Warszawa, 20.03.2005
Elementy Biotechnologii
WYKA
AD NR 3
Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii
ELEMENTY BIOTECHNOLOGII
WYKA
AD NR 3
Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym.
Wirusy, bakterie, grzyby.
Wymagania pokarmowe.
Otrzymywanie szczepów przemysłowych - izolacja, selekcja.
Biologiczne z
ródła węgla, azotu, tlenu, z
ródła energii.
Przenoszenie energii.
literatura wykorzystana do wykładu
K. Szewczyk: Technologia biochemiczna, Wydawnictwa Politechniki Warszawskiej 1997
W.J.H. Kunicki-Goldfinger: Życie bakterii, PWN, Warszawa
J. KÄ…czkowski: Podstawy Biochemii, rozdz. 5, WNT, Warszawa
Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym
" MIKROORGANIZMY JAKO y
RÓDA
O BIOMASY
drożdże piekarnicze, paszowe, kultury startowe do przetwórstwa mleka,
szczepionki
" MIKROORGANIZMY JAKO MIKROFABRYKI PRODUKTÓW
METABOLIZMU
technologie produkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych
" MIKROORGANIZMY JAKO CZYNNIKI UTYLIZUJ
CE SUBSTRATY
technologie ochrony środowiska, oczyszczanie ścieków, mikroorganizmy
w biometalurgii
podział mikroorganizmów według:
RODZAJU y
RÓDA
A W
GLA:
" organizmy autotroficzne (samożywne, bazują na CO2)
" organizmy heterotroficzne (cudzożywne, bazują na związkach
organicznych)
RODZAJU y
RÓDA
A ENERGII:
" organizmy chemotroficzne (rozkład zw. chemicznych)
" organizmy fototroficzne (absorbcja promieniowania świetlnego)
RODZAJU DONORÓW ELEKTRONÓW I PROTONÓW:
" organizmy fitotroficzne (ze zw. nieorganicznych)
" organizmy organotroficzne (ze zw. nieorganicznych)
Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym
FOTOAUTOTROFY
samożywne, korzystają z energii słonecznej
(glony, sinice, niektóre bakterie)
oczyszczanie ścieków, produkcja biomasy
CHEMOLITOTROFY
korzystają z energii zredukowanych związków
(bakterie metanowe, wodorowe, żelazowe, nitryfikujące,
siarkowe)
oczyszczanie ścieków, ługowanie metali
HETEROTROFY
korzystają ze związków organicznych
(większość bakterii i grzybów)
najpowszechniej wykorzystywane w biotechnologiach
Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym
TYPY ODDYCHANIA
" tlenowe O2 H2O
" fermentacja przemiana zw. organicznych
" azotanowe NO3- NO2-
" siarczanowe SO42- S2-
" fermentacja metanowa CO2 CH4
ORGANIZMY
PROTOTROFICZNE AUKSOTROFICZNE
syntezują wszelkie niezbędne wymagają dodatku witamin,
substancje z pojedynczego z
ródła aminokwasów lub innych
pokarmu zw. organicznych
WIRUSY
cząstki z pogranicza organizmów żywych
zbudowane z jednego rodzaju kwasu nukleinowego (albo RNA albo
DNA)
otoczone płaszczem białkowym (kapsydem)
wykorzystywane do wprowadzania fragmentów informacji genetycznej
(celowe infekowanie komórek)
wirusy:
bakteryjne (bakteriofagi)
sinic (cyanofagi)
roślinne
zwierzęce
Electron Micrograph of
WIRUSY
Herpes Simplex Type 6
Virus
podział wirusów wg budowy kapsydu:
rysunek niedostępny w wersji internetowej
wirusy o budowie helikoidalnej (spiralne) -
kwas nukleinowy otoczony cylindrem
białkowym o strukturze helikalnej
wirusy bryłowe (izometryczne) kwas
nukleinowy otoczony kapsydem wielościennym
najczęściej ikosaedrem ( dwudziestościanem)
lub dodekaedrem (dwunastościanem)
wirusy zawierające oprócz helikoidalnego lub
bryłowego kapsydu dodatkową otoczkę
białkową (Enveloped viruses)
wirusy złożone (binalne) nie mają struktury
helikoidalnej ani izometrycznej, sÄ… nieregularne
lub mają strukturę złożoną
WIRUSY
WIRUS TYPU IZOMETRYCZNEGO
(BRYA
OWEGO)
WIRUS TYPU HELIKOIDALNEGO
rysunek niedostępny w wersji internetowej
rysunek niedostępny w wersji internetowej
Viral Structure (Enveloped Polyhedral Virus)
rysunek niedostępny w wersji internetowej
Viral Structure (Enveloped Helical Virus)
rysunek niedostępny w wersji internetowej
WIRUSY
Electron Micrograph of Coliphage T4
WIRUS TYPU BINALNEGO
(ZA
OŻONY)
rysunek niedostępny w wersji internetowej
rysunek niedostępny w wersji internetowej
Caption:-- T4 bacteriophage (DNA virus).
File Name:-- 58579A
Category:-- Viruses Type of Image:-- TEM
Magnification:-- x55,065--(Based on an image size of 1 inch
in the narrow dimension)
WIRUSY
rysunek niedostępny w wersji internetowej
adsorpcja
penetracja
rysunek niedostępny w wersji internetowej
zniszczenie komórki żywiciela
namnażanie i dojrzewanie wirusa
oi uwolnienie wirusa
BAKTERIE
Pałeczki
Ziarenkowce
(coccus)
Pałeczki
podłużne
2-5 µm
sferyczne
podłużne
do 1 µm
do 2 µm
BAKTERIE ZASTOSOWANIE
kwasu mlekowego fermentowane napoje mleczne, sery, dekstran
przetrwalnikujÄ…ce enzymy, antybiotyki, aceton, butanol
promieniowce antybiotyki, enzymy
fermentacji alkoholowej etanol
metylotroficzne biomasa z metanolu
metanogenne biogaz
kwasu octowego ocet, utlenianie sorbitolu
kwasu propionowego kwas propionowy, witamina B12, serowarstwo
celulolityczne degradacja celulozy
chemolitotroficzne Å‚ugowanie rud metali
BAKTERIE
komórki prokariotyczne:
nukleoid (długa podwójna helisa DNA
zanurzona w cytoplazmie i stykajÄ…ca siÄ™
bezpośrednio z jej składnikami)
rysunek niedostępny w wersji internetowej
u prokariotów błona pełni czynności
mitochondriów:
wnikanie pokarmu (permeazy)
zawiera enzymy i przekaz
niki elektronów
model mozaikowy budowy błony
Escherichia Bacillus
erytrocyty mitochondria coli megaterium
cholesterol 25 5 0
0
fosfatydylocholina 23 48 0
0
fosfatydyloglicerol 0 1 0 45
fosfatydyloetanoloamina 20 28 100 45
lizynofosfatydyloglicerol 0 0 0 10
inne lipidy 32 18 0 0
GRZYBY
GRZYBY o znaczeniu przemysłowym
Pleśnie (grzyby strzępkowe)
Drożdże
organizmy cudzożywne, biorą udział w obiegu materii w przyrodzie -
powodujÄ… procesy gnilne
cykl życiowy GRZYBÓW Aspergillus i Penicillium:
1. kiełkowanie konidów (strzępków)
2. namnażanie grzybni
3. sporulacja (wytwarzanie konidów)
Mykologia - nauka o grzybach.
GRZYBY
Grzyby obejmują: drożdże, pleśnie i grzyby
kapeluszowe
" chemoheterotrofy - wymagajÄ…
związków organicznych i z
ródeł
energii
" absorbują składniki odżywcze
" są względnymi
(fakultatywnymi) anaerobami
" spośród 100,000 gatunków
grzybów tylko około 100 jest
patogenne dla organizmów
zdjęcie niedostępne w wersji internetowej
zwierzęcych
" mają polisacharydowe ściany
komórkowe
Penicillium
GRZYBY - DROŻDŻE
Rozmnażanie-
" pączkowanie - rozmnażanie bezpłciowe.
podział komórki w wyniku którego powstają
dwie komórki potomne - większa i mniejsza,
która stopniowo powiększy swoją objętość.
zdjęcie niedostępne w wersji internetowej
" niektóre drożdże (np. Candida
albicans), wytwarzajÄ… przetrwalniki
(spory )
Saccharomyces cerevisiae
" rozmnażanie płciowe w wyniku
którego może dojść do wymiany
materiału genetycznego między
osobnikami biorącymi udział w
procesie płciowym. Podczas
zdjęcie niedostępne w wersji internetowej
rozmnażania płciowego dochodzi
do fuzji.
Cryptococcus neoformans
GRZYBY
Penicilium chrysogenum, Cephalosporium acremonium, Paecilomyces varioti
antybiotyki: penicylina G, cefalosporyna C, wariotyna
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus
preparaty enzymatyczne, antybiotyki, kwas cytrynowy
Ashbya gossypi, Claviceps purpurea, Giberella fujikuroi
witaminy
Saccharomyces cerevisiae
etanol i inne napoje alkoholowe
Candida utilis
białkowe preparaty paszowe
Trichoderma wentili, T. viride, T. reesei
preparaty enzymatyczne
Otrzymywanie szczepów przemysłowych
z
ródła mikroorganizmów przemysłowych:
środowisko naturalne oraz kolekcje czystych kultur
kolekcje czystych kultur w Polsce:
Åšwiatowa Federacja Kolekcji Kultur (WFCC):
" Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego
" Wydział Chemii i Technologii Żywności Politechniki A
ódzkiej
" Akademia Techniczno-Ekonomiczna we Wrocławiu
ponadto:
" SGGW AR
" Instytut Przem. Mleczarskiego w Warszawie
" UAM
" UJ
przechowywanie szczepów przemysłowych:
" w obniżonej temperaturze
na agarze w -20oC, - 5oC (do 6 miesięcy)
w ciekłym azocie, -196oC w 10% wodnym roztworze glicerolu (kilka miesięcy)
" w formie bezwodnej
suszenie w 24oC na agarze lub piasku (okres przechowywania - kilka lat)
liofilizacja (suszenie próżniowe kultury wraz z pożywką) (wiele lat)
Otrzymywanie szczepów przemysłowych
IZOLACJA
etapy:
" wybór miejsca i pobranie próbek mikroorganizmów
" wstępna obróbka próbek
" namnażanie drobnoustrojów i selekcja czystych kultur
" testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do określonych zadań
KRYTERIA UWZGL
DNIANE PRZY WYBORZE MIKROORGANIZMU:
" charakterystyka odżywiania
(tanie media, dostosowanie do określonego substratu)
" optimum temperatury
(najlepiej wyższa od 40oC - mniejsze koszty chłodzenia, eliminacja ryzyka zakażenia)
" zdolności do wzrostu w warunkach przemysłowych
odporność na typ procesu i stosowane materiały
" stabilność cech i odporność na manipulacje genetyczne
" produkcyjność
(wydajność procesu substrat produkt na jednostkę czasu)
" łatwość wydzielenia produktu z medium pofermentacyjnego
" brak toksycznych produktów metabolizmu
Otrzymywanie szczepów przemysłowych
IZOLACJA
cechy mikroorganizmów ułatwiające prowadzenie procesów
technologicznych:
" odporność na infekcje
" brak własności pieniących
" odporność na niektóre składniki pochodzenia naturalnego
" odporność na niskie stężenie rozpuszczonego tlenu (dla organizmów
aerobowych)
" testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do określonych zadań
Otrzymywanie szczepów przemysłowych
IZOLACJA
ROZPROSZENIE HODOWANYCH DROBNOUSTROJÓW DO MONOKULTUR
WZBOGACAJ
CA HODOWLA W ROZTWORZE
faworyzowanie pożądanych kultur przez stworzenie warunków wzrostu bardziej korzystnych dla
pożądanego mikroorganizmu
" dodawanie substratów promocyjnych lub inhibitorów
mleczan sodowy dla bakterii propionowych
4% etanol dla bakterii kwasu octowego (Acetobacter) hamuje wzrost innych bakterii
dodatek antybiotyków selektywnie niszczących bakterie niepożądane
" tworzenie warunków korzystnych dla jednego typu bakterii przez zmianę
temperatury hodowli
" wielokrotne przesiewanie na świeże podłoża
ZASTOSOWANIE POŻYWEK STAA
YCH
stosowanie pożywki preferującej enzym występujący w pożądanym
mikroorganizmie
Techniki wzrostowe preferujÄ… mikroorganizmy szybkorosnÄ…ce
Ulepszanie szczepów przemysłowych
Zwiększanie wydajności (produkcyjności) wybranego mikroorganizmu
" optymalizacja składu pożywki
" optymalizacja warunków hodowli
" wywoływanie mutacji i manipulacje genetyczne
" selekcja mutantów
mutacje spontaniczne - raz na 105
MUTACJA
PUNKTOWA
GENOMU
-dotyczy pojedynczych nukleotydów -obejmują większą liczbę
nukleotydów
-zmienia tryplet kodujÄ…cy AA lub
-przemieszczenie odcinka
tryplet nonsensowny (niekodujÄ…cy)
DNA lub inwersja
(odwrócenie kolejności)
Ulepszanie szczepów przemysłowych
etap 1. WYWOA
YWANIE MUTACJI INDUKOWANEJ
mutacje spontaniczne - raz na 105
czynniki przyspieszajÄ…ce mutacje (mutagenne):
promieniowanie UV(najczęściej 100-300 nm), X,
ok. 90% wszystkich zmian to
gamma
dimeryzacja pirymidyn,
głównie tyminy
zalety metody UV:
dostępność, prostota, łatwość, powtarzalność, duża częstotliwość mutowania,
możliwość uzyskania wszystkich typów mutacji,
wywoływanie mutacji zarówno w komórkach wegetatywnych jak i spoczynkowych.
substancje mutagenne
HNO2, powoduje oksydatywną dezaminację, zmienia specyficzność tworzenia par
NH2OH, działa na pirymidyny, głównie cytozynę
N-metylo-N -nitro-N-nitrozoguanidyna, tlenki etylenu, epoksydy, 5-aminoakrydyna
Ulepszanie szczepów przemysłowych
etap 2. SELEKCJA MUTANTÓW
gdy nie wiadomo, jakie wymagania pokarmowe majÄ… zmutowane organizmy:
1. pożywka maksymalna - dostarczone są wszystkie składniki
inkubacja w cieplarce
przenoszenie na nową płytkę
2. metoda prób i eliminacji poszczególnych składników pokarmowych
(tzw. podłoża zdefiniowane, np. zawierające proste z
ródło węgla)
hodowle ze wskaz
nikami chemicznymi i mikrobiologicznymi
np. wykrywanie enzymów np. stosowanie drobnoustrojów
amylolitycznych podczas reakcji z I2 testowych w celu wykrycia czy
mutanty produkujÄ… antybiotyki
dodawanie indykatorów pH w celu
wykrycia kwasó i zasad w
metabolitach
Ulepszanie szczepów przemysłowych
regulacja genetyczno - metaboliczna
grupa
ADAPTACJA MIKROORGANIZMÓW
amino
enzym metabolit
kwasowa
modyfikacja organizmu, aby mechanizmy
kontroli wytwarzania metabolitów nie hamowały
substrat metabolit
produkcji zbyt wcześnie:
aktywacja wsteczna
aktywacja
" wydzielanie poza komórkę enzymu
substrat A1 A2
kontrolujÄ…cego drogÄ™ asymilacji
inhibicja
substrat A A2
" powstrzymanie produkcji końcowego
produktu kontrolujÄ…cego drogÄ™ asymilacji
" eliminacja mechanizmu
rozpoznającego obecność inhibitora
Polepszanie cech szczepów innych niż produkcyjność
" wzmacnianie odporności szczepów na infekcje
" tworzenie szczepów o słabych własnościach pieniących
" tworzenie szczepów odpornych na inne substraty
" polepszanie form morfologicznych szczepów (cechy technologiczne np. podatność
na mieszanie, filtracjÄ™)
r
e
p
r
e
s
a
j
j
c
a
a
w
y
t
k
a
Media hodowlane
WODA
bufory, środki antypieniące
ENERGIA
promotory wzrostu,
POŻYWKA
prekursory metabolitów
węgiel
składniki mineralne
P, S, K, Na, Ca, Mg, Fe
azot
tlen
media w hodowli maksymalizacja:
przemysłowej muszą być " wydajności produktu względem substratu,
" tanie " stężenia produktu
" dostępne przez cały rok " szybkości wytwarzania produktu
minimalizacja:
" wytwarzania produktów ubocznych
" trudności technologicznych (mieszania,
napowietrzania, oczyszczania)
Media hodowlane
WODA
podstawowy składnik w każdej hodowli
skład mineralny wody
(różne wymagania do różnych celów -np. browarnictwo, technologie farmaceutyczne)
dostępność w dużej ilości
y
RÓDA
A W
GLA - węglowodany
skrobia
(kukurydza, ziemniaki, zboża) - hydroliza kwaśna lub enzymatyczna
sacharoza i cukry proste
zawarte w melasie (produkt uboczny w przem. cukrowniczym)
laktoza
zawarta w serwatce (produkt uboczny w mleczarstwie)
inne z
ródła węgla
alkohole, proste kwasy organiczne, metan,
koszty surowca to 50-70% kosztów eksploatacyjnych
czasem surowiec jest określony normami prawnymi i technicznymi
(wytwarzanie piwa, wina, napojów mlecznych)
Media hodowlane
y
RÓDA
A AZOTU
zużywanie NH4+ zakwasza środowisko
azot nieorganiczny
zużywanie NO3- alkalizuje środowisko
sole amonowe
z NH4NO3 najpierw przyswajane sÄ… NH4+
potem NO3-
azot organiczny
mÄ…czka sojowa
reduktaza zotanowa (redukuje NO3-
ziarno sojowe
NH4+) jest represjonowana przez NH4+
namok kukurydziany
hydrolizat kazeiny
mÄ…czka rybna
hydrolizat drożdży
wywar gorzelniany
y
RÓDA
A TLENU
POWIETRZE (dla organizmów aerobowych)
gdy stosowane są czyste kultury powietrze musi być wyjałowione (filtrowanie,
ogrzewanie, naświetlanie UV)
Media hodowlane
y
RÓDA
A SKA
ADNIKÓW MINERALNYCH
najistotniejsze P, Mg, Mg, K, S, Ca, Cl
inne: Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn występują jako domieszki śladowe w
wystarczających ilościach
typowe stężenia soli mineralnych
składnik g/dm3
KH2PO4 1-4
MgSO4 0,25-0,3
KCl 0,5-12
CaCO3 5-17
FeSO4 0,01-0,1
ZnSO4 0,1-1
MnSO4 0,01-0,1
CuSO4 0,003-0,01
Na2MoO4 0,01-0,1
WITAMINY: tiamina, kwas nikotynowy, kwas pantotenowy, pirydoksyna,
biotyna, ryboflawina
zawarte są w mące sojowej, ekstrakcie drożdżowymm wywarze gorzelnianym,
melasie
Media hodowlane
INNE SKA
ADNIKI AKTYWNE
induktory, prekursory, inhibitory
np.
" kwas fenylooctowy w procesie produkcji penicyliny
" Na3SO3 wiążący CH3CHO podczas wytwarzania gliceryny
" przy wytwarzaniu kwasu cytrynowegometale alkaliczne, fosforany i
niskie pH hamuja wytwarzanie kw. szczawiowego
ÅšRODKI ANTYPIENI
CE
piana -powoduje
" alkohole długołańcuchowe
flotację mikroorganizmów,
" estry
wyrzucanie płynu z reaktora
" kwasy tłuszczowe i ich pochodne
" silikony
" inne zwiÄ…zki, np. glikole
środki przeciwpieniące mogą utrudniać wnikanie tlenu do płynu hodowlanego