacznie polepszyć właściwości funkcjonalne

białek. Produkt reakcji Maillarda miedzy aminowymi

białek. Produkt reakcji Maillarda miedzy aminowymi

grupami reszt lizyny i redukującą grupą polisacharydu

grupami reszt lizyny i redukującą grupą polisacharydu

otrzymywany podczas 2-tygodniowego inkubowania

otrzymywany podczas 2-tygodniowego inkubowania

mieszaniny suszonej albuminy jaj z galaktomannanem

mieszaniny suszonej albuminy jaj z galaktomannanem

ma właściwości jako emulgator niż wyjściowe białko.

ma właściwości jako emulgator niż wyjściowe białko.

W kompleksach z agarem, furcelaranem, karageniną,

W kompleksach z agarem, furcelaranem, karageniną,

kwasami alginowymi i karboksymetylocelulozą

kwasami alginowymi i karboksymetylocelulozą

występują wiązania jonowe, natomiast obojętne

występują wiązania jonowe, natomiast obojętne

polisacharydy tworzą z białkami wiązania wodorowe i

polisacharydy tworzą z białkami wiązania wodorowe i

hydrofobowe.

hydrofobowe.

Reakcje białek z polisacharydami wykorzystuje się do

Reakcje białek z polisacharydami wykorzystuje się do

modyfikowania właściwości wielu przetworów

modyfikowania właściwości wielu przetworów

żywnościowych, frakcjonowania i strącania białek z

żywnościowych, frakcjonowania i strącania białek z

roztworów oraz do osadzania enzymów na nośnikach.

roztworów oraz do osadzania enzymów na nośnikach.

Acylowanie grup

Acylowanie grup

nukleofilowych w bialkach

nukleofilowych w bialkach

Szybkość acylowania zależy od własności czynnika acylującego

Szybkość acylowania zależy od własności czynnika acylującego

i grupy nukleofilowej, od pH środowiska, konformacji

i grupy nukleofilowej, od pH środowiska, konformacji

acylowanego białka oraz od obecności inhibitorów. Najłatwiej

acylowanego białka oraz od obecności inhibitorów. Najłatwiej

acylują się pierwszorzędowe grupy aminowe, zwłaszcza

acylują się pierwszorzędowe grupy aminowe, zwłaszcza

aminowe grupy reszty lizyny, grupa fenolowa trozyny.

aminowe grupy reszty lizyny, grupa fenolowa trozyny.

Jako czynnik acylujący stosuje się bezwodniki kwasowe w

Jako czynnik acylujący stosuje się bezwodniki kwasowe w

słabo zasadowym środowisku lub inne pochodne dobrane do

słabo zasadowym środowisku lub inne pochodne dobrane do

charakteru wprowadzanej grupy. Przy wyborze czynnika

charakteru wprowadzanej grupy. Przy wyborze czynnika

acylującego uwzględnia się szybkość i wydajność reakcji

acylującego uwzględnia się szybkość i wydajność reakcji

głównej.

głównej.

Poprzez acylowanie można zwiększyć lub zmniejszyć

Poprzez acylowanie można zwiększyć lub zmniejszyć

hydrofobowność białka, zmienić pI, wzbogacić cząsteczkę w

hydrofobowność białka, zmienić pI, wzbogacić cząsteczkę w

reaktywne grupy funkcyjne lub pożądane reszty

reaktywne grupy funkcyjne lub pożądane reszty

aminokwasowe włańcuchach bocznych, spowodować

aminokwasowe włańcuchach bocznych, spowodować

dodatkowe usieciowanie i zwiększyć zdolność wiązania jonów

dodatkowe usieciowanie i zwiększyć zdolność wiązania jonów

metali.

metali.

Reakcje z fosforanami

Reakcje z fosforanami

Fosforany w różnych warunkach środowiska

Fosforany w różnych warunkach środowiska

mogą reagować z białkami albo wpływać na

mogą reagować z białkami albo wpływać na

właściwości białek przez oddziaływanie na

właściwości białek przez oddziaływanie na

inne składniki żywności. Maja duże

inne składniki żywności. Maja duże

zastosowanie jako dodatki do żywności, mogą

zastosowanie jako dodatki do żywności, mogą

służyć jako dodatek buforujący,

służyć jako dodatek buforujący,

podwyższający lub obniżający pH, wiążące

podwyższający lub obniżający pH, wiążące

jony metali, zwiększyć zdolność białek do

jony metali, zwiększyć zdolność białek do

emulgowania lipidów, stabilizujące białka w

emulgowania lipidów, stabilizujące białka w

roztworach lub koagulujące, zwiększyć

roztworach lub koagulujące, zwiększyć

wodochłonność produktów mięsnych.

wodochłonność produktów mięsnych.

Fosforany, zwłaszcza polifosforany, wiążą się

Fosforany, zwłaszcza polifosforany, wiążą się

elektrostatycznie z dodatnio naładowanymi

elektrostatycznie z dodatnio naładowanymi

resztami aminokwasów. Grupy hydroksylowe,

resztami aminokwasów. Grupy hydroksylowe,

dzięki wiązaniom wodorowym z cząsteczkami

dzięki wiązaniom wodorowym z cząsteczkami

wody, tworzą warstwę hydratacyjną

wody, tworzą warstwę hydratacyjną

zapobiegającą koagulacji białek.

zapobiegającą koagulacji białek.

Modyfikacje potranslacyjne

Modyfikacje potranslacyjne

I.

I.

Obróbka proteolityczna odbywa się przy

Obróbka proteolityczna odbywa się przy

pomocy enzymów zwanych peptydazami,

pomocy enzymów zwanych peptydazami,

które są odpowiedzialne za cięcie łańcuchów

które są odpowiedzialne za cięcie łańcuchów

polipeptydowych na końcu łańcucha

polipeptydowych na końcu łańcucha

(egzopeptydazy) lub w jego środku

(egzopeptydazy) lub w jego środku

(endopeptydazy). Większość tych enzymów

(endopeptydazy). Większość tych enzymów

jest bardzo specyficzna - rozpoznają one

jest bardzo specyficzna - rozpoznają one

miejsce cięcia na podstawie sekwencji

miejsce cięcia na podstawie sekwencji

aminokwasowej. Dobrym przykładem może

aminokwasowej. Dobrym przykładem może

posłużyć proinsulina, której pierwotny

posłużyć proinsulina, której pierwotny

łańcuch polipeptydowy jest przecinany w

łańcuch polipeptydowy jest przecinany w

określonych miejscach, następnie dwa

określonych miejscach, następnie dwa

produkty są łączone za pomocą "mostków"

produkty są łączone za pomocą "mostków"

dwusiarczkowych.

dwusiarczkowych.

Istnieje kilka innych przykładów obróbek

Istnieje kilka innych przykładów obróbek

proteolitycznych:

proteolitycznych:

•

- aktywacja białka, poprzez wycięcie

- aktywacja białka, poprzez wycięcie

niepotrzebnego fragmentu łańcucha

niepotrzebnego fragmentu łańcucha

polipeptydowego

polipeptydowego

•

- usunięcie sekwencji liderowych

- usunięcie sekwencji liderowych

(fragmentów łańcucha, które kierują białko

(fragmentów łańcucha, które kierują białko

do odpowiedniego przedziału komórkowego)

do odpowiedniego przedziału komórkowego)

•

- w przypadku poliprotein płaszcza niektórych

- w przypadku poliprotein płaszcza niektórych

wirusów - pocięcie na fragmenty, aktywuje

wirusów - pocięcie na fragmenty, aktywuje

każdy z otrzymanych fragmentów

każdy z otrzymanych fragmentów

•

- rzadko występujący splicing polipeptydowy

- rzadko występujący splicing polipeptydowy

(podobnie jak obróbka preRNA) - wycinanie

(podobnie jak obróbka preRNA) - wycinanie

fragmentów ze środka łańcucha

fragmentów ze środka łańcucha

polipeptydowego

polipeptydowego

•

- usuwanie pierwszego podstawnika

- usuwanie pierwszego podstawnika

(metioniny lub formylometioniny)

(metioniny lub formylometioniny)

występujące u prawie 50% wszystkich białek

występujące u prawie 50% wszystkich białek

II.

II.

N-acetylacja , N-formylacja, N-

N-acetylacja , N-formylacja, N-

metylacja

metylacja

są rodzajami modyfikacji

są rodzajami modyfikacji

potranslacyjnych białek, w których

potranslacyjnych białek, w których

następuje przyłączenie do N-końca

następuje przyłączenie do N-końca

łańcucha polipeptydowego grup

łańcucha polipeptydowego grup

acetylowych (acetylacja),

acetylowych (acetylacja),

metylowych (metylacja) lub

metylowych (metylacja) lub

metioniny (formylacja).

metioniny (formylacja).

III.

III.

Glikozylacja

Glikozylacja

- w tym procesie następuje dołączenie reszt

- w tym procesie następuje dołączenie reszt

cukrowcowych do białek (Np.: białek błonowych).

cukrowcowych do białek (Np.: białek błonowych).

IV.

IV.

Hydroksylacja

Hydroksylacja

- w przypadku

- w przypadku

aminokwasów proliny i lizyny - dołączenie

aminokwasów proliny i lizyny - dołączenie

grupy -OH

grupy -OH

V.

V.

Poli (ADP)-rybozylacja

Poli (ADP)-rybozylacja

- dołączanie

- dołączanie

reszt adeninowych.

reszt adeninowych.

VI.

VI.

Fosforylacja

Fosforylacja

- aktywacja białka poprzez

- aktywacja białka poprzez

dołączenie reszty fosforanowej przez

dołączenie reszty fosforanowej przez

specyficzne enzymy - kinazy. Bardzo

specyficzne enzymy - kinazy. Bardzo

powszechnie występujące wśród białek

powszechnie występujące wśród białek

(Np.: czynniki transkrypcyjne).

(Np.: czynniki transkrypcyjne).

VII.

VII.

Defosforylacja

Defosforylacja

- deaktywacja białka

- deaktywacja białka

przez usunięcie reszty fosforanowej przez

przez usunięcie reszty fosforanowej przez

specyficzne enzymy - fosfatazy.

specyficzne enzymy - fosfatazy.

VII.

VII.

Ubikwitynacja

Ubikwitynacja

- (u organizmów

- (u organizmów

Eukariotycznych) dołączenie innego białka

Eukariotycznych) dołączenie innego białka

- ubikwityny powoduje, że białko jest

- ubikwityny powoduje, że białko jest

przeznaczone do degradacji. W procesie

przeznaczone do degradacji. W procesie

ubikwitynacji są usuwane (degradowane)

ubikwitynacji są usuwane (degradowane)

białka źle sfałdowane, wadliwe oraz takie

białka źle sfałdowane, wadliwe oraz takie

których "życie" dobiegło końca. Czas

których "życie" dobiegło końca. Czas

półtrwania białka jest zależny od rodzajów

półtrwania białka jest zależny od rodzajów

aminokwasów występujących na jego N-

aminokwasów występujących na jego N-

końcu.

końcu.