Biochemia: Ćw. 11  Kwasy nukleinowe
Ćwiczenie 11 KWASY NUKLEINOWE
WyciÄ…g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
amoniak  C, N
azotan srebra  C, N
błękit metylenowy  Xn
chlorek żelaza  Xn
difenyloamina  T
etanol, 96%, 70%  F
kwas azotowy(V),65%  C
kwas octowy, 96%  R10
kwas siarkowy, 95%  C
kwas solny  C
wodorotlenek sodu  C
siarczan dodecylu sodu  F
siarczan miedzi  Xn
Tris  Xi
1. BADANIE WA
AŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH
1.1. ROZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH
Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają się dobrze w środowisku
zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonym kwasie octowym. W roztworach wodnych tworzą układy koloidalne, z których można je
wytrącić za pomocą czynników odwadniających. Znaczne obniżenie pH roztworu przez dodanie mocnych kwasów lub czynników
odwadniajÄ…cych doprowadza do ich wytrÄ…cenia z roztworu. Dwie nici DNA ulegajÄ… rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i pH<2,
ze względu na jonizację zasad. Jonizacja powoduje zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, co prowadzi do
zaburzenia wiązań wodorowych pomiędzy A i T oraz C i G. Ponadto przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca
cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do
depurynacji i depirymidyzacji  utraty zasad przez trawienie wiÄ…zania glikozydowego. WiÄ…zanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych
zasad staje się bardziej podatne na hydrolizę, co prowadzi do degradacji DNA. Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo
stabilne w odczynie zasadowym, wykonuje się najczęściej denaturację pod wpływem kwasów.
Wykonanie: Przygotować dwie szklane, krótkie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.5% roztworu RNA a następnie 2  3
krople 2 M HCl. Wytraca siÄ™ biaÅ‚y osad RNA. Po dodaniu 200  300 µl 10% roztworu NaOH osad ulega rozpuszczeniu. Do
drugiej probówki dodać 1 ml 5% RNA, 200 µl CH COONa oraz 1 ml 96% etanolu  roztwór mÄ™tnieje, ponieważ wytrÄ…ca siÄ™
3
osad RNA.
1.2. TWORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BARWNIKAMI
W środowisku kwaśnym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe, tworząc połączenia typu soli, co wykorzystuje się m.in. do
histochemicznego barwienia jąder komórkowych.
Wykonanie: Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA a nastÄ™pnie 300 µl 1 M CH COOH oraz 5  6 kropli 0.1%
3
bÅ‚Ä™kitu metylenowego (używajÄ…c pipety do 100 µl). Zawartość szklanej probówki przenieść do probówki typu Eppendorf i
zwirować. Po wirowaniu widoczny jest niebieski osad kompleksów RNA z błękitem metylenowym.
1.3. TWORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAA
KAMI
Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi kompleksowe połączenia, zwane sztucznymi
nukleoproteidami. Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje się nasycone roztwory NaCl.
Wykonanie: Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA oraz 300 µl 1 M CH COOH a nastÄ™pnie 100 µl 3%
3
roztworu BSA. Wytrąca się osad kompleksowego połączenia białka z RNA. W celu rozpuszczenia osadu dodać 1 ml
nasyconego roztworu NaCl.
1
Biochemia: Ćw. 11  Kwasy nukleinowe
2. PREPARATYKA ORAZ ANALIZA SKA
ADU RNA
2.1. IZOLACJA RNA Z DROŻDŻY
Opisana poniżej metoda izolowania RNA polega na rozbiciu komórek drożdży, usunięciu z roztworu białek i DNA za pomocą anionowego
detergentu - siarczanu dodecylu sodu (SDS) a następnie wytrąceniu RNA za pomocą etanolu.
Wykonanie: W zlewce o poj. 200 ml ogrzać do wrzenia 30 ml 5% roztworu SDS stale mieszając. Do wrzącego roztworu SDS
dodać 10 g rozdrobnionych drożdży piekarskich i kontynuować ogrzewanie przez 5 min. Zlewkę ochłodzić pod bieżącą wodą
a nastÄ™pnie zawartość zlewki przenieść do probówki wirowniczej o poj. 50 ml i zwirować (3000 RCF*, 10 min, 4°C). NadsÄ…cz
zebrać i dodać do 60 ml schłodzonego 96% etanolu. Po 10 min precypitacji w lodzie roztwór przenieść ponownie do
probówki wirowniczej i zwirować (3000 RCF, 10 min, 4°C). Osad wytraconego RNA rozpuÅ›cić w 50 ml wody destylowanej.
2.2. HYDROLIZA KWASOWA RNA
Kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w łańcuch polinukleotydowy. Nukleotyd składa
siÄ™ z czÄ…steczki cukru (rybozy w RNA, deoksyrybozy w DNA), zasady azotowej (purynowej: adeniny, guaniny lub pirymidynowej: cytozyny,
tyminy, uracylu) oraz reszty fosforanowej. Nukleotydy to fosforany nukleozydów. Większość reakcji charakterystycznych dla
poszczególnych składników kwasów nukleinowych zachodzi dopiero po hydrolizie makrocząsteczki. Kwasy nukleinowe ogrzewane z
kwasami nieorganicznymi (np. 1 M HCl, 10% H SO ) ulegają stopniowej hydrolizie do monofosforanów nukleozydów. Przy wystarczająco
2 4
długo prowadzonym ogrzewaniu w hydrolizacie uzyskujemy wolne zasady azotowe, pentozy i kwas fosforowy.
Wykonanie: Przygotować kolbę stożkową o poj. 200 ml. Do roztworu RNA wyizolowanego z drożdży dodać 10% H SO w
2 4
stosunku 1:2 i ogrzewać we wrzącej łaz
ni wodnej przez 30 min. Po ostudzeniu hydrolizat RNA przefiltrować a następnie
przeprowadzić na nim reakcje pozwalające na identyfikację poszczególnych składników (pkt. 2.3).
2.3. IDENTYFIKACJA SKA
ADNIKÓW RNA
2.3.1. WYKRYWANIE PENTOZY  REAKCJA TOLLENSA
W obecności stężonych kwasów mineralnych z pentozy powstaje z furfural (patrz: Ćw.9 Analiza monosacharydów), który kondensując z
floroglucyną (fenol) tworzy związek barwy czerwonej. Reakcja Tollensa, podobnie jak próba Taubera, służy do odróżniania pentoz od
heksoz.
Wykonanie: Przygotować długą szklaną probówkę. Do 1 ml hydrolizatu RNA dodać 1 ml stęż. HCl i kilka kryształków
floroglucyny. Roztwór ogrzać do wrzenia w łaz
ni wodnej. Powstaje czerwone zabarwienie świadczące o obecności pentoz w
hydrolizacie RNA.
2.3.2. WYKRYWANIE RESZTY FOSFORANOWEJ
Obecny w hydrolizacie RNA kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO , co prowadzi do powstania żółtego
3
osadu fosfomolibdenianu amonu.
Wykonanie: Przygotować dÅ‚ugÄ… szklanÄ… probówkÄ™. 0.5 ml hydrolizatu RNA zobojÄ™tnić amoniakiem (150  200 µl,
kontrolować papierkiem wskaz
nikowym). Dodać 0.5 ml stęż. HNO oraz 2 ml 2.5% molibdenianu amonowego. Zawartość
3
probówki ogrzać do wrzenia w łaz
ni wodnej. Powstający fosfomolibdenian amonowy wytrąca się przy większym stężeniu w
postaci żółtego osadu.
*RCF (ang. Relative Centrifugal Force)  względna siła odśrodkowa wyrażająca wartość przyśpieszenia stosowaną do
wirowania próbek
2
Biochemia: Ćw. 11  Kwasy nukleinowe
2.3.3. WYKRYWANIE ZASAD AZOTOWYCH
Zasady azotowe  heterocykliczne związki pierścieniowe  reagują z jonami Ag+ lub Cu+ tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA oraz stężonego
amoniaku do uzyskania słabo alkalicznego odczynu (kontrolować papierkiem wskaz
nikowym). Jeżeli roztwór nie jest
klarowny, należy go przesączyć. Następnie do klarownego przesączu dodać 0.5 ml 1% AgNO . Wytrąca się osad
3
nierozpuszczalnych soli srebrowych puryn.
Do drugiej probówki dodać 1 ml hydrolizatu RNA a następnie 1 M NaOH od słabo kwaśnego odczynu (kontrolować
papierkiem wskaz
nikowym). Po zagotowaniu roztworu dodać 0.5 ml 2% CuSO a następnie wprowadzić kroplami nasycony
4
NaHSO aż do wytrącenia osadu nierozpuszczalnych soli miedziawych. Kwaśny siarczyn sodowy redukuje jony Cu2+ do Cu+,
3
które z purynami tworzą nierozpuszczalne sole miedziawe.
3. ODRÓŻNIANIE RNA OD DNA
Reakcje pozwalające zidentyfikować i odróżnić roztwór RNA od DNA bazują na obecności różnych cukrów w cząsteczkach tych kwasów
nukleinowych: DNA zawiera deoksyrybozę, RNA  rybozę. Ryboza w odróżnieniu od deoksyrybozy zawiera grupę hydroksylową przy
węglu C2.
3.1. METODA ORCYNOWA  PRÓBA BIALA
Próba Biala jest kolejną reakcją stosowaną do odróżniania pentoz od heksoz. Pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach) ogrzewane
ze stęż. HCl ulegają cyklizacji do furfuralu (patrz: Ćw. 9 Analiza monosacharydów), który w obecności jonów Fe3+ kondensuje z orcyną,
tworząc związek barwy zielonej. Kwas DNA zawierający deoksyrybozę w próbie Biala daje wynik ujemny.
Wykonanie: Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej 1 ml 0.1% DNA, a
następnie do każdej po 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika orcynowego*. Probówki umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej
na 15 min. Roztwór RNA barwi się na oliwkowozielono.
3.2. METODA Z DIFENYLOAMIN
 PRÓBA DISCHEGO
Deoksyryboza (wolna i zwiÄ…zana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloaminÄ… zwiÄ…zek barwny. RNA, zawierajÄ…cy rybozÄ™ oraz
deoksyryboza zwiÄ…zana w nukleotydach pirymidynowych dajÄ… wynik ujemny w tej reakcji.
Wykonanie: Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej  1 ml 0.1 % DNA, a
następnie do każdej po 1 ml 1% odczynnika difenyloaminowego** i umieścić probówki we wrzącej łaz
ni wodnej na 10 minut.
W probówce zawierającej roztwór DNA powstaje niebieskie zabarwienie.
* odczynnik orcynowy: nietrwały, bezpośrednio przed użyciem zmieszać: 1 ml roztworu A (6% orcyna w 96% etanolu) oraz 15 ml
roztworu B (10% FeCl w stęż. HCl). Objętość wystarczająca na 3 podgrupy do doświadczenia 3.1 oraz 4 (ślepa oraz próbki badane).
3
** odczynnik difenyloaminowy: 1 g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH COOH zawierającego 2.75 ml stęż. H SO .
3 2 4
3
Biochemia: Ćw. 11  Kwasy nukleinowe
4. ANALIZA ILOÅšCIOWA RNA METOD
KOLORYMETRYCZN
Z ORCYN

Stężenie RNA można oznaczyć mierząc ilość rybozy uwolnionej podczas ogrzewania RNA ze stęż. HCl. Zawartość powstałego w
obecności jonów Fe3+kompleksu furfural-orcyna barwiącego roztwór na kolor oliwkowozielonej mierzy się przy dł. fali 660 nm.
Wykonanie: przygotować pięć krótkich szklanych probówek. Do pierwszej z nich dodać 0.6 ml wody (próba Å›lepa, Ø), w
pozostałych przygotować po dwa rozcieńczenia próbek badanych P1 (P1.1, P1.2) i P2 (P2.1, P2.2) wg Tabeli 2. Do każdej
probówki dodać po 0.6 ml odczynnika orcynowego przygotowanego bezpośrednio przed użyciem (str.3), zamieszać. W celu
uzyskania hydrolizatu RNA probówki inkubować 20 min we wrzącej łaz
ni wodnej (Å‚az
ni nie przykrywać!). Probówki oziębić w
zlewce z zimnÄ… wodÄ…. OznaczonÄ… pipetÄ… automatycznÄ… przenieść po 200 µl roztworu z każdej szklanej probówki do doÅ‚ków
w płytce titracyjnej. W czytniku do płytek titracyjnych zmierzyć absorbancję próbek P1 i P2 wobec ślepej odczynnikowej przy
dł. fali 660 nm (płytkę przed wyciągnięciem spod dygestorium przykryć pokrywką, pomiaru dokonywać nie odkrywając płytki).
Po wykonaniu pomiaru absorbancji, wartości OD dla próbek badanych pomniejszyć o wartość OD dla ślepej korzystając z
opcji: "OD  blank" w programie KC4.
Do sporządzenia próbek wzorcowych użyto 1% roztworu RNA, który rozcieńczono zgodnie z Tabelą 1. W tabeli podano
również trzy różne zestawy wartości absorbancji do wykreślenia krzywej kalibracyjnej przez każdą z podgrup.
Tab. 1.
obj. r-ru ilość RNA OD660
obj. wody stężenie RNA
symbol
wzor. RNA w obj. 0.6 ml
[ml] [mg/ml]
[ml] [mg]
I II III
0 0 0
Ø 0 0
0.205 0.197 0.211
W1 0.5 0.1
0.428 0.384 0.404
W2 0.4 0.2
0.673 0.706 0.723
W3 0.3 0.3
0.904 0.883 0.912
W4 0.2 0.4
1.125 1.009 1.112
W5 0.1 0.5
1.341 1.184 1.295
W6 0 0.6
Przed przygotowaniem obydwu powtórzeń dla próbki badanej P2 zgodnie z Tab.2, próbkę należy rozcieńczyć dwukrotnie.
Tab. 2.
ilość RNA w
rozcieńczenie średnie
obj. wody obj. próbki próbce badanej stężenie białka
symbol OD660 próbki przed
stężenie białka
[ml] [ml] odczytana z [mg/ml]
pomiarem [mg/ml]
krzywej [mg]
P1.1 0.5 0.1
P1.2 0.1 0.5
P2.1 0.5 0.1
P2.2 0.1 0.5
Na podstawie wartości absorbancji uzyskanej dla obydwu powtórzeń próbek badanych P1 i P2 z krzywej wzorcowej należy
odczytać ilość RNA oraz obliczyć stężenie RNA w P1 i P2.
4
próbki wzorcowe
próbki badane
Biochemia: Ćw. 11  Kwasy nukleinowe
5. PRECYPITACJA DNA
Precypitacja (strącanie) kwasów nukleinowych z użyciem środków odwadniających jest jednym ze sposobów zagęszczenia roztworów tych
związków. Najczęściej do precypitacji używa się alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Przy małych stężeniach wydajność precypitacji kwasu
nukleinowego zwiÄ™ksza użycie schÅ‚odzonego alkoholu; samÄ… precypitacjÄ™ też wykonuje siÄ™ w niskiej temperaturze (4°C lub -20°C).
Wykonanie: Przygotować sterylnÄ… probówkÄ™ typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100 µl 0.1% roztworu wyjÅ›ciowego DNA
dodać 10 µl 3M CH COONa, pH 5.2 (RT*) oraz 250 µl 96% etanolu (z -20°C). Wymieszać dokÅ‚adnie i inkubować przez 30
3
min w temp. -20°C. WytrÄ…cone DNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Zebrać dokÅ‚adnie nadsÄ…cz koÅ„cówkÄ… kapilarnÄ…
a peletÄ™ przemyć 250 µl 70% etanolu (RT). Ponownie zwirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Po dokÅ‚adnym zebraniu
nadsÄ…czu koÅ„cówkÄ… kapilarnÄ… peletÄ™ wysuszyć na powietrzu (ok.10 min) a nastÄ™pnie rozpuÅ›cić w 10 µl wody dejonizowanej.
6. OKREÅšLENIE ST
ŻENIA DNA METOD
SPEKTROFOTOMETRYCZN

W celu określenia odzysku DNA zmierzyć jego stężenie metodą spektrofotometryczną w świetle UV w roztworze wyjściowym oraz
roztworze 10-krotnie zagęszczonym po precypitacji.
Wykonanie: Przygotować trzy probówki typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do pierwszej (próby Å›lepej) dodać 100 µl wody wolnej
od RNaz a do drugiej i trzeciej po 99 µl wody wolnej od RNaz. Do drugiej dodatkowo 1 µl roztworu wyjÅ›ciowego DNA (przed
precypitacjÄ…), do trzeciej - 1 µl roztworu DNA po precypitacji. Zmierzyć absorbancjÄ™ wzglÄ™dem próby Å›lepej przy dÅ‚. fali 260
nm (spektrofotometr Bio-Rad). Spektrofotometr w oparciu o zadaną wartość współczynnika konwersji (ang. conversion
factor, zwykle 1:50 µg/ml) oraz rozcieÅ„czenie przelicza zmierzonÄ… wartość absorbancji na stężenie wyrażone w [µg/ml].
Policzyć ilość DNA [µg] w 100 µl roztworu wyjÅ›ciowego oraz 10 µl 10-krotnie zagÄ™szczonego roztworu po precypitacji.
Na zajęciach obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne. Każda podgrupa zobowiązana
jest do przyniesienia na zajęciach zestawu do wykreślenia krzywej kalibracyjnej: papieru milimetrowego, linijki, krzywki, ołówka,
kalkulatora.
*RT (ang. Room Temperature)  temperatura pokojowa
W sprawozdaniu należy zamieścić:
Wyznaczenie stężenia RNA metodą orcynową w próbkach badanych P1 i P2.
Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005, rozdział pt. "DNA, RNA i przepływ informacji
genetycznej" (lub odpowiedni rozdział we wcześniejszych wydaniach).
5