Warszawa, 13.03.2005
Elementy Biotechnologii
WYKA
AD NR 2
Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii
ELEMENTY BIOTECHNOLOGII
WYKA
AD NR 2
Reakcje katalityczne i enzymatyczne.
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych.
Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych.
Inhibicja enzymów.
Kinetyka układów oscylujących.
Biochemia, fizjologia i termodynamika wzrostu i metabolizmu
drobnoustrojów.
Wydajność i selektywność mikroorganizmów i enzymów.
literatura wykorzystana do wykładu
P. Kafarski, B. Lejczak: Chemia Bioorganiczna, PWN, Warszawa 1994
Aiba, Humprey, Millis: Inżynieria biochemiczna, WNT Warszawa 1977
J. KÄ…czkowski: Podstawy Biochemii, rozdz. 5, WNT, Warszawa
Atkins: Chemia Fizyczna
Reakcje katalityczne i enzymatyczne
definicje i pojęcia do przypomnienia
" szybkość reakcji chemicznej
" rzędowość reakcji
" cząsteczkowość reakcji
" wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych
" energia aktywacji
" katalizator
Podstawy kinetyki chemicznej
szybkość reakcji chemicznej
d[A] d[P]
A P
v = - =
d Ä d Ä
1 d[i]
A + 2B P
v =
½A = -1
½i d Ä
½A = -2
½p = 1
rzędowość reakcji chemicznej
reakcje I i II rzędu
rzędowość względem poszczególnych substratów i rzędowość całkowita
reakcje zerowego rzędu
cząsteczkowość reakcji
Podstawy kinetyki chemicznej
wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych
v = k(T) * f(c)
ln k
nachylenie
równanie Arrheniusa:
= -Ea/R
lnk = lnA  Ea/RT
-Ea/RT
k = A e
1/T
A  czynnik przedwykładniczy
" teoria zderzeń aktywnych
" teoria stanu przejściowego
Reakcje katalityczne
Energia aktywacji
" zbliżanie się cząsteczek do siebie
energia
" rozrywanie wiązań
Ea1
Ea2
-Ea/RT
substraty
k = A e
Q
produkty
współrzędna reakcji
droga alternatywna:
katalizator
energia
" obniżenie Ea
Ea1
Ea2
" wzrost szybkości reakcji
substraty
Q
katalizatory:
produkty
" homogeniczne
współrzędna reakcji
" heterogeniczne
Reakcje katalityczne
katalizatory homogeniczne
katalizator X
kataliza homogeniczna - jednofazowa Substrat S Produkt P
k1
k1 [SX]
S + X SX
K= =
k-1
k-1 [S][X]
k2
SX P + X
[X] = [X]o-[SX]
k1 [SX]
gdy k2 < k1
=
szybkość reakcji jest zależna
k-1 [S] ([X]o-[SX])
od szybkości rozpadu kompleksu przejściowego:
d[P]
k1[S]
stężenie kompleksu przejściowego
= k2 [SX] = k2 [X]o
dÄ
k1[S] + k-1
k1[S]
[SX]= [X]o
k1[S] + k-1
Reakcje katalityczne
katalizatory homogeniczne
katalizator X
Substrat S Produkt P
gdy k2 > k1
szybkość reakcji jest zależna
od szybkości powstawania kompleksu przejściowego:
k1
S + X SX
k-1
k2
stan quasi-stacjonarny:
SX P + X
d[SX]
= k1 [S]([X]o-[SX])  k-1[SX]  k2[SX] =0
dÄ
stężenie kompleksu przejściowego
d[P]
k1[S]
k1[S]
= k2 [SX] = k2 [X]o
[SX] =
dÄ
k1[S] + k-1 + k2
k1[S] + k-1 + k2
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
katalizator X
Substrat S Produkt P
ETAPY KATALIZY WIELOFAZOWEJ
" dyfuzja S do X
istotne: prędkości przepływu reagentów rozdrobnienie katalizatora
" chemisorpcja S na powierzchni X
istotne: centra aktywne, temperatura chemisorpcji, rozwinięcie powierzchni
" przegrupowanie atomów i utworzenie P
" desorpcja P z powierzchni X
istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym
" dyfuzja P z powierzchni X
istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
katalizator X
Substrat S Produkt P
AKTYWNOŚĆ KATALIZATORA
" skład katalizatora
" wielkość i charakter powierzchni
" temperatura
" odporność na uszkodzenia mechaniczne i termiczne
" odporność na zatrucie
truciznÄ… katalizatora jest
substancja bardziej aktywna niż
zatrucie odwracalne i nieodwracalne
reagent właściwy.
najczęściej związki tlenowców i
azotowców
(N, P, As, O, S, Se, Te)
chwilowa dezaktywacja trwała dezaktywacja
ustępuje po usunięciu ustępuje po regeneracji;
zanieczyszczeń czasem trzeba całkowicie
z przestrzeni reakcyjnej wymienić katalizator na nowy
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
Cechy idealnego katalizatora przemysłowego
" aktywny
" selektywny
" termoodporny
" odporny na zatrucie
" wytrzymały mechanicznie
" Å‚atwy do regeneracji
" tani
Rodzaje katalizatorów kontaktowych
czyste substancje: Pt, Ni, Fe2O3, Al203, AlCl3, V2O5, Cr2O3, WO3 i inne
częściej są to mieszaniny związków
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
katalizator przemysłowy:
właściwy katalizator + aktywator + nośnik
zwiększa powierzchnię i wytrzymałość
zwiększa aktywność katalizatora
katalizatora
np. zwiększa liczbę centrów aktywnych,
np. krzemionka, wyroby szamotowe,
polepsza termoodporność,
siarczan baru
tworzy połączenia o wyjątkowej aktywności
katalizatory szkieletowe -
nikiel Raneya
Reakcje enzymatyczne
ENZYMY
(biokatalizatory, fermenty, zaczyny)
BIAA
KA PROSTE LUB ZA
OŻONE B
D
CE KATALIZATORAMI
REAKCJI CHEMICZNYCH ZACHODZ
CYCH W UKA
ADACH
BIOLOGICZNYCH
masa czÄ…steczkowa:
od 9000 (acylofosfataza) - 60 jednostek aminokwasowych
do 155 000 (podjednostka ² polimerazy RNA) (1000 reszt aminokwasowych)
ENZYM ZA
OŻONY = część białkowa + grupa prostetyczna (niebiałkowa)
apoenzym + koenzym
specyficzność
substratowa typu reakcji
spośród wielu substancji tylko
spośród wielu reakcji zachodzi
nieliczne (zazwyczaj jedna)
tylko jedna, katalizowana przez
ulega reakcji katalizowanej
enzym
przez enzym
CENTRUM AKTYWNE
miejsce zawierajÄ…ce odpowiednio rozmieszczone grupy funkcyjne
biorące bezpośredni udział w procesie katalizy
budowa centrum aktywnego:
kształt:
pofałdowanie łańcucha polipeptydowego
grupy funkcyjne:
reszty boczne aminokwasów, kationy Zn, Cu, Mg, Mn, Co, Mo, Fe, Ni
dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
O
O
H H
NH2
NH2
+2e + 2H
N
N
R
R
NAD+
NADH
O
NADPH = fosforan NADH
HO P O
O
O
nikot
H H
HO P O
O
H
H
H H
H
OH OH
H
OH OH
O
NH2
O
NH2
N
N
N
N
N
N
N
N
HO P O
HO P O
O
O
O
O
H H
H H
H
H
H
H
OH
OH OH OPO22-
O
O
H H
Przykłady reakcji przebiegających z udziałem
NH2
NH
+2e + 2H
nukleotydów nikotynoadeninowych
N
N
R
R
NAD+ NADH
dehydrogenaza alkoholowa
C-OH C O + 2H+ + 2e- dehydrogenaza mleczanowa
dehydrogenaza jabłczanowa
C-ONH2 C O + NH4+ + H+ + 2e-
dehydrogenaza glutaminowa
C-CH2-COOH C-CH2-COOH + 2H+ + 2e- dehydrogenaza izocytrynianowa
OH O
dehydrogenaza
C-CH3 + CO2
6-fosfoglukonianowa
O
H C + H2O HO C + 2H+ + 2e-
dehydrogenaza aldehydowa
O O
C C + 2H+ + 2e-
dehydrogenaza aldehydowa
C C
H H
model klucza i zamka
model indukowanego dopasowania siÄ™ enzymu
model indukowanego dopasowania się enzymu na przykładzie
heksokinazy
specyficzność enzymów:
1. Swoistość kierunku działania- zdolność enzymu do katalizowania
tylko jednej z wielu termodynamicznie możliwych reakcji
2. Specyficzność substratowa -możliwość wyboru tylko jednego
substratu (specyficzność absolutna) lub grupy podobnych
strukturalnie substratów (specyficzność grupowa)
3. Specyficzność przestrzenna (stereochemiczna)
KLASY ENZYMÓW
1. Oxydoreduktazy (reakcje redoks)
dehydrogenazy, oksydazy, reduktazy, peroksydazy,
katalazy, oksygenazy, hydroksylazy
2. Transferazy (przenoszenie grup funkcyjnych)
transaldolaza, transketolaza, acylo-, metylo-,
glukonylo- i fosforylo transferazy, kinazy, fosfomutazy
3. Hydrolazy (hydroliza)
esterazy, glikozydazy, peptydazy, tiolazy, fosfolipazy,
amidazy, dezamidazy
4. Liazy (dodanie / usunięcie grup - tworzenie podwójnego
wiÄ…zania)
dekarboksylazy, aldolazy, ketolazy, hydratazy,
dehydratazy, syntazy, liazy
5. Izomerazy (przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe)
racemazy, epimerazy, mutazy
6. Ligazy (reakcje Å‚Ä…czenia dwu czÄ…steczek)
syntetazy, karboksylazy
model Michealisa-Menten
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
enzym E
Substrat S Produkt P
k-1+ k2 [S][E] k1 k2
= = KM
S + E SE P + E
k1 [ES] k-1
stała Michaelisa
jeśli [S] >> [E]
[E] = [E]o-[SE]
k1 [S]([E]o-[SE]) = k-1[SE] + k2[SE]=(k-1+ k2)[SE] stan stacjonarny
maksymalna szybkość reakcj
[S][E] [S]([E]o-[SE])
[E]o KM
KM = =
= +1 = Vmax
[ES] [ES]
[ES] [S]
Vmax= k2[E]o
1/KM  powinowactwo enzymu do substratu
model Michealisa-Menten
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
enzym E
Substrat S Produkt P
k1 k2
S + E SE P + E
k-1
Vmax
d[P]
Vmax
=
v =
dÄ
KM
1+
[S]
Vmax/2
gdy S
to: v
Vmax
gdy v = 0.5 Vmax to [S]=KM
[S]
KM
wartości KM dla wybranych enzymów oddechowych metabolizujących cukry
maltaza ok 10-1 mol /dm3
sacharaza ok 10-2 mol /dm3
mleczan dehydrogenazy ok 10-4 mol /dm3
8
model Michealisa-Menten
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
enzym E
Substrat S Produkt P
k1 k2
Wykres Lineweavera - Burka
S + E SE P + E
k-1
KM 1 1
1/v
1
= +
v
Vmax [S] Vmax
1/Vmax
1/[S]
-1/KM
możliwość jednoznacznego wyznaczenia KM i Vmax
Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych
enzym E
Substrat S Produkt P
k1 k2
S + E SE P + E reakcja właściwa
k-1
k3 k4
regeneracja formy
E + a E-b E + b
pierwotnej
dla enzymatycznego utleniania glukozy przez oksydazÄ™ glukozowÄ…:
S = glukoza, P = ´-lakton, a =O2, b = H2O2,
E i E = postać utleniona i zredukowana enzymu
inny przykład:
k1 k2 k3
S + E (SE)1 (SE)2 P + E
k-1
Inhibicja enzymów
E + Inh E-Inh
inhibicja kompetytywna (współzawodnicza)
ES P + E
+S
E
+Inhibitor
EI
inhibicja niekompetytywna (niewspółzawodnicza)
P + E
ES
+S
E
E-I-S
+Inhibitor
EI
WPA
YW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
" kataliza przez zbliżenie reagujących cząsteczek
" kataliza przez utworzenie kowalencyjnych produktów
pośrednich z enzymem
" kataliza kwasowo-zasadowa
" kataliza przez deformacjÄ™ czÄ…steczki substratu
" kataliza jonami metali
Wpływ czasu reakcji na aktywność enzymu
[P] aktywność enzymu
Vpocz
IU - International Units
lub µmol powstajÄ…cego produktu na minutÄ™
w 30oC
aktywność molekularna- liczba obrotów
liczba moli substratu reagujÄ…ca w ciÄ…gu
1 minuty z 1 molem centrów aktywnych
czas reakcji
w 30oC.
WPA
YW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
Wpływ temperatury na aktywność enzymu
temperatura maksymalna
Vreakcji
temperatura optymalna
temperatura
s
t
a
b
i
l
n
o
Å›
ć
b
i
a
Å‚
k
a
j
e
n
z
c
mi
he
c
i
j
c
k
ea
r
ć
Å›
o
bk
y
z
s
WPA
YW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
" wpływ pH
1. dla skrajnych wartości
pH zachodzi denaturacja
Vmax
2. protonowanie/deprotonowanie
centrum aktywnego
pH optymalne
pH
WPA
YW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
" wpływ stężenia substratu
Vmax
kataliza
kataliza
efektywna
nieefektywna
[S]c
[S]
krytyczne stężenie substratu
Równanie Monoda
Zooglera ramigera
szybkość
Sphaerotilus natans
wzrostu
µmax [S]
bakterii
µ=
Ks+[S]
µ - wÅ‚aÅ›ciwa szybkość
wzrostu
µmax - maksymalna
właściwa
szybkość wzrostu S1
S2
Ks - stała równowagi
stężenie substratu
enzym-substrat
niższe stężenia substratu:
bakteria z enzymami o wyższym Ks (niższym KM) wzrasta szybciej (ma
wyższe powinowactwo do substratu)
dla wyższych stężeń substratu: KM nie jest decyduje o szybkości wzrostu
Biochemia i fizjologia wzrostu mikroorganizmów
MIKROORGANIZMY
" bakterie
" grzyby (np. drożdże, Aspergillus)
" glony jednokomórkowe
" pierwotniaki
metabolizm - wszelkie reakcje zachodzące w komórce
ANABOLIZM
mniejsze i prostsze czÄ…steczki
KATABOLIZM
są przekształcane na większe i
duże i skomplikowane
skomplikowane
cząsteczki są przekształcane na
(energia jest zużywana)
mniejsze i prostsze
(pozyskiwana jest energia)
ANABOLIZM:
powstają zarówno główne składniki komórki:
(np. białka, kwasy nukleinowe, cukry, lipidy)
oraz ich prekursory i inne produkty przejściowe:
(np. aminokwasy, puryna, pirymidyny,
kwasy tłuszczowe, cukty, fosforany)
efekt energetyczny - endotermiczny
procesy anaboliczne muszą wymagają obecności reduktorów
Skąd pochodzi energia potrzebna do przebiegu procesów anabolicznych?
z procesów KATABOLICZNYCH (np. utlenianie węglowodanów do CO2)
energetyka katabolizmu
energetyka katabolizmu
 wiązanie o dużej energii
NH2
N
N
O O O
HO P O P O P O
N
N
adenozyna
O
O O O
H H
H
H
OH OH
dwufosforan adenozyny (ADP)
trójfosforan adenozyny (ATP)
ATP ADP AMP (monofosforan)
(rzadziej)
O
C O P OH + ADP
C OH + ATP
OH
O
O
H H
NH2
NH2
warunki aerobowe
+2e + 2H
N
N
oksydatywna fosforylacja
R
R
NAD+ NADH
NADPH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O2 NADP+ + 3ATP + H2O
NADH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O2 NAD+ + 3ATP + H2O
adenozyna
NADH - dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
NADPH - fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego
warunki anaerobowe
oksydatywna fosforylacja nie może zachodzić
fosforylacja na poziomie substratu (substrate level phosphorylation)
znacznie większa ilość substratu musi być zużyta
NADH + X NADP+ + XH2
przykłady:
kwas mlekowy w mięśniach po dużym wysiłku fizycznym
kwas mlekowy z bakterii mlekowych
glicelor produkowany przez drożdże gdy blokowana jest synteza etanolu
wytwarzanie kwasu mrówkowego, etanolu, 2,3-butanodiolu, butanolu, acetonu, kwasu propionowego
METABOLIZM
tlenowy beztlenowy
(aerobowy) (anaerobowy)
O2
z
ródło węgla CO2 dysproporcjonowanie
utlenianie,
wydajne wydzielanie energii
mniejsza wydajność uzysku energii
fakultatywne (warunkowe)
beztlenowce - dostosowujÄ…
GLUKOZA
sie zarówno do warunków
drożdże tlenowe drożdże beztlenowe
tlenowych jak i beztlenowych
powstajÄ…:
powstajÄ…:
CO2, H2O,
niewiele energii,
substancje redukujÄ…ce
nowe drożdże (dużo)
nowe drożdże (niewiele)
zredukowany
utleniacz
metabolit węglowy,
H2O
substrat węglowy
biomasa
CmHnOpNq
proces
CsHtOuNvPwSxKyMgz
z
ródłóazotu
metaboliczny
NH3
K+/PO43-/Mg2+/SO42-
etc.
O2,
reduktor
utleniony
metabolit węglowy
METABOLIZM
pierwotny wtórny
tropofaza idiofaza
podczas zbalansowanego wzrostu gdy nie ma dostatecznej ilości
(dostarczany nadmiar pożywienia) pożywienia
substancje wytworzone podczas
idiofazy z acetylokoenzymuA:
tropofaza
cytryniany, kwasy tłuszczowe,
idiofaza
poliketydy, chinony, terpeny,
sterole i inne.
spadek tempa wzrostu
metabolit
pierwotny
metabolit
wtórny
czas
)
i
k
r
o
m
o
k
t
s
o
r
z
w
(
a
s
a
m
o
i
b
WYDAJNOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW
MOLOWA WYDAJNOŚĆ WZROSTU (Ys)
wydajność suchej masy komórek na mol substratu
WSPÓA
CZYNNIK KONWERSJI W
GLA (WKC)
wydajność suchej masy komórek na 1 gram węgla
zawartego w substracie.
substrat organizm Ys WKC
metan Methylomonas sp. 17.5 1.46
metanol Methylomonas sp. 16.6 1.38
etanol Candilla utilis 31.2 1.30
glicerol Klebsiella pneumoniae 31.2 1.30
glukoza Escherichia coli
aerobowo 95.0 1.32
anaerobowo 25.8 0.36
Saccharomyces cerevisiae
aerobowo 90 1.26
anaerobowo 21 0.29
heksadekan Yarrowia (Candida) lypolitica 203 1.06
SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW
zależy od:
" rodzaju z
ródła węgla
" ścieżek metabolicznych
" obecności innych substratów
" wymagań energetycznych do asymilacji np. azotu
" wydajności tworzenia ATP
" obecności inhibitorów
" obecności jonów
" transportu substratów i produktów
" stanu fizjologicznego mikroorganizmu
SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW - UKA
ADY OSCYLUJ
CE
zjawiska oscylacyjne o podłożu enzymatycznym - sprzężenia zwrotne
regulacja genetyczno - metaboliczna
grupa
np. wolno tłumione oscylacje
amino enzym metabolit
zawartości NADH2 w zawiesinie
kwasowa
komórek drożdzy w środowisku
beztlenowym
ADP aktywuje fosfofruktokinazÄ™
substrat metabolit
zwiększenie strumienia glukozy
aktywacja wsteczna
aktywacja
przepływającej przez błonę komórkową
substrat A1 A2
maleją stężenia fosforanów glukozy
aktywacja wsteczna
inhibicja
maleje stężenie ADP
substrat A1 A2
r
e
p
r
a
j
e
c
s
a
j
w
a
y
t
k
a