Mikrobiologia przemysłowa ćw 11
BIOTRANSFORMACJA
Z UDZIAA
EM BAKTERII KWASU OCTOWEGO
BAKTERIE KW. OCTOWEGO
Głównie z rodziny Acetobactericea (należące do gamma - Proteobacteria).
Od 1980 r początkowo używano dwóch rodzajów  Acetobacter i Gluconobacter.
Potem, z rodzaju Acetobacter wyodrębniono, dzięki technikom molekularnym, niepasujące
bakterie i stworzono Gluconoacetobacter. Wyjątkowe są Acidiophicium  zawieraja one
bakteriochlorofil  dzięki niemu mogą uzyskiwać ATP przy wykonaniu niepełnej fotosyntezy
= nie wiążą CO2, mogą utleniać związki siarki.
Czyli do bakterii octowych zaliczamy obecnie:
- Acetobacter
- Gluconobacter
- Gluconoacetobacter
- Acidiophicium
- Stella
Co celów produkcyjnych wykorzystywane są trzy pierwsze.
- Bakterie elipsoidalne, pałeczki
- występują pojedynczo
- są chemoorganoheterotrofam
- bezwzględne tlenowce
- charakteryzują się metabolizmem oddechowym (są niezdolne do fermentacji)
- są niezdolne do glikolizy, większość przetwarza cukry w szlaku
heksozomonofosforanowym
- są tolerancyjne względem kwaśnego pH (>6), w ogóle są kwasolubne (górna granica
optimum pH to pH6)
- zdolne do utleniania etanolu do kwasu octowego  mogą rosnąć heterotroficznie i
wykorzystywać wiele związków (nie tylko etanol ale i różne cukry, alkohole itp.)
- mogą występować tam, gdzie jest duzo cukrów (np. na owocach, kwiatach,
niskoprocentowych napojach alkoholowych  wino, piwo, także tzw. soft drinks 
soki owocowe)
- Acetobacter i Gluconoacetobacter mogą dalej utleniać kw. octowy (tzw. nadoksydacja
tlenowa) do dwutlenku węgla i wody.
- Gluconobacter  NIE potrafią (mają niekompletny cykl Krebsa)
- Zdolne lub niezdolne do ruchu
o Jeśli zdolne  głównie ruch rzęskowy
o Gluconoacetobacter  zgrupowane w pęczek na jednym biegunie
o Acetobacter  urzęsienie perytrychalne (wokół ciała równomiernie)
- Żaden z tych gatunków nie jest patogenny dla zwierząt, ale niektóre z rodzaju
Gluconobacter są patogenne dla roślin (mogą powodować straty ponad 75% w
hodowli jabłek i gruszek)
- np. Gluconoacetobacter  wykorzystywany w biotransformacji prowadzącej do
wytworzenia kwasu askorbinowego (witaminy C)
o synteza metodami chemicznymi glukozy  przekształcona w sorbitol ( I etap
biochemiczny)
o sorbitol  dzięku Gluconoacetobacter przekształcany w sorbozę ( II etap
mikrobiologiczny)
Mikrobiologia przemysłowa ćw 11
o sorboza  szereg metod biochemicznych  kwas askorbinowy ( III etap
biochemiczny)
- Gluconobacter xylinus : wykorzystywany do syntezy bardzo czystej celulozy.
Wytwarza i wydziela na zewnątrz komórki łańcuch glutanowe, tworząc struktury
fibrylarne, potem wstęgowane  aż przyjmują postać  kraty czy  maty w której są
zagłębione bakterie. Wzrost w postaci kożucha na hodowli płynnej (korzystne  dobry
dostęp do tlenu).
o Zastosowanie czystej celulozy  w gumie do żucia, w wytwarzaniu
opatrunków na rany, substytutów skóry, wyrobu papieru wysokiej jakości,
filtrów celulozowych, membran elastycznych
- inne bakterie octowe  np. z glukozy  kwas glukonowy
o przekształcenia
I rzędowych alkoholi  w kwasy
II rzędowych alkoholi  w ketony
Alkoholi poliwodorotlenkowych - cukry
Fermentacja  to fosforylacja substratowa, posiada endogenny akceptor elektronów, jest
procesem beztlenowym, brak łańcucha oddechowego TUTAJ TAK NIE JEST -
DLATEGO MÓWIMY O BIOTRANSFORMACJI KW OCTOWEGO
- jest to metoda tlenowa
- polega na utlenieniu etanolu do kwasu octowego
- niepełne utlenienie : działają dwa enzymy  dh. alkoholowa i dh. aldehydowa, mają
one szerokoą specyficzność działania, mogą utleniać alk / ald rozgałezione,
nierozgałęzione, krótkie, długie itp...
- jest obecny łańcuch oddechowy!
-
- Powstaje w nim siła protonowo  elektronowo przenosząca elektrony na łańcuch
oddechowy
- Dehydrogenazy  to enzymy błonowe, przenoszą na cytochrom C  ubichinon 
cytochrom O  tlen
- NAD  nie bierze tu udziału!!!!
Bakterie hodowane w płynie przechodzą przez 3 fazy
- I. EtOH jest w podłożu, pierwotna biomasa  bakterie utleniają EtOH do kwasu
octowego, liczba komórek rośnie a ilość etanolu spada, ilość kwasu rośnie
Mikrobiologia przemysłowa ćw 11
- II. Zużyty cały etanol, faza zahamowania wzrostu (Acetobacter i Glucoacetobacter 
przystosowują się do wykorzystania kw. octowego w cyklu Krebsa i przekształcenie
go w CO2 i H2O)
- III. Obumieranie (trzeba dostarczyć świeżego substratu)
DEFINICJA OCTU (ze skryptu!!!)
W procesie produkcji trzeba zawsze dbać, by EtOH znajdował się zawsze w podłożu.
Ocet to produkt przeznaczony do spożycia, otrzymywany przez  fermentację akloholową a
następnie octową z odpowiednich surowców pochodzenia roślinnego zawierających
węglowodany lub przez fermentację octową produktów zawierających etanol. Ocet zawiera w
określonym stężeniu : od 50 g/l do max, możliwego do osiągnięcia. Ocet może zawierać
dodatki smakowo  aromatyczne takie jak : soki, koncentraty soków, wyciągi z owoców,
warzyw, ziół, korzeni.
IZOLACJA BAKTERII ZE ŚRODOWISKA
- wyregulowane odpowiedni pH (<6), etanol jako jedyne z
ródło węgla (czynniki
selekcyjne!)
- podłoże stałe + kreda (nierozpuszczalne, mętne podłoże) : obserwacja wzrostu. Jeśli
wokół koloni nastąpi przejaśnienie  bakterie utleniają EtOH do kwasu octowego = w
tym miejscu kreda uległa rozpuszczeniu (czynnik różnicujący)
METODY HODOWLI
1. metoda powierzchowna = inaczej metoda orleańska
Do produkcji stosowana jest taca z dopływem i odpływem. Wypełniamy ją świeżym
octem (zawiera inokulum) i winem. Początkowy stan : 4% EtOH i 2 % kw. octowego
(utrzymuje pH, jest też czynnikiem selekcyjnym). Rosną śluzowata warstwą w formie
kożucha. Proces ten trwa kilka tygodni  po tym czasie zlewamy około 10 % zawartości
(to gotowy produkt - ocet) i dolewa się taka samą objętość świeżego wina.Proces
pracochłonny, długi, mało wydajny, powstaje słaby ocet (5 - % )ale... Powstający ocet jest
najwyższej jakości (np. ocet balsamiko di Modena), o doskonalym smaku i zapachu..
Substratem jest wino.
- Acetobacter orbanensis
- Gluconoacetobacter xylinus
2. metoda ociekowa(trickle method)
Tzw. metoda pośpieszna (nei czekamy na naturalny ciąg wydarzeń,ale go przyśpiszamy
różnymi sposobami)
Pierwszy raz zastosowana w
1823 r przez Schutzenbacha
(immobilizacha komórek
bakteryjnych na wiórkach
bukowych). Ogólnie proces
jest przeprowadzany w
zbiornikach (generatorach) z
podwójnym dnem (trickling
generation method ). Górne
dno jest perforowane , na
Mikrobiologia przemysłowa ćw 11
nim są luz
no ułożone wióry bukowe, na których bakterie rosna w postacji błon
biologicznych. Na wióry sączy się powoli zalew (składający się z 10-14% etanolu, kwas
octowy 1.4 % + związki odżywcze). Substratem jest etanol! Płyn jest wielokrotnie
recylkulowany , znajduje się w nim coraz mniej etanolu,a coraz więcej kwasu. Proces
trwa 8  10 dni, otrzymujemy 9-13 % kwas octowy, wydajnosć jest bliska 90%.  ale ocet
mniej smaczny.
3. metoda wgłębna
Także metoda pośpieszna. Metoda półciągła. Proces jest prowadzony w acetatorach
(wielkie reaktory wykonane ze stali kwasoodpornej, od wewnatrz chłodzone) Acetatory
wyposażone są w ukłąd pomiaru stężenia alkoholu, czujniki poziomu cieczy i mieszadła
(napowietrzanie  ciągle homogenizowana hodowla = > aby wszędzie był taki sam dostęp
do tlenu). Na starcie stosowany zalew zawierajacy bakterie octowe , EtOH ( 7  10 %) i
kwas octowy 5%. Proces toczy się tak długo, aż stężenie EtOH spadnie do 0.3 %. Wtedy
automatycznie następuje opróżnienie 1/3 objętości (z tego będziemy odzyskiwać ocet), na
jego miejsce doprowadzane do acetatora świeża runda zwierajaca 0-2 % kwasu octowego
oraz 12  15% etanolu. Cykl produkcyjny trwa 40  48h, stężenie etanolu nie może spaść
ponieżej 0.2 % (bakterie są kapryśne, przy niższym stężeniu spada ich żywotność).
Problemem jest to, iż z acetatora wypływa nam ocet z bakteriami. Musimy go oczyscić
(np. odsączyć, przefiltrować). Filtr zatrzyma mikroorganizmy, a ocet wyklarujemy
(stosuje się np. bentonit  adsorbcja białek powodujacych nieklarowność roztworu).
Otrzymywany ocet 12-15 %, czas 40-48 h, wydajność 90-98%.
PROBLEMY W PROWADZENIU HODOWLI
- nie można dopuścić do nadoksydacji
- problem ze śluzem G. Xylinus  jeśli urośnie za gruba warstwa może być utrudniony
dostęp do tlenu bakterii głębiej położonych, zatkanie rur i przewodów służących do
przepływu cieczy
- zakażenia
o trzeba pilnować, aby nie dochodziło do zakażeń dzikimi bakteriami octowymi
o np. drożdż Candida mycodermi przenoszona przez muszkę owocówkę
o owocówka może też przenosić węgorek octowy (anguillula aceti) żywiacy się
bakteriami octowymi
- trzeba myśleć o pasteryzacji produktu spływającego z tacek (bo może zawierac
bakterie octowe  które mogłyby prowadzic dalsze utlenianie)
o jako konserwat stosuje się SO2 (bakterie octowe sa wrazliwe na dwutlenek
siarki)
o wysokie butelkowanie (brak dostepu do tlenu : bakterie octowe to
bezwzględne tlenowce)
PROBLEMY Z BAKTERIAMI OCTOWYMI INNYCH GAA

ZIACH PRZEMYSA
U
UŻYWAJ
CYCH ETANOL JAKO SUBSTRAT
- nie chcemy, by wyhodować bakterie octowe(są składnikiem psujących się win, piwa,
gorzały)
- beztlenowe przetrzywanie poduktów
- użycie dwutlenku siarki
- pasteryzacja
- straty w jabłkach, gruszkach ,ananasach (pasożytują!)
Mikrobiologia przemysłowa ćw 11
INNE BAKTERIE ZDOLNE DO WYTWARZANIA OCTANU (NIE MYLIĆ!!!)
1. bakterie homoacetogenne np. Acetobacterium woodii
a. bezwzględny beztlenowiec
b. octan to produkt procesu beztlenowego
c. CO2 jako końcowy akceptor, powstaje octan!
d. U archeonów : jako produkt powstaje CH4!!!
2. fermentacja heterogenna np. kwasów mieszanych
DO LICZENIA DROBNOUSTROJÓW
Stosujemy hemocytometr np. komora Thoma lub komora Burkera.
Komora Thoma ma na swojej powierzchni kwadratową siatke o gr. 0,1 mm. : duży kwadrat to
układ 4x4 (16 małych kwadracików)/ Liczba zarodników w 80 małych kwadratach = średniej
zawartosci w komorze. 1 kwadrat ma wymiary : 0.1 mm (wysokość) X 0,2 mm(głebokość) x
0.2 mm (szerokość). Czyli objetość jednego kwadracika to 0,4 x 10^-6 mm3
Jeśli zarodnik znajduje się na lini prawej bocznej i dolnej, przypisujemy go do kwadracika po
lewej.
Liczba zarodników * ilość ml (zwykle 1) // objętość 1 kwadracika
Wzór. Zakładamy, że mamy 10 zarodników w 1 kwadraciku
10 *1 / 0.4 *10^-6 = 2.5 *10^6 zarodników w 1 ml.