1.2. Reakcja charakterystyczna dla cukrów obojętnych - metoda antronowa
Zasada: Pod wpływem stężonego H2SO4 cukry obojętne ulegaja odwodnieniu
do furfuralu lub jego pochodnych, a te z kolei tworzą z antronem połączenia
1. Analiza jakościowa cukrów prostych
kompleksowe o barwie zielonej. Aminocukry dają w tej reakcji odczyn ujemny.
Metoda ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania cukrów.
Do wykrywania i rozróżniania cukrowców wykorzystuje się reakcje oparte na
Wykonanie: Do suchej probówki odmierzyć 0.5 ml roztworu glukozy, a
następujących własnościach tych związków:
nastepnie dodać 0.5 ml 0,2% roztworu antronu w stężonym kwasie siarkowym
a) odwodnione pod wpływem działania mocnych kwasów nieorganicznych
i dokładnie wytrząsnąć. Pojawia się zielone zabarwienie.
cukry przekształcają się w pochodne furfuralowe (furfural, metylenofurfural,
hydroksymetylenofurfural ), które w wyniku kondensacji z fenolami,
1.3. Reakcja charakterystyczna dla ketocukrów - odczyn Seliwanowa
chinonami, aminami aromatycznymi tworzą produkty o charakterystycznym
zabarwieniu.
Zasada: Pierwszy etap polega na przeprowadzeniu ketocukru w pochodną
b) cukry posiadające wolną grupę karbonylową lub aldehydową wykazują silne
furfuralową. Powstały 5-hydroksymetylenofurfural ulega kondensacji z
właściwości redukujące, dając typowe reakcje utlenienia i redukcji
rezorcyną dajac produkt o barwie czerwonowiśniowej. Dodatni odczyn
Seliwanowa dają wszystkie ketopentozy, ketoheksozy i oligosacharydy
zawierające ketozy. Poprawny wynik reakcji zależy od zachowania ściśle
1.1. Reakcja charakterystyczna dla wszystkich cukrów - odczyn Molischa
określonych warunków: stężenia użytego kwasu oraz czasu ogrzewania. 12%
HCl i 30 sek ogrzewania wystarcza do przeprowadzenia ketoz w pochodną
Zasada: Pod wpływem stężonego H2SO4 pentozy i heksozy przechodzą
furfuralową, natomiast aldozy w tych warunkach pozostają nie zmienione.
odpowiednio w furfural lub 5-hydroksymetylenofurfural. Związki te tworzą z
Użycie kwasu o wyższym stężeniu lub wydłużenie czasu ogrzewania powoduje
α-naftolem połączenia triarylometanowe o czerwonofiołkowym zabarwieniu.
że również aldozy dają dodatni odczyn Seliwanowa.
Odczyn ten dają wszystkie cukry, zarówno rozpuszczalne jak i
nierozpuszczalne. W przypadku tych ostatnich zabarwienie występuje na
Wykonanie: Do 2 ml roztworu fruktozy dodać 1 ml stężonego HCl (końcowe
granicy zetknięcia fazy stałej z fazą ciekłą. Reakcja ta przebiega o wiele łatwiej
stęż. HCl=12%) ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 30 sek. Mieszaninę
z ketozami niż z aldozami.
schłodzić i podzielić na dwie równe części. Do jednej z nich dodać parę
kryształków rezorcyny i zawartość obu probówek ogrzewać do wrzenia.
Wykonanie: Do 0.5 ml roztworu cukru dodać dwie krople świeżo
Porównać zabarwienie obu płynów. W probówce do której została dodana
przygotowanego 10% alkoholowego roztworu α-naftolu i dokładnie
rezorcyna, występuje czerwonowiśniowe zabarwienie lub osad tej samej barwy
wymieszać. Zawartość probówki podwarstwić ostrożnie 0.5 ml stężonego
rozpuszczalny w alkoholu. Wykonać odczyn z roztworem fruktozy i glukozy i
H2SO4. Na granicy obu warstw wystepuje czerwonofiołkowe zabarwienie.
porównać wyniki.
Uwaga: Wystąpienie zielonego pierścienia jest niecharakterystyczne i pochodzi
Uwaga. W probówce bez rezorcyny również występuje słaboróżowe
od różnych zanieczyszczeń odczynników użytych do tej próby.
zabarwienie, ponieważ inne związki organiczne (niecukrowce) mogą sie barwić
3.1
pod wpływem ogrzewania z HCl. Dopiero porównanie barwy w obu
probówkach pozwala na stwierdzenie obecności cukru w badanej próbce.
1.4. Reakcja charakterystyczna dla pentoz - odczyn Biala
Zasada: Pierwszy etap polega na przeprowadzeniu pentozy w furfural, który w
obecności jonów Fe+3 tworzy z orcyną (2,3-dihydroksy-5-metylobenzen)
produkt o barwie zielonej. 5-hydroksymetylofurfural (produkt odwodnienia
heksoz) reaguje znacznie słabiej z orcyną dając produkt o zabarwieniu
żółtobrązowym.
Wykonanie: Odmierzyć do probówki 0.3 ml odczynnika orcynowego (roztwór
rys.1.
orcyny i FeCl3 w HCl) dodać 0.5 ml roztworu arabinozy i ogrzewać we wrzacej
łaźni wodnej przez 5 min. Pojawia się zielone zabarwienie.
1.5.1. Odczyn Fehlinga
1.5. Odczyny redukcyjne
Zasada: W przypadku odczynu Fehlinga redukcji ulega miedź z +2 do +1
Cukry w roztworach obojętnych lub słabo kwaśnych wystepują w formach
stopnia utlenienia. Używa się odczynnika Fehling I, który zawiera CuSO
pierścieniowych (wiązanie półacetalowe). W środowisku zasadowym lub silnie
4 oraz
odczynnika Fehling II, który zawiera NaOH i winian sodowo-potasowy.
kwaśnym formy pierścieniowe przechodzą w łańcuchowe i powstają wolne
Winian sodowo-potasowy zapobiega wytrącaniu się osadu Cu(OH)
grupy aldehydowe lub ketonowe. Cukry zachowują się jak aldehydy lub
2, co może
nastąpić przy małej ilości cukru. Sól ta wiąże jony Cu+2 w kompleksową sól
ketony, wykazując charakterystyczne własności redukcyjne. Własności te
kwasu winowego.
stanowią podstawę wielu metod analitycznych służących do wykrywania i
ilościowego oznaczania cukrów. Najbardziej znane próby polegają na redukcji
Wykonanie: Zmieszać 20 ml roztworu roztworu Fehling I i 20 ml roztworu
przez cukier kationów metali, np. Cu+2, Bi+3, Ag+1. Cukry redukując jony
Fehling II. Do probówki nalać 0.5 ml roztworu badanego cukru i 0.5 ml
metali same utleniają się do kwasów. Aldozy utleniają się do kwasów
przygotowanej mieszaniny; ogrzać do wrzenia. Występuje zabarwienie lub
aldonowych (utleniona grupa aldehydowa). Utlenianie ketoz jest bardziej
brunatnoczerwony osad wydzielonego Cu
skomplikowane; w wyniku tego procesu powstaje mieszanina kwasów.
2O.
Produkty utleniania fruktozy przedstawia rys.1.
1.5.2. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących - odczyn
Barfoeda
Zasada: Odczyn ten stanowi modyfikację odczynu Fehlinga. Redukcję jonów
miedzi prowadzi się w środowisku słabo kwaśnym (rozcieńczony roztwor
kwasu mlekowego), w którym redukcja przebiega wolniej niż w środowisku
zasadowym. Ponadto w tych warunkach redukcja jonów miedzi zachodzi
3.2
znacznie szybciej w obecności cukrów prostych niż w obecności dwucukrów Wykonanie: W probówce wymieszać 9 ml wody i 1 ml stężonego kwasu
redukujących, a więc dobranie odpowiednich warunków reakcji pozwala na
siarkowego (pamiętaj o kolejności!) a następnie umieścić w niej parę skrawków
rozróżnienie tych dwóch grup związków.
bibuły lub papieru. Wykonać także próbkę porównawczą (bez kwasu i/lub bez
ogrzewania). Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez co
Wykonanie. Do jednej probówki odmierzyć 0.4 ml roztworu glukozy, a do
najmniej 60 min. Po upływie tego czasu nadsącze zobojętnić Na2CO3 + NaOH i
drugiej 0.4 ml roztworu maltozy. Do obu probówek dodać po 1 ml odczynnika
przeprowadzić reakcję Fehlinga.
Barfoeda i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej. W obecności
cukrów prostych wypada po tym czasie czerwony osad Cu2O, natomiast w
obecności dwucukrów redukujących osad pojawia się dopiero po 15-20 min
2.3. Odróżnianie papieru bezdrzewnego od drzewnego
ogrzewania.
Zasada: Papier gazetowy zawiera pentozany (polimery pentoz), które z
floroglucyną i HCl dają wiśniowe zabarwienie.
2. Analiza jakościowa polisacharydów
Wykonanie: Kawałek papieru gazetowego zwilżyć kroplą 2% etanolowego
2.1. Hydroliza skrobi
roztworu floroglucyny i kroplą stężonego roztworu HCl. Papier zabarwia się na
Podczas ogrzewania w środowisku kwaśnym skrobia ulega hydrolizie do
wiśniowo. Reakcja z bibułą filtracyjną wypada ujemnie.
glukozy. Proces ten przebiega stopniowo poprzez stadium dekstryn oraz
stadium maltozy i izomaltozy. Proces hydrolizy można rejestrować przez
określanie własności redukujących (pojawiających się w miarę uwalniania
maltozy, izomaltozy i glukozy) oraz przez barwną reakcję z jodem (zanikającą
4. Kwasy nukleinowe
w miarę ubywania skrobi).
Wykonanie: Do probówki odmierzyć 2.5 ml 1% roztworu skrobi, dodać 1 ml
Odróżnianie RNA od DNA.
1M
1 roztworu kwasu siarkowego. Ogrzewać na łaźni wodnej przynajmniej przez
30 min. Po tym czasie zawartość ostudzić i zobojętnić Na
1. Metoda oparta na reakcji z orcyną
2CO3 + NaOH.
Rozdzielić do dwóch probówek. Przeprowadzić reakcję Fehlinga oraz reakcję z
Zasada. Wolne oraz związane w nukleozydach pentozy podczas ogrzewania ze
jodem na hydrolizacie i na wyjściowym roztworze skrobi. Porównać wyniki.
stężonym HCl przechodzą w furfural, który w obecności jonów Fe+3
kondensuje z orcyną, tworząc związek barwy zielonej. W warunkach
przeprowadzonej próby dezoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej niż ryboza, a
2.2. Hydroliza celulozy
więc dla DNA odczyn wypada ujemnie.
Zasada:W obecności mocnych kwasów i w podwyższonej temperaturze
Wykonanie. Do dwóch probówek zawierajacych po 0.5 ml 0,1% roztworów
celuloza ulega hydrolizie. Ostatecznym produktem hydrolizy tego
RNA lub DNA dodać po 0.5 ml odczynnika orcynowego i umieścić we wrzącej
polisacharydu jest glukoza.
łaźni wodnej na 15 min. W probówce zawierającej RNA pojawia się zielone
zabarwienie.
3.3
2. Metoda oparta na reakcji z difenyloaminą
5. Lipidy
Zasada. Wolna i związana dezoksyryboza tworzy z difenyloaminą związek
Lipidy stanowią grupę zwiazków organicznych o znacznie zróżnicowanej
barwny. W obecności RNA uzyskuje się ujemny wynik.
strukturze. Ich wspólną cechą jest to, że są nierozpuszczalne w wodzie ,
natomiast dobrze rozpuszczają się w rozpuszczalnikach ogranicznych. Z tego
Wykonanie. Do dwóch probówek zawierających po 0.5 ml 0,1% roztworów
też względu izoluje się je najczęściej z odwodnionych tkanek na drodze
RNA i DNA dodać po 0.5 ml odczynnika difenyloaminowego. Probówki
ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnikami . Niejednakowa rozpuszczalność
umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 min. W probówce zawierającej DNA
lipidów w różnych rozpuszczalnikach organicznych może stanowić podstawę
powstaje niebieskie zabarwienie.
ich rozdziału; np. fosfolipidy dobrze rozpuszczają się w eterze, a nie
rozpuszczają się w acetonie. W celu rozdzielenia tłuszczów stosuje się
Odczynniki: 10% alkoholowy roztwór α-naftolu, kwas siarkowy stężony, 0.2 %
najczęściej chromatografię gazowo-cieczową lub cienkowarstwową. Pierwsza z
roztwór antronu w stężonym kwasie siarkowym, rezorcyna in subst., kwas
nich polega na rozdzieleniu metylowych pochodnych lipidów pomiędzy
solny stężony, odczynnik orcynowy (1 g orcyny i 100 mg FeCl3 . 6H2O w stęż.
gazową fazę ruchomą (np: hel) i lipofilną fazę płynną ( np: poliester kwasów
HCl), 1% roztwory: glukozy, fruktozy, glukozoaminy, sacharozy, arabinozy,
dikarboksylowych z alkoholami ). Chromatografię cienkowarstwową lipidów
maltozy, skrobi rozpuszczalnej,
przeprowadza się najczęściej na żelu krzemowym lub tlenku glinu, a do
Fehling I (3.46 g CuSO .
4 5H2O + 0.1 ml kwasu siarkowego stęż. dopełnić wodą
identyfikacji rozdzielanych związków wykorzystuje się reakcje, w ktorych
do 100 ml), Fehling II (17.3 g winianu sodowo-potasowego i 7 g NaOH
powstają barwne kompleksy. Lipidy dzielimy na tłuszcze proste wśrod ktorych
dopełnić do 100 ml), odczynnik Barfoeda, 1M kwas siarkowy, Nasycony r-r
wyróżniamy tłuszcze właściwe (estry glicerolu i wyższych kwasów
Na2CO3 w 30 % NaOH, roztwór I i KI (1 g I i 2 g KI rozpuścić w 300 ml wody),
tłuszczowych ) i woski (estry wyższych jednowodorotlenowych alkoholi i
2% roztwór floroglucyny w etanolu, 0.1% roztwory DNA i RNA, odczynnik
wyzszych kwasów tłuszczowych ), oraz tłuszcze złożone, do których zaliczamy
difenyloaminowy (1g difenyloaminy + 100 ml stęż. kwasu octowego + 2.75 ml
fosfolipidy i glikolipidy. Inną grupę lipidów stanowią pochodne izoprenu .
stęż. kwasu siarkowego), próbka-zagadka (dowolny z występujących w instr.
Zaliczane tu są m.in. sterydy, karotenoidy, dolichole, fitol. Lipidy są
roztworów cukrowców).
podstawowym składnikiem błon biologicznych. Pełnią rownież w organizmie
funkcję zapasowego materiału energetycznego. Obejmują rownież prekursory
niektórych witamin oraz szereg hormonów.
1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu
krzemionkowym
Zasada:Chromatografia cienkowarstwowa pozwala na prowadzenie rozdziału
zarówno w środowisku polarnym jak i apolarnym. Rozdział substancji zachodzi
na zasadzie odwracalnej, fizycznej adsorpcji, podziału substancji między dwie
fazy ciekłe (fazą stacjonarną jest ciecz zaadsorbowana na ziarnach żelu), a także
3.4
na zasadzie wymiany jonowej (np. żel krzemionkowy ma odczyn słabo
Płytkę włożyć na 20 min do komory wypełnionej parami jodu. Następnie
kwasowy). Najczęściej ma miejsce kombinacja wszystkich trzech opisywanych
odbarwiać przez kilka minut na powietrzu (pod digestorium). Jod uwidacznia
mechanizmów z przewagą jednego z nich. Do rozdzielania mieszaniny lipidów
lipidy, tworząc z nimi barwny kompleks.
wykorzystywana jest metoda chromatografii na żelu krzemionkowym. Stosując
różne układy rozpuszczalników można tą metodą rozdzielać różne grupy
lipidów. Lipidy są związkami bezbarwnymi i aby je zidentyfikować, płytkę po
2. Chromatografia bibułowa barwników liścia
rozdziale poddaje się wybarwianiu przy użyciu różnych reakcji
charakterystycznych.
Powszechnie stosowanym typem chromatografii podziałowej jest
chromatografia z zastosowaniem bibuły jako nośnika fazy nieruchomej (zwykle
Wykonanie:
rozpuszczalnika bardziej polarnego). Podczas wędrówki fazy ruchomej
(rozpuszczalnika mniej polarnego) po nośniku następuje ciągłe ustalanie
Esktrakcja lipidów:
równowagi podziału substancji rozdzielanych pomiędzy te dwie fazy. Po
Ok. 2 g świeżych liści pszenicy pociąć drobno i ucierać w moździerzu z
zakończeniu rozwijania chromatogramu poszczególne składniki rozdzielanej
niewielką ilością piasku lub tłuczonego szkła. Dodać 10 ml mieszaniny
mieszaniny zostają zatrzymane w różnych miejscach nośnika w zależności od
chloroform:metanol 1:2 (v/v). Całość ucierać jeszcze przez kilka minut,
wartości ich współczynnika podziału między fazę ruchomą i stacjonarną.
wymieszać i odczekać, aż fragmenty tkanki opadną na dno moździerza. Nadsącz
metanolowy zebrać i przesączyć przez sączek do probówki.
Rozdział:
Wykonanie:
Na gotowej płytkę z naniesioną warstwą żelu krzemionkowego o wymiarach
ok. 20x5 cm narysować ołówkiem linię startu w odległości ok. 0.5 cm od
Przygotowanie ekstraktu barwników:
krótszego brzegu i zaznaczyć na niej 5 miejsc do nanoszenia próbek (3 wzorce
Z homogenatu otrzymanego w wyniku rozcierania liści w poprzednim
(monogalaktozyodiacyloglicerol (M), digalaktozylodiacyloglicerol (D),
doświadczeniu pobrać ciemnozieloną warstwę dolną (chloroformową),
sulfolipid (S)) i 2 różne ilości próbki (np. 20 i 50 µl ekstraktu (P1 i P2)).
możliwie bez fragmentów tkanek, przesączyć przez bibułę i w razie potrzeby
Podpisać miejsca nanoszenia próbek i wzorców. Na odpowiednie pola za
zagęścić przez odparowanie (mieszając w zlewce włożonej do ciepłej wody, pod
pomocą mikrostrzykawki nanieść po 5 µl wzorców i odpowiednie ilości
digestorium). Część ekstraktu (ok. 1 ml) odlać do probówki i dodać do niej 20-
ekstraktu, starając się, by powstająca plama była jak najmniejsza. Po każdym
50 µl stężonego HCl.
roztworze płukać mikrostrzykawkę chloroformem. Można przyspieszyć
parowanie rozpuszczalnika, dmuchając na płytkę strumieniem zimnego
Przeprowadzenie rozdziału
powietrza z suszarki. Po naniesieniu próbek włożyć płytkę do komory
Na bibule chromatograficznej o wymiarach ok. 23x15 cm narysować ołówkiem
chromatograficznej z mieszaniną aceton:benzen:woda 81:30:4 (v/v/v) i rozwijać
2 linie startu, w odległości ok. 2.5 cm od dłuższej krawędzi bibuły. Następnie
do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika odległości ok. 1 cm od
na te linie nanieść kilkakrotnie pipetą Pasteura otrzymane ekstrakty, susząc
górnego końca płytki. Płytkę wyjąć i suszyć pod digestorium.
miejsca nanoszenia strumieniem zimnego powietrza z suszarki. Bibułę spiąć w
Barwnienie:
walec i umieścić w komorze chromatograficznej o poj. ok. 1 l zawierającej na
dnie warstwę ok. 1 cm mieszaniny o składzie benzyna : aceton 125:15 (v/v).
3.5
Rozdział prowadzić do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika
górnej krawędzi bibuły. Następnie chromatogram wyjąć ze zlewki i wysuszyć.
Materiały:
Obrysować ołówkiem widoczne na chromatogramie barwne plamy, wyciąć
Zielone liście (pszenicy, Bilbergia sp. lub t.p.) płytki do TLC pokryte żelem
obrysowane fragmenty bibuły pokroić na drobne paseczki i wyekstrahować
krzemionkowym, bibuła chromatograficzna, ew. materiał do oznaczania
barwniki acetonem. Wykonać widma absorpcyjne tak uzyskanych roztworów
cholesterolu.
barwników. Określić wpływ środowiska kwaśnego na skład barwnikowy liścia.
Odczynniki:
Wzorce lipidów, solwent do chromatografii cienkowarstwowej j.w., jod,
3. Wykrywanie cholesterolu (odczyn Liebermanna-Burcharda)
benzyna, aceton, chloroform, metanol, bezwodnik kwasu octowego, stężony
kwas siarkowy, stężony kwas solny, chloroformowy roztwór cholesterolu
Zasada: Pod wpływem stężonego kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu
octowego tworzy się zabarwiony kwas monosulfonowy bicholestadienu.
Sprzęt:
Reakcję tę wykorzystuje się także do ilościowego oznaczania cholesterolu
Komora do chromatografii bibułowej, komora do chromatografii
metodą spektrofotometryczną.
cienkowarstwowej, komora do barwienia w parach jodu, mikrostrzykawka 10
µl, pipety pasteurowskie z obtopionymi końcami, suszarka, szkło laboratoryjne,
Wykonanie: Badaną próbkę rozpuścić w chloroformie; jeżeli utworzyła się
pipety automatyczne 1000 i 200 µl.
górna warstwa wodna, to zebrać warstwę dolną (chloroformową), dodać do niej
bezwodnego siarczanu magnezu (w celu odwodnienia) wytrząsnąć przez 2 min,
odstawić i po chwili zebrać ciecz znad osadu. 0.5 ml roztworu zadać 1 ml
bezwodnika kwasu octowego i (ostrożnie, może wyprysnąć podczas
dodawania!) 150 µl stężonego kwasu siarkowego. O obecności cholesterolu
świadczy zabarwienie z początku różowo-czerwone następnie przechodzące w
zielone. Równoczenie wykonywać próbę kontrolną na próbce nie zawierającej
cholesterolu i próbę na chloroformowym roztworze cholesterolu. UWAGA:
Szkło używane do oznaczeń musi być suche!
3.6