Seminarium 1
Właściwości fizyko-chemiczne białek
Agenda
1. Aminokwasy
2. Peptydy
3. Białka
1. Właściwości białek
" Amfoteryczność
" Koloidy
" Wysalanie
" Denaturacja
4. Oznaczanie białek
" Próby jakościowe
" Próby ilościowe
1. Aminokwasy
- 20 standardowych aminokwasów (złożoność białka, podstawowy budulec białka)
ą  aminokwasy (19)
" pierwszorzędowa grupa aminowa (-NH3)
" pierwszorzędowa grupa karboksylowa (-COOH)
" węgiel ą (Cą)
" zmienny łańcuch boczny (-R)
Alanina (Ala; A)
ą  iminokwas
Prolina (drugorzędową grupę aminową (-NH3))
1. Aminokwasy
- Stereoizomery (enancjomery)
4 różne grupy ułożone centralnie wokół węgla ą.
L i D  aminokwasy (w białkach występują tylko L-aminokwasy; D  aminokwasy
występują w ścianach komórek bakteryjnych i antybiotykach )
1. Aminokwasy
- 20 standardowych aminokwasów
Różnica to struktura łańcucha bocznego  R = właściwości fizyko-chemiczne (można
je podzielić na grupy):
- Hydrofobowe (alifatyczne grupy R)  8 aa
- Hydrofobowe (aromatyczne grupy R)  3 aa
- Polarne (ładunek +)  5 aa
- Polarne (bez ładunku)  4 aa
Cechy charakterystyczne:
polarność, kwasowość, zasadowość, aromatyczność, obojętność, sztywność
konformacji, zdolność do tworzenia wiązań wodorowych, zdolność do tworzenia
wiązań poprzecznych, reaktywność chemiczna
1. Aminokwasy
- Hydrofobowe, alifatyczne:
G, A, V, L, I, M, P, C
- Hydrofobowe (aromatyczne grupy R)
F, Y, W
- Polarne (ładunek  +/- )
" grupy aminowe: R, K, H,
" grupy karboksylowe: D, E
- Polarne (bez ładunku)
N, Q, S, T
1. Aminokwasy
Jonizacja wolnej grupy aminowej, karboksylowej i łańcuchy boczne (R)
2. Peptydy = Właściwości chemiczne aminokwasów do kondensacji
" Kondensacja prowadzi do powstawania peptydów, a następnie do powstawania
super struktur  białek
" Kondensacja 2 aminokwasów daje dipeptyd.
" Wiązanie pomiędzy 2 aminokwasami nazywa się wiązaniem peptydowym
wiązanie peptydowe
2. Peptydy = Właściwości chemiczne aminokwasów do kondensacji
" Oligopeptydy (< 25 aa)
" Polipeptydy (> 25aa) zbudowane z więcej niż 100 reszt aa nazywane są białkami.
" Peptydy mają bardzo duże znaczenie biologiczne.
" Tripeptyd glutation, obecny w większości żywych komórek, zbudowany jest z
trzech reszt aminokwasowych: Q,C i G.
wiązania peptydowe?
3. Białka
" Kolejność reszt aminokwasowych w łańcuchu  struktura pierwszorzędowa
białka.
" A
ańcuchy peptydowe przybierają określone kształty przestrzenne. Są one
wynikiem oddziaływań pomiędzy łańcuchami bocznymi (R) określonych
aminokwasów w różnych częściach tego samego białka. Powstanie w wyniku
takich oddziaływań struktury spiralnej noszącej nazwę ą-helisy nosi nazwę
struktury drugorzędowej.
" Inną formą struktury drugorzędowej jest struktura �  swoista drabinka
utworzona oddziaływaniami pomiędzy dwoma sąsiednimi łańcuchami białkowymi.
" Struktura trzeciorzędowa - twór powstający w wyniku przestrzennego
zapętlenia i skręcania się struktur drugorzędowych (np. białka globularne )
" Struktury czwartorzędowe - kształtują się w wyniku łączenia się ze sobą struktur
drugo i trzeciorzędowych.
Przykładem może być hemoglobina, która jest zbudowana z 4 jednostek
mioglobiny połączonych ze sobą mostkami.
3. Białka
3.1. Właściwości białek
Amfoteryczność
Obecność w aa grupy  COOH i  NH2 powoduje, że aa są związkami amfoterycznymi.
Ich charakter jest zależny od stężenia jonów wodorowych.
Proporcja między ilością wolnych grup  NH2 i wolnych grup  COOH jest specyficzna
dla różnych białek, stąd różnorodność własności fizykochemicznych roztworów tych
białek.
pI - punkt izoelektryczny aa (ładunki  + = ładunki  - )
pH = 1 pH=7 pH=11
3.1. Właściwości białek
Koloidy
Białka dobrze rozpuszczają się w wodzie tworząc tzw. roztwory koloidalne. Cząsteczki
białka są duże i potrafią oddziaływać z cząsteczkami wody, tworząc wiązania
wodorowe. Tworzą się otoczki solwatacyjne: cząsteczki wody otaczają w cząsteczkę
białka (roztwór koloidalny).
Cechy koloidu:
" niskie ciśnienie osmotyczne,
" zwiększona lepkość,
" niskie napięcie powierzchniowe,
" niemożność przechodzenia cząstek
przez błony półprzepuszczalne, Światło przechodzące przez r-r koloidalny tworzy widoczną smugę
" charakterystyczne własności optyczne  efekt Tyndalla,
" zdolność przechodzenia ze stanu zolu (forma ciekła) w żel (forma elastycznego ciała
stałego) i odwrotnie
3.1. Właściwości białek
Wysalanie
" Otoczkę solwatacyjną (wodną) białka można zniszczyć, dodając do roztworu
mocnego elektrolitu (sole, które łatwo tworzą wodziany  siarczan amonu,
siarczan sodu, siarczan magnezu), którego jony są silniej solwatowane przez
cząsteczki wody.
" Następuje wówczas strącanie się białka zwane wysalaniem.
" Proces ten nie narusza struktury przestrzennej białka, jest w pełni odwracalny.
" Wysalanie nie powoduje denaturacji białka.
" Metodę tą stosuje się do wytrącania osadów białek z roztworów .
3.1. Właściwości białek
Denaturacja
" proces niszczenia wyższych struktur białkowych (II, III i IV  rzędowych), czyli nie
odwracalne rozerwanie wiązań wodorowych i innych oddziaływań wiążących
łańcuchy polipeptydowe,
" pod wpływem wielu czynników chemicznych: sole metali ciężkich (Pb, Cd, Hg),
mocne kwasy, reaktywne związki organiczne (np. aldechyd mrówkowy),
" wysoka temperatura,
" drastyczne zmiany pH,
" działanie ultradz
więków,
" promieniowanie jonizujące
Odtwarzanie struktur drugorzędowych, a następnie ponowne fałdowanie w
struktury wyższego rzędu to renaturacja.
4. Oznaczanie białek
" Próby jakościowe  na obecność białka w roztworze
1. stwierdzenie obecności w roztworze azotu nieorganicznego
2. stwierdzenie wielkocząsteczkowego charakteru rozpuszczonej substancji
3. stwierdzenie obecności wiązania peptydowego
4. potwierdzenie możliwości precypitacji badanego materiału
4. Oznaczanie białek
" Próby jakościowe  na obecność białka w roztworze
3. stwierdzenie obecności wiązania peptydowego
Metoda biuretowa (skala 0,5- 5 mg)
Jony miedzi (CuSO4) w środowisku zasadowym tworzą barwny kompleks
(barwa fioletowa) z atomami tlenu karbonylowego i azotu wiązań peptydowych.
Barwny kompleks oznacza się fotometrycznie przy długości fali 530 - 550 nm.
Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest
proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych
4. Oznaczanie białek
" Próby jakościowe  na obecność białka w roztworze
Metoda z kwasem kwasem bis-cynchoninowym (BCA)
" W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan,
cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+
" Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z kwasem biscynchoninowym (BCA)
" Fioletowy kompleks BCA z jonami miedzi oznacza się fotometrycznie  562nm
4. Oznaczanie białek
" Próby ilościowe  na obecność białka w roztworze
Metoda Branforda
W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego 
Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi białek
Wiązanie ma charakter oddziaływań elektrostatycznych
(oddziaływanie grup SO3- z naładowanymi resztami aa)
CBB G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie,
które po reakcji z białkami zmienia się na błękitne.
Wiąże się z tym zmiana maksimum absorpcji
z 465 nm na 595 nm
Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze
4. Oznaczanie białek
" Próby ilościowe  na obecność białka w roztworze
Metoda Lowry ego* - wykorzystuje się 2 odrębne reakcje:
1. Reakcję aminokwasów z odczynnikiem Folina-Ciocalteau
Tyrozyna oraz przypuszczalnie tryptofan,cysteina i histydyna w białkach redukują
jony molibdenu (kwasu fosforomolibdenowego) i jony wolframu (kwasu
fosforowolframowego) zawarte w odczynniku do niższych barwnych (niebieskie)
tlenków.
2. Reakcja biuretowa: Jony miedzi(II) tworzą kompleksowe połączenia z wiązaniami
peptydowymi, uczestniczą również w redukcji odczynnika Folina, przez co zwiększa
się czułość reakcji.
Końcowa barwa jest wynikiem tych dwóch reakcji. Pomiar jest spektrofotometryczny
 długość fali 750nm.
4. Oznaczanie białek
" Próby ilościowe  na obecność białka w roztworze
Pomiar w zakresie UV
Białka, dzięki obecności w swoim składzie aminokwasów aromatycznych (tyrozyna,
tryptofan) wykazują zdolność absorpcji światła o długości fali 280 nm