Biochemia ŻYWIENIE CZA
OWIEKA Ćwiczenie 2
Ćwiczenie 2
Temat: WA
AŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNE BIAA
EK. FRAKCJONOWANIE
BIAA
EK.
Część teoretyczna
Białka są to związki wysokocząsteczkowe, powstałe w wyniku połączenia szeregu amino-
kwasów wiązaniem peptydowym w długi łańcuch polipeptydowy. Ilość, rodzaj i kolejność amino-
kwasów w tym łańcuchu określane bywają mianem pierwotnej struktury białka (struktura I-
rzędowa). Termin wtórna struktura białka dotyczy sposobu i stopnia zwinięcia łańcucha polipepty-
dowego (struktura II-rzędowa) oraz kształtu przestrzennego cząsteczki białka, który utrwalony jest
przez szereg różnego typu wiązań (struktura III-rzędowa). Charakterystyczna dla niektórych białek
struktura IV- rzędowa określa stopień asocjacji lub polimeryzacji cząsteczek białka w większe
agregaty. Utrwalona jest ona przez wiązania dwusiarczkowe i inne.
Białka mają charakter koloidu hydrofilnego. Dzięki posiadanemu ładunkowi elektrycznemu
w roztworze wodnym ich cząsteczki otoczone są "płaszczem wodnym". Pod wpływem różnych
czynników (wysalanie, pozbawienie ładunku, zmiany struktury wtórnej) obecne w roztworze białka
mogą ulec wytrąceniu czyli koagulacji. Jest to częsty sposób usuwania czy wyosabniania białka.
Funkcjonalne właściwości białek, ważne w technologii żywności wynikają właśnie z oddziaływań z
wodą, a także z oddziaływań z jonami, innymi białkami, sacharydami oraz lipidami i odgrywają
szczególna rolę na granicach faz. Najważniejsze funkcjonalne cechy białek przejawiają się w zwil-
żaniu się, pęcznieniu, rehydratacji, utrzymywaniu wody, rozpuszczalności, lepkości, żelowaniu,
pienieniu się, tworzeniu włókien, błon i emulsji.
Proces denaturacji rozumiany jest jako zniszczenie wtórnej struktury białka. Następuje ono
pod wpływem podwyższonej temperatury, ekstremalnych wartości pH, soli metali ciężkich itp. De-
naturacji towarzyszą zmiany we właściwościach fizyko-chemicznych białka. Zmiany te są zwykle
nieodwracalne. Denaturacja cieplna na ogół zwiększa strawność białka. Ponadto ogrzewanie w od-
powiednich warunkach unieczynnia białkowe składniki przeciwżywieniowe wielu surowców, m. in.
inhibitory proteaz. Jednak nadmierne ogrzewanie produktów bogatych w białko może powodować
zmniejszenie biologicznej dostępności wielu aminokwasów, przede wszystkim wskutek utrudnienia
trawienia. Szczególnie wrażliwe na ogrzewanie są cysteina, lizyna, metionina, tryptofan, arginina i
leucyna.
Klasyfikację białek oprzeć można na różnych kryteriach, jak: obecność i rodzaj składnika
niebiałkowego, kształt cząsteczki, rozpuszczalność w wodzie i roztworach soli itp.
Szerzej potraktowane wiadomości na powyższe tematy można znalez
ć w każdym akademic-
kim podręczniku biochemii i chemii żywności.
1
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia ŻYWIENIE CZA
OWIEKA Ćwiczenie 2
Część praktyczna
A) WA
AŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNE BIAA
EK
1. WYKRYWANIE WI
ZANIA PEPTYDOWEGO - REAKCJA BIURETOWA
W środowisku zasadowym wiązanie peptydowe łatwo przechodzi w formę enolową. Jon Cu++
łączy się w tych warunkach wiązaniami głównymi z grupami karboksylowymi, zaś wiązaniami ko-
ordynacyjnymi z azotem. Powstaje kompleks o barwie fioletowej. Nazwa tej reakcji pochodzi od
biuretu (produkt kondensacji dwóch cząsteczek mocznika), który posiada wiązanie -CO-NH- i two-
rzy również z miedzią fioletowy kompleks.
_
O
O O
O
++
Cu
NaOH C C
+
C
N +
2 Cu
C N
2
+
+
N H
H N
H
H
fioletowy kompleks
Wykonanie:
Do dwóch suchych probówek wsypać po ok. 0,2 g mocznika. Jedną probówkę ogrzać nad
palnikiem aż do momentu stopienia mocznika i wydzielenia amoniaku (powstaje biuret). Po ostu-
dzeniu do obu probówek dodać po 2 ml wody. Do trzeciej probówki odmierzyć 2 ml roztworu kaze-
iny.
Do wszystkich trzech probówek dodać 2 ml 10% NaOH i 3-4 krople 1% roztworu CuSO4. W
obecności wiązań peptydowych (peptydy, białka) pojawia się zabarwienie od różowego do fioleto-
wego.
2. WPA
YW pH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ BIAA
KA - WYZNACZANIE PUNKTU
IZOELEKTRYCZNEGO KAZEINY.
Białka są jonami wielowartościowymi ze względu na obecność w nich licznych aminokwa-
sów zawierających dysocjujące grupy, nie biorące udziału w wiązaniach peptydowych. W zależno-
ści od rodzaju aminokwasów i pH środowiska, cząsteczka białka może być wielowartościowym ka-
tionem lub anionem, względnie przy jednakowej ilości ładunków dodatnich i ujemnych - elektrycz-
nie obojętna. Taka wartość pH przy której cząsteczka białka jest elektrycznie obojętna nazywa się
punktem izoelektrycznym. A
adunek elektryczny, którym obdarzone są cząsteczki białka, zapobiega
koagulacji. Jeżeli ładunek ten zostanie usunięty (co ma miejsce w punkcie izoelektrycznym) wów-
czas cząsteczki białka łączą się w większe skupiska (agregacja) i w konsekwencji mogą wypaść z
roztworu (koagulacja). Wpływ pH na rozpuszczalność białka wykorzystuje się w przemyśle spo-
żywczym, m.in. przy ekstrakcji białek z różnych surowców.
Wykonanie:
Przygotować 10 suchych probówek i sporządzić w nich roztwory o różnym pH, to znaczy roz-
lać 0,1 M kwas cytrynowy i 0,1 M cytrynian sodu zgodnie z poniższą tabelą i wymieszać. Do każ-
dej probówki dodać po 1 ml roztworu kazeiny (0,5% w 0,1 M cytrynianie sodu), wymieszać. Po 15
minutach obserwować stopień zmętnienia płynu w probówkach i ilość wytrąconego białka.
Wyniki zamieścić w tabeli (poniżej), wyciągnąć wnioski.
2
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia ŻYWIENIE CZA
OWIEKA Ćwiczenie 2
nr. ml ml
pH zmętnienie / osad
probówki cytrynianu sodu kwasu cytrynowego
1 0,6 4,4 3,6
2 1,0 4,0 3,8
3 1,3 3,7 4,0
4 1,5 3,5 4,2
5 1,7 3,3 4,4
6 1,9 3,1 4,6
7 2,2 2,8 4,8
8 2,5 2,5 5,0
9 2,7 2,3 5,2
10 3,0 2,0 5,4
3. WYTR
CANIE BIAA
KA Z ROZTWORU I BADANIE JEGO AKTYWNOŚCI
BIOLOGICZNEJ.
Wytrącanie białka z roztworu może być spowodowane różnymi czynnikami chemicznymi lub
fizycznymi (podwyższona temperatura, zmiana pH, sole metali ciężkich, sole metali alkalicznych).
W zależności od rodzaju czynnika rozróżnia się wytrącanie związane z denaturacją i z wysalaniem.
Denaturację określa się jako przemianę związaną ze zniszczeniem wtórnej struktury białka, a więc
białko zdenaturowane traci swoją aktywność biologiczną. Denaturację powodują takie czynniki jak:
ogrzewanie, napromieniowanie, znaczne zmiany pH, duże stężenie soli metali ciężkich, długotrwałe
działanie alkoholem.
W przeciwieństwie do denaturacji, wysalanie jest procesem w pełni odwracalnym, gdyż doda-
tek odpowiedniej ilości wody powoduje ponowne rozpuszczenie wytrąconego białka. Wysalanie
przebiega pod działaniem wyższych stężeń soli metali alkalicznych lub soli amonowych. Białka
wytrącone tym sposobem zachowują w pełni swoje właściwości biologiczne.
Wykonanie:
Do 3 probówek wirówkowych odmierzyć po 1 ml roztworu białka enzymatycznego o aktyw-
ności amylolitycznej (Taka-diastaza), do pierwszej probówki dodać 4 ml 96% alkoholu, do drugiej
około 0,7 g (NH4)2SO4, do trzeciej kilka kropli AgNO3, zamieszać. Po 15 minutach osady odwiro-
wać, zlać supernatant, a osady dobrze rozpuścić w 1,5 ml wody. Osobno do 2 zwykłych probówek
odmierzyć po 1 ml Taka-diastazy, jedną z nich zagotować i po ostudzeniu do obu dodać po 1,5 ml
wody.
Przygotować 10 probówek z 2 ml I2 w KI każda oraz 5 probówek z 5 ml roztworu skrobi. Do
pierwszej probówki ze skrobią dodać 1 ml białka enzymowego wytrącanego alkoholem (włączyć
stoper), do drugiej 1 ml białka wytrącanego (NH4)2SO4 - 1 min., do trzeciej 1 ml białka wytrącane-
go AgNO3 - 2 min., do czwartej 1 ml białka zagotowanego - 3 min., do piątej 1 ml białka nie pod-
danego wytrącaniu - 4 min. Po dodaniu białka probówki dobrze mieszać.
Po 5 min. od początku reakcji pobierać kolejno co 1 minutę z każdej probówki po 1 ml roz-
tworu skrobi i przenosić go do przygotowanych probówek z roztworem I2 w KI (z pierwszej pro-
bówki w 5 i 15 min.). Obserwować zanik barwy z jodem, wyciągnąć wnioski.
3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia ŻYWIENIE CZA
OWIEKA Ćwiczenie 2
B) FRAKCJONOWANIE BIAA
EK METOD
ELEKTROFOREZY BIBUA
OWEJ.
Białka wykazują określony, wypadkowy ładunek elektryczny. Znak i wielkość tego ładunku
zależy od rodzaju i ilości dysocjujących grup w cząsteczce. Cząsteczki obdarzone ładunkiem mogą
wędrować w polu elektrycznym. Zjawisko to nosi nazwę elektroforezy. Elektroforeza jest bardzo
ważną i powszechnie stosowaną metodą rozdzielania i oczyszczania białek. W elektroforezie bibu-
łowej nośnikiem jest pasek bibuły chromatograficznej zwilżony odpowiednim buforem i zanurzony
dwoma końcami w wanienkach wypełnionych buforem i zaopatrzonych w elektrody. Naładowane
cząsteczki wędrują wzdłuż bibuły z prędkością zależną od ładunku, masy i kształtu cząsteczki, pH,
rodzaju buforu, napięcia i natężenia przepływającego prądu oraz innych czynników. Budowę apara-
tu do elektroforezy bibułowej przedstawia schematycznie poniższy rysunek.
komora bibuła
+
anoda katoda
bufor
woda
Odczynniki:
białko jaja rozcieńczone 1:3 buforem o pH 3,0 lub 3% roztwór albuminy w buforze o pH 3,0
bufor cytrynianowo-fosforanowy (Mc Ilvaine a) 0,1 M o pH 3,0
0,1% roztwór błękitu bromofenolowego w metanolowym roztworze HgCl2
0,5% kwas octowy
Wykonanie:
Z bibuły Whatman 1 wyciąć paski o wymiarach 33 x 4 cm, zaznaczyć linię środkową oraz
znaki "+" i "-" i założyć ciężarki na końcach pasków. Zwilżyć cały pasek buforem o pH 3,0 i umie-
ścić w aparacie do elektroforezy. Przy pomocy pręcików szklanych delikatnie ułożyć pasek bibuły
w prawidłowym położeniu tj. prostopadle do ramy podtrzymującej paski, przestrzegając, aby środ-
kowa linia na pasku była jednakowo odległa od poziomu buforu w obu komorach elektrodowych.
Przy pomocy mikropipetki nanieść na środek paska, pasmowo, niewielką ilość roztworu białka.
Zamknąć komorę i włączyć prąd (300 V). Po 2,5 godz. aparat wyłączyć, paski wyjąć, obsuszyć przy
pomocy arkusza bibuły i wywołać w roztworze błękitu bromofenolowego. Następnie przepłukać je
kilka razy w 0,5% kwasie octowym w celu odbarwienia miejsc wolnych od białek. Wysuszyć paski
i ewentualnie przeciągnąć nad stężonym NH3 dla utrwalenia barwy. Określić charakter elektrokine-
tyczny rozdzielonych frakcji.
Ostatnie zmiany: 13.02.2013
4
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Katedra Biotechnologii Żywności