Wykład 5
Chemiczne metody znakowania
kwasów nukleinowych
Modyfikacje chemiczne kwasów nukleinowych
Kwasy nukleinowe nie mają dostępnych grup funkcyjnych:
aminowej, karboksylowej, sulfhydrylowej czy fenolowej
podlegajÄ…cych Å‚atwej modyfikacji do form reaktywnych
Modyfikacja zasad azotowych, reszt cukrowych i grup fosforanowych pozwalajÄ…ce
na uzyskanie pochodnych, które mogą być sprzęgane z innymi cząsteczkami
albo
Wprowadzanie specyficznych grup funkcyjnych
Chemiczne modyfikacje kwasów nukleinowych
1. Chemiczna modyfikacja nukleotydów
Wbudowanie
Przyłączanie znacznika
Modyfikacja
zmodyfikowanego
do kwasu nukleinowego
nukleotydu 
nukleotydu do łańcucha
reakcja chemiczna
wprowadzenie grupy
kwasu nukleinowego na
funkcyjnej
drodze enzymatycznej
2. Bezpośrednia znakowanie kwasów nukleinowych
na drodze modyfikacji chemicznej
Przyłączanie znacznika
Wprowadzenie do
do kwasu nukleinowego
DNA/RNA grupy
reakcja chemiczna
funkcyjnej
1. Modyfikacje zasad azotowych
Podstawienie nukleofilowe i elktrofilowe
1. Modyfikacje zasad azotowych
r1
Podstawienie nukleofilowe
Pirymidyny  C4 i C6 ( pod
wpływem działania bardzo silnych
nukleofili dochodzi do degradacji zasady).
Hydroksylamina , hydrazyna, bisulfid
Puryny  atak nukleofilowy na C2,
C6 i C8. SÄ… mniej podatne na podstawienie
nukleofilowe ni\
pirymidyny
Slajd 5
r1 nukleofil to cząsteczka lub grupa, która"lubi" dodatnio naładowane jądra innych atomów. Sama posiada nadmiar elektronów i w odpowiednich
warunkach jest skłonna się nimi podzielić, czyli być ich donorem.
Nukleofilami są wszystkie zasady. Oprócz tego mogą to być jednak cząsteczki, które nie wykazują \
adnych zasadowych własności, lecz tylko
mają "zwykły" nadmiar elektronów - pojęcie nukleofila jest więc szersze od pojęcia zasady.
przykładem nukleofili są OH-, F-, NH3 I-, CN-, benzen C6H6.
ryszard; 2009-03-09
1. Modyfikacje zasad azotowych
Podstawienie elektrofilowe
Alkilacja i acylacja najłatwiej zachodzi na
r2
heteroatomach (azot lub tlen)  pełnią rolę nukleofili z
N3 - najczęstsze
uwagi na swoją wysoką gęstość elektronową
miejsce
przyłączania
N3 -
karbodiimidów
najczęstsze
C5  halogenacja
miejsce alkilacji
( przyłączanie Br
lub I)
Reakcja sprzęgania
z gluteraldehydem
N-7
N-7
N-1  przyłączanie
N-1
karbodiimidu
C-8 C-8 - Najbardziej
C-8
popularny rodzaj
modyfikacji puryn 
podstawienie Br
(silnie reaktywny
intermediat)
N-3
N-3
N-1, N-3 i N-7 adeniny główne
N-3 i N-7 guaniny główne miejsca
miejsca alkilacji
alkilacji
Slajd 6
r2 Elektrofil - to cząsteczka lub grupa która "lubi" elektrony, czyli sama posiada ich niedomiar i w odpowiednich warunkach jest w stanie je przyjąć,
czyli być ich akceptorem.
Elektrofilami są wszystkie kwasy, zarówno te zgodne z definicją Brłnsteda, jak i te zgodne z definicją Lewisa. Oprócz tego mogą to być jednak
cząsteczki, które nie wykazują \
adnych kwasowych własności, lecz tylko mają "zwykły" deficyt elektronów - pojęcie elektrofila jest więc szersze
od pojęcia kwasu.
Przykłady twardych elektrofili to: H+, K+, AlCl3.
Przykłady miękkich elektrofili to: Br+, Ag+, BH3.
ryszard; 2009-03-09
1. Modyfikacje zasad azotowych
Modyfikacje innych miejsc mogą przeszkadzać w tworzeniu wiązań wodorowych
v
v
Uracyl cytozyna tymina
Adenina guanina
Najczęstsze miejsca modyfikacji zasad azotowych :
C-5 uracylu i cytozyny
v
v
Tymina ma w tej pozycji grupÄ™ metylowÄ…
Podstawienie
elektrofilowe najczęściej
oraz C-8 adeniny i guaniny
halogenacja
2. Modyfikacje grup cukrowych
W RNA ka\
da reszta cukrowa posiada wolnÄ… grupÄ™ 2 - OH, a na
końcu 3  dwie grupy OH
W DNA pozostaje tylko wolna grupa 3 -OH na końcu łańcucha
Najczęstsza modyfikacja to utlenianie reszt 3 - OH RNA do
dialdehydu z wykorzystaniem nadjodanu sodu
Modyfikacje grup fosforanowych
Wewnętrzne grupy fosforanowe łańcucha DNA lub RNA nie
podlegajÄ… modyfikacjom.
Tylko grupa fosforanowa na końcu 5 łańcucha mo\
e być
wykorzystywana w reakcjach biokoniugacji.
Modyfikacje zasad azotowych
Podstawienie nukleofilowe i elktrofilowe
Zasadniczo metody biokoniugacji przeprowadzane z
u\
yciem zasad azotowych nukleotydów mają na celu
wytworzenie intermediatów oddzielonych od reszty
puryny lub pirymidyny łącznikiem zakończonym grupą
aminowÄ…, sulfhydrylowÄ… lub karboksylowÄ…
I. Wprowadzanie grup aminowych
Uzyskane aminowe pochodne nukleotydów słu\
ą do przyłączania znaczników-
bezpośrednio lub z udziałem czynnika sieciującego
I.A. Przyłączanie grupy aminowej do reszty cytozyny za pośrednictwem
wodorosiarczanu sodowego (ang. Sodium bisulfite)
Wodorosiarczan sodowy to
czynnik mutagenny  reaguje
z ssDNA powodujÄ…c
przekształcenie cytozyny w
uracyl
Jeśli w trakcie tej reakcji w roztworze obecna będzie inna amina dochodzi do
reakcji transaminacji czyli zamiany grupy aminowej w pozycji C4 cytozyny
etylenodiamina NH2
HN
NH2
NH2
NH4+
Inne aminy u\
ywane w tej reakcji -
diaminohexan, diamnopropan
NH2
Reakcje przeprowadza siÄ™ w
HN
HSO3-
temperaturze > 40°C, przy pH ~6 i
kontrolujÄ…c stÄ™\
enie amin (przy
niskim reakcja transaminacji jest
wypierana przez deaminacjÄ™ do
uracylu; przy zbyt wysokim 100%
transaminacja). Optymalne -
modyfikacja to 40 zasad/1000,
aminoetylocytozyna
poniewa\
H z NH2 cytozyny
uczestniczy w tworzeniu wiązań
wodorowych
I.B. Aktywacja bromem reszt tyminy, guaniny i cytozyny
Aktywacja nukleotydów DNA i RNA przy udziale bromu zachodzi w pozycji C8
guaniny (adenia jest odporna na tÄ™ reakcjÄ™) oraz C5 cytozyny i w mniejszym stopniu
pozostałych pirymidyn
Poprzez Br mo\
na potem przyłączyć linkier np. diaminy
W reakcji u\
ywa siÄ™ N-bromosukcynoimidu czyli N  bromoimidu kwasu bursztynowego
jako bezpiecznego z
ródła bromu (brom jest toksyczny)
C8
Br
+
8-Bromoguanina
etylenodiamina
NH2
Reakcji ulega głównie DNA
NH2
poniewa\
silnie alkaliczne
środowisko i wysoka
Br -
temperatura (>50°C ) prowadzi
do degradacji RNA
Optymalne warunki reakcji
NH
powinny prowadzić do
NH2
modyfikacji 30-35 zasad/1000
(wydajność reakcji kontroluje się
stÄ™\
eniem bromosukcynoimidu)
8-aminoetylo guanina
I.C. Modyfikacja grupy 5 fosforanowej DNA
Tworzenie amidofosforyn (ang . phosphoramidate)
W reakcji stosuje siÄ™
karbodiimidy (sieciowanie bezpośrednie) grupa fosforanowa ulega aktywacji
do pochodnej fosfodiestrowej
Karbodiimidy reagujÄ… wydajnie z karboksylanami i fosforanami tworzÄ…c aktywny
kompleks zdolny do reakcji z grupami aminowymi
Diaminy lub bezpośrednio znaczniki z alifatyczną grupą aminową powstaje
stabilne wiÄ…zanie amidofosforanowe
W przypadku oligonukleotydów I etapem jest fosforylacja końca 5 przy
u\
yciu kinazy polinukleotydowej T4 (często wprowadza się wtedy tak\
e
znacznik izotopowy)
O
_
O_P_OH

OH
O-
EDC (EDAC lub EDCI, 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)
Karbodiimid
+
etylenodiamina
NH2
NH2
O
_
O_P_OH

OH
NH2
NH
Wiązanie amidofosforanowe uzyskanie grupy aminowej na końcu 5
Acylacja
alklacja
Estry sukcynoimidylu
izotiocyjaniany
Chlorki kwasowe
Estry p-nitrofenolowe
Pochodne aldehydowe
Modyfikowane nukleotydy z grupÄ… aminowÄ…
Zaleta: są wydajniej inkorporowane do kwasów nukleinowych w reakcjach
enzymatycznych ni\
nukleotydy ze znacznikami  nie ma problemu z wydajnością
reakcji
5- (3-amionoallylo)  nukleotydy (aa  NTP lub aa-dNTP)  najczęściej grupa aminoallylowa
przyłączona jest do C5 uracylu lub cytozyny
5-Aminohexylacrylamido-nukleotydy (aha-dNTP lub aha-NTP) grupa aha przyłączona jest do C5 uracylu lub
cytozyny
Aminoallylo uracyl
Grupa aminowa o charakterze
alifatycznym jest silnie reaktywna  jest
doskonałym ligandem dla większości
dostępnych handlowo pochodnych
(izotiocyjaniany, aktywne estry
karboksylowe) potencjalnych grup
reporterowych (fluoresceina, rodamina,
biotyna) czyli umo\
liwia przyłączenie do
nukleotydu znacznika zawierajÄ…cego
grupÄ™ aminoreaktywnÄ…
F-6130 ester sukcynoimidylowy fluoresceino-5EX
Pochodne estrów sukcynoimidylu i
Komercyjnie dostępne aha-UTP (dUTP) CTP
+
fluoresceiny lub haptenów
(dCTP)
aa  UTP      
Fluoresceino-aha-dUTP
ARES DNA Labeling Kits, Invitrogen
Reakcja znakowanie DNA przebiega 2-etapowo
1. enzymatyczne wstawienie aminoallylo-dUTP do
DNA (odwrotna transkrypcja lub nic translation)
2. Chemiczne znakowanie  do
zmodyfikowanego DNA przyłączany jest
znacznik zawierajÄ…cy amino reaktywne
grupy
Wydajność  1 znacznik na 12-20 zasad (wystarczająca wydajność
do FISH lub dot blotów) zmienna zale\
nie od rodzaju znacznika
II. Wprowadzanie grupy sulfhydrylowej do czÄ…steczki
kwasu nukleinowego
Wprowadzenie do czÄ…steczki kwasu nukleinowego grupy SH umo\
liwia
Å‚Ä…czenie z innymi czÄ…steczkami poprzez heterobifunkcjonalne czynniki
sieciujące (grupa amino-reaktywna łącznika przyłączana jest np. do
znacznika a wolna grupa specyficzna wobec grupy sulfhydrylowej umo\
liwia
przyłączenie znacznika do DNA lub RNA)
Dodatkowo, przeprowadzanie sieciowania etapami zapobiega
niespecyficznym oddziaływaniom
II.A. Przyłączanie cystaminy do grupy fosforanowej na końcu 5
5 P DNA i RNA ulega modyfikacji w reakcji z udziałem karbodiimidu (np. EDC) oraz
imidazolu powstaje pośredni produkt reakcji pochodna fosforyloimidazolowa. Tak
aktywowany oligonukleotyd wchodzi w reakcjÄ™ z cystaminÄ… (cystamina wypiera
imidazol ) powstaje stabilniejsze wiÄ…zanie amidofosforanowe. Dodanie czynnika
redukującego (np. DTT) uwalnia 2-merkaptoetyloaminę a na końcu 5 pojawia się
wolna grupa SH
O
EDC,
imidazol
intermediat
intermediat
_
O_P_OH

OH
O-
S NH2
S
NH2
cystamina
O
_
O_P_OH

OH
O
DTT
_
O_P_OH

OH
SH
NH
N
H
S
S
N
H
2
II.B. Modyfikacje grupy aminowej przyłączonej do 5 P DNA lub RNA
DNA z grupą aminową dołączoną po modyfikacji mo\
e być dalej przekształcone w
pochodnÄ… sulfhydrylowÄ… po reakcji z heterobifunkcjonalnym Å‚Ä…cznikiem
Po takiej modyfikacji nowo przyłączona grupa sulfhydrylowa jest bardziej wysunięta
O
_
O_P_OH

OH
NH2
NH
(N -Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate
O
_
O_P_OH

OH
NH
NH
SH
O
Pochodne maleimidowe
Pochodne halogenowe
disulfidy
Przyłączanie enzymów do DNA
Zaleta: dodanie substratów umo\
liwia szybkÄ… detekcjÄ™ sondy
Metody sprzęgania DNA z enzymem są identyczne jak sprzęganie enzymów z przeciwciałami.
DNA musi wcześniej ulec modyfikacji polegającej na przyłączeniu odpowiedniej grupy reaktywnej:
aminowej lub sulfhydrylowej
Znakowanie oligonukleotydów (<50 nt) enzymami (44  130 kDa) nie wpływa na
warunki hybrydyzacji;
Przyłączane enzymy to HRP lub AP
Oligozymy  koniugaty oligonukleotydów z enzymami
Znakowanie oligonukleotydów (<50 nt) enzymami (44  130 kDa) nie wpływa na
warunki hybrydyzacji;
Syntetyzuje siÄ™ oligonukleotydy z modyfikowanymi nt
Przyłączane enzymy to HRP lub AP
Oligonukleotydy (<50 nt) z grupÄ…
Enzym zwiÄ…zany z czynnikiem
sulfhydrylową na końcu 5
sieciujÄ…cym
60
SNAP  synthetic nucleic acid probe; Syngen
AP
+
Funkcjonalizowana tymina
TFA  trifluoroacetyl; DMT  dimetoxytrityl;
EtCN  grupa cjanoetylowa
Tr wa
Å‚adow
anie...
Tr wa
Å‚adow
anie...
Tr wa
Å‚adow
anie...
Tr wa
Å‚adow
anie...
Stron y 995-996
nie nale\
Ä… do
podglÄ…du tej
ksi Ä…\
ki.
Bioconjug ate
Techniques, 2e
pro vides highly
detailed
infor mation on
the chemi str y,
Tr wa reagent syste ms,
Å‚ado wand practi cal...
anie... wiÄ™ cej
Tr wa
Å‚ado w (1) -
anie... Recenzje: 2
Napisz ocenÄ™
Dodaj do mojej
biblioteki
Spis treści
Zamó w w
księgarni
Acad
emic
Press
-
W yda
wc a
Empi
k.c o
m
Merli
n.pl
Znajd
z
tÄ™
ksi Ä…\

kÄ™ w
bibliot
ece
Lin ki
spons
orow
ane
Prote
in
Conj
ugati
on
Your
Partn
er in
Pepti
de
and
Protei
n Opti
Homobifunkcjonalny
mi zat
ion
and
HES
Conju
gation
.
www.
aplag
en.co
m
Easy
fluor
escei
n
czynnik sieciujÄ…cy 1,4  labeli
ng
Just
add
antibo
dy.
No
colu
mn s,
no
dial ys
is, 30
secon
ds
hands
fenyleno diizotiocyjanian on.
www.
innov
abios
cienc
es.co
m
Opu
bliko
wan
a
prze
z
Aca
de m
ic
Pres
s
Stro
ny
wyÅ›
wietl
ane
za
zez
wol e
nie
m
Pra
wa
auto
rski
e
Pod
sta w
owy
tryb
HT
ML
Ozn
acz
tÄ™
stro
nÄ™
jako
niec
zyt el
nÄ…
Enzym sprzÄ™\
ony z
heterobifunkcjonalnym
czynnikiem sieciujÄ…cym przez
grupÄ™ aminowÄ… lizyny, reszta
disiarczanu pirydylu po
aktywacji umo\
liwia wiÄ…zanie
do modyfikowanego DNA z
wytworzeniem mostka
disiarczkowy
Bezpośrednie sprzęganie HRP z sondą DNA/RNA
ss DNA/RNA znakowany bezpośrednio modyfikowaną formą peroksydazy
chrzanowej z przyłączonymi grupami polietylenoiminy (PEI)
Modyfikacja PEG  PEGylacja-
+
+
- -
+
-
+
-
20-30  przyłączanie 1 cząsteczki enzymu/25
~300 nt
zasad
Bez konieczności oczyszczania sondy
Hybrydyzacja- skład buforu, temp. nie mogą
wpływać na stabilność i aktywność enzymu (np.
zamiast formamidu stosuje siÄ™ 6M mocznik)
Chemiczne znakowanie końca 3 RNA
Grupy aldehydowe i ketonowe  unikalne miejsca modyfikacji (poza
polisacharydami nieobecne w makroczÄ…steczkach)
Główna metoda wprowadzania tych grup to oksydacja nadjodanem sodu. W
przypadku kwasów nukleinowych reakcje tę przeprowadza się dla 3 OH
RNA powstaje dialdehyd.
Do grup aldehydowych/ketonowych przyłączane są pochodne
hydrazyny
Np. hydrazydowe pochodne znaczników
(biotyny, fluoresceiny itp.)
biotyna
fluoresceina
Znakowanie miejsc apurynowych/apirymidynowych przy u\
yciu biotynylowanej
hydroksylaminy ARP
powstała grupa OH jest
przekształcana do aldehydu
reaktywne formy
tlenu lub
promieniowanie
+
grupa aldehydowa jest wykrywana przy
jednym ze skutków działania
u\
yciu ARP (aldehyde-reactive probe)
wolnych rodników na DNA jest
połączonego z biotyną
depurynacja/depirymidynacja
czyli hydroliza zasady azotowej
Detekcja  koniugat streptawidyna  fluorofor lub enzym
Znakowanie nieenzymatyczne  wykorzystujÄ…ce
właściwości pochodnych platyny
Pochodne cis (i w mniejszym stopniu trans) platyny wykazują silne właściwości
mutagenne (wykorzystywane w terapii nowotworowej)
tDDP
cDDP
W środowisku wodnym dochodzi do zamiany ligandów  Pt formuje kompleksy z
grupami funkcyjnymi o ujemnym ładunku, czyli z grupami nukleofilowymi. Najłatwiej
reakcji podstawienia elektrofilowego ulegajÄ… N7 guaniny i w mniejszym stopniu N1 i N3
adeniny.
N-7
N-1
N-3
ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits, Invitrogen
Znacznik fluorescencyjny ( z grupy Alexa lub
Oregon Green) połączony z pochodną platyny
Reakcja z N7 guaniny lub w mniejszym
stopniu adeniny
Sondy sÄ… stabilne, wydajnie wiÄ…\
Ä… siÄ™ do
DNA, stosowane w dot blotach,
Southernie, Northernie, FISH
Otrzymywanie sondy ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kit
Reakcja jest szybka (15 min), przeprowadzana w pojedynczej probówce. W
przypadku DNA dłu\
szego ni\
1000 pz nale\
y wcześniej przeprowadzi trawienie
DNazÄ…
Sonda znakowana ULYSIS Alexa Fluor® 546 specyficzna dla
chromosomu2 - hybrydyzacja do ludzkich chromosomów
metafazalnych
Sondy centromerowe chromosomów 1, 15 i 17 znakowane
ULYSIS Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594 and Oregon Green 488
Nucleic Acid - hybrydyzowane do ludzkich chromosomów
metafazalnych
Znaczniki fotoreaktywne
bifunkcjonalne czynniki sieciujÄ…ce:
wykorzystywane do wyznaczania odległości pomiędzy oddziałującymi
biomolekułami
przydatne do analizy oddziaływań w \
ywych komórkach (przyłącza się je za
pomocą pierwszej chemicznie aktywowanej grupy do makrocząsteczki pełniącej
rolę liganda a następnie działając światłem o odpowiedniej długości fali przyłącza
siÄ™ je do drugiej makroczÄ…steczki)
W odró\
nieniu od chemicznego sprzęgania istnieje mniejsze prawdopodobieństwo
niespecyficznych oddziaływań
b2
Slajd 40
b2 N-=N+=N-
jest to zatem układ trzech atomów azotu połączonych wiązaniami podwójnymi, przy czym dwa skrajne atomy posiadają ładunek ujemny a
środkowy dodatni, na skutek czego całość jest anionem posiadającym elementarny ładunek ujemny
biochemia; 2009-03-20
Do związków fotoreaktywnych
nale\
Ä… azydki arylowe (aktywowane
<360nm)
-N=N=N-
fluorkowe pochodne azydków
arylowych
pochodne benzofenonu
Nitreny silnie reaktywne dzięki niesparowanym elektronom
Przyłączanie oligonukleotydu z grupą
aminową za pośrednictwem
heterobifunkcjonalnego zwiÄ…zku sieciujÄ…cego
ATFB (4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid,
succinimidyl ester)
Inne zwiÄ…zki fotoreaktywne
fluorescencyjny barwnik kwasów
nukleinowych o właściwościach
fotoreaktywnych.
Monoazydek etydyny
Po fotolizie wiÄ…\
e siÄ™ kowalencyjnie
do DNA/RNA
Znakowanie kwasów nukleinowych
mo\
na przeprowadzać w roztworze w
komórkach (\
ywe komórki są
nieprzepuszczalne)
Bromek etydyny
Znakowanie kwasów nukleinowych
1. Znakowanie enzymatyczne
synteza DNA/RNA z wykorzystaniem modyfikowanych nukleotydów
Enzym+ NTP/dNTP
<&
+ UTP
<& <&
<&
2. Enzymatyczne włączanie do nici DNA nukleotydów z grupą funkcyjną +
chemiczne przyłączanie znacznika
NH2
Enzym+ NTP/dNTP
Aminoreaktywne
|
+ aa - UTP NH2 <&
pochodne znacznika
|
<& |
|
3. Chemiczne wprowadzanie grupy funkcyjnej do DNA/RNA + sprzęganie z
znacznikiem
Chemiczna modyfikacja
NH2
zasad azotowych
Aminoreaktywne
<&
|
NH2
pochodne znacznika
<& |
|
|
Typy znaczników
Znaczniki nieradioaktywne
Detekcja bezpośrednia
Detekcja pośrednia
Witaminy
Fluorofory
biotyna
Enzymy (alkaliczna
fofataza; peroksydaza
Hapteny
chrzanowa rzadziej ²-
Digoksygenina
Galaktozydaza)
fluorofory
5-Bromouracyl
AAF (N-acetylo-2-aminofluoren)
ZÅ‚oto koloidalne
5  Bromodeoksyurydyna
syntetyczny analog tyminy, wydajnie zastępuje
tyminę w łańcuchu DNA
Od lat 70-tych stosowana do pomiaru wydajności
syntezy DNA w komórkach, tkankach i
izolowanych chromosomach
Sondy znakowane 5  BrdU otrzymuje siÄ™ metodami
in vitro i in vivo
Nic translation
Plazmidy lub M13
Oligonukleotydy syntetyzuje siÄ™
na zamówienie
+
Hybrydyzacja
Sondy są stabilne a podstawienie Br w miejsce  CH3 tyminy nie wpływa na Tm
hybrydu (nie trzeba dopasowywać warunków hybrydyzacji)
Detekcja
 przeciwciała poli  lub monoklonalne anty-BrdU
Są słabo reaktywne względem ds DNA dlatego DNA nale\
y zdenaturować: poddać
działaniu nukleaz lub stosować jednoniciowy DNA (M13, sondy oligonukleotydowe)
Digoksygenina
Digitalis purpurea
Steryd roślinny
Digitalis lanata
Znakowanie enzymatyczne
RNA
DNA
Oligonukleotydy
Nieenzymatyczne znakowanie
(pochodne cis-platyny)
Znakowanie:
Od 10 ng (znakowanie koÅ„ców) do 3 µg (nick translation) DNA
Wydajność : co 20-25 nukleotyd w nowo syntetyzowanym DNA zawiera hapten
Do znakowania u\
ywa siÄ™ DIG-[11] dUTP (ddUTP przy znakowaniu 3 )
Hybrydyzacja:
Standardowe warunki i bufory
Detekcja
Biotyna (witamina H, B7)
r3
Awidyna  tetramer, glikoproteina jaj ptasich o masie ok. 70 kDa; pI = 10. Wykazuje du\
e
powinowactwo do biotyny (Kd = 10-15 1/mol/l) i jest to jedno z najmocniejszych zaobserwowanych w
przyrodzie interakcji niekowalencyjnych (około miliona razy silniejsze ni\
oddziaływanie przeciwciało
antygen). Jedna czÄ…steczka awidyny wiÄ…\
e cztery czÄ…steczki biotyny. Kompleks awidyny z biotynÄ…
wystÄ™puje w szerokim zakresie pH (2÷10,5), natomiast w bardzo kwaÅ›nym i w silnie alkalicznym
środowisku następuje denaturacja awidyny, prowadząca do jej dysocjacji na podjednostki
Streptawidyna ze szczepu Streptomyces avidinii
Slajd 55
r3 Stanowi ona koenzym kilku ró\
nych enzymów. Jest niezbędnym składnikiem enzymów - karboksylaz biotynozale\
nych. Uczestniczy w
przenoszeniu grupy karboksylanowej (-COO-) z anionu wodorowęglanu na ró\
ne zwiÄ…zki organiczne, zale\
nie od rodzaju danej karboksylazy.
Zaliczana jest do witamin rozpuszczalnych w wodzie. Składa się z pierścieni: tiofenowego i imidazolowego.
ryszard; 2009-03-29
Biotynylowane nuklotydy
Biotynylowane n- dNTP i NTP
przewa\
nie pochodne
deoksyurydyny. Reszta biotyny
jest przyłączana do C5 zasady
azotowej poprzez Å‚Ä…cznik o
zmiennej długości (n). Długość
łącznika wpływa na detekcję Biotin-11-dUTP,
(im dłu\
szy tym czulsza) ale
te\
na wydajność włączania
modyfikowanego nukleotydu
do łańcucha kwasu
nukleinowego (im krótszy tym
Å‚atwiej).
Biotin-16-dUTP,
Inne biotynylowne nukleotydy
to pochodne ATP (N6) i CTP
(N4) obydwa at. N
uczestniczÄ… w tworzeniu
wiązań wodorowych)
Biotin-20-dUTP,
Znakowanie enzymatyczne:
DNA RNA Oligonukleotydy
Nick translation/
znakowanie 3 TdT
Transkrypcja in vitro
random priming/
PCR
Wydajność od 20 do 100 modyfikowanych zasad / 1000
Granica czułości to 7-35 biotyn/1000 zasad (zwiększona zawartość biotyny nie podwy\
sza czułości prawdopodobnie z
powodu zawady przestrzennej nie mieści się więcej cząsteczek streptawidyny
Dodatkowo sondy DNA zawierajÄ…ce do 20 biotyn/1000 zasad majÄ… identycznÄ… Tm jak niemodyfikowane;
Znakowanie nieenzymatyczne
Fotobiotyna grupa azydkowa przy reszcie arylowej pod wpływem światła 260-475nm
tworzy silnie reaktywną grupę nitrenową, która reaguje niespecyficznie z DNA/RNA