Budowa i pozyskiwanie genów do konstrukcji genowych
DNA- budowa
Nukleotydy:
-estry nukleozydów i kwasu
ortofosforowego (V)
1. reszta cukrowa (deoksyryboza) C
2. reszta fosforanowa P
3. Zasada azotowa:
adenina, tymina A - T
guanina, cytozyna G  C
powiÄ…zane wiÄ…zaniami wodorowymi
RNA  budowa
Uracyl (U) w miejscu tyminy
(U) uracyl jest komplementarny do
adeniny (A)
RNA- jednoniciowy
Zdania DNA i RNA
DNA RNA
·ð Przenosi informacjÄ™ genetycznÄ… ·ð Przenosi informacjÄ™ genetycznÄ…
(wirusów)
·ð Nukleoid- organizmy prokariotyczne
·ð Przenosi informacjÄ™ genetycznÄ… z
·ð Chromosomy- organizmy
DNA na rybosomy
eukariotyczne
·ð Przenosi odpowiednie aminokwasy
do syntezy białek
·ð Może dziaÅ‚ać jak enzym
Genomy i geny
Gen- to odcinek DNA, jednostka informacji biologicznej,
Genom- to pełny zestaw informacji genetycznej w organizmie.
Genomy organizmów
Genomy bakterii  kilkaset do kilku tysięcy genów (85-89%)
Genomy roślin  występuje około 20 000 do 50 000 genów (45-50%)
Genomy zwierząt  13 000 do 30 000 genów (30-50%)
Ludzki genom zawiera około 40 000 genów (sekwencje kodujące to 25% genomu)
Jak zbudowany jest gen?
Różnice miedzy genami prokariotycznymi i eukariotycznymi:
1. Geny bakteryjne nie mają intronów
2. Bakterie nie potrafią odczytywać i uaktywniać genów zawierających intronów, czyli
eukariotycznych!!!
3. Prokariotyczne promotory ni są odczytywane w komórkach eukariotycznych!!!!
Zadania promotora w genie:
o Uaktywnia gen, czyli rozpoczyna transkrypcjÄ™.
o PROMOTOR KONSTYTUTYWNY  gen zawsze aktywnie produkuje dane
białko
o Konstytutywne:
·ð Silny promotor konstytutywny
·ð SÅ‚aby promotor konstytutywny
Zadania terminatora w genie:
·ð Sekwencja DNA koÅ„czÄ…ca gen:
o Zakończenie transkrypcji
o Ochrona przed degradacjÄ… mRNA
Obszary regulacyjne w genie:
·ð To:
- promotor, intron i terminator
·ð SÄ… to niekodujÄ…ce obszary genu
- nie wpływają bezpośrednio na końcową sekwencję aminokwasową białka
funkcjonalnego
·ð OkreÅ›lajÄ… kiedy i gdzie dany gen jest uaktywniony,
·ð Obszary te zajmujÄ… znacznÄ… część DNA w genie.
Jak uzyskujemy geny do transferu w inżynierii genetycznej?
Informacja o budowanie genu:
Banki genów dostarczają informacji na temat sekwencji zasad DNA w interesującym nas
genie.
Pierwsze informacje o genach pochodziły z lat 80. XX wieku i niewiele było takich genów,
które miałby znaczenie użytkowe.
Banki genów to między narodowe bazy danych zawierające w swoich zasobach sekwencje
zasad DNA i powiązanych z nimi sekwencji aminokwasów białek.
Genbank- największa i najpełniejsza baza danych.
Próbka zapisu z Genbanku: sekwencja zasad DNA genu insuliny:
Pozyskiwanie genów  pierwsza metoda:
1. Chemiczna synteza DNA
 maszyna genowa sztucznie syntezuje DNA, według przepisu uzyskanego z
banku genów.
·ð Zasada syntezy DNA na podÅ‚ożu staÅ‚ym:
1. Do złoża przytwierdza się 1 nukleotyd, który rozpoczyna syntezę 
przyłączony jest do podłoża stałego ( zwykle jest to szkło lub kulki
polistyrenowe) o wielkości ułamków milimetra .
2. Dodaje się kolejne (po każdym etapie usuwa się nadmiar nukleotydów
przez przemywanie podłoża roztworami odpowiednich substratów i
rozpuszczalnikami).
Pozyskiwanie genów  druga metoda:
Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy)
Umożliwia powielenie DNA na matrycy DNA, matryce DNA uzyskuje się z genomu komórki
lub tkanki z organizmu.
Składniki w reakcji PCR:
1. Matrycowy DNA
2. Trifosforany deoksyrybonukleozydów  (4 rodzaje: deoksyadenozyna,
deoksyguanozyna, deoksycytydyna, tymidyna ( Da, dG, dC i T)
3. Primery (startery)
4. Termostabilna polimeraza DNA
Primery (startery)
Krótkie fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy DNA, znajdujących się na
obu końcach interesującego nas genu.
- 18-24 nukleotydów (syntezowane są w  maszynach genowych )
Przebieg reakcji PCR
Trzy cyklicznie powtarzajÄ…ce siÄ™ etapy:
1. Denaturacja matrycy DNA
2. Hybrydyzacja primerów z matrycą
3. Synteza DNA (elongacja) przez dołączenie nukleotydów do primerów przy
zastosowaniu termostabilnej polimerazy.
Denaturacja
·ð Rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA:
- odbywa siÄ™ w temp ~95oC
- pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze
łańcuchy.
Hybrydyzacja primerów z matrycą
·ð WiÄ…zanie primerów z matrycowÄ… czÄ…steczkÄ… DNA  tworzenie odcinków
dwuniciowych
·ð Zachodzi w temp. Å›ciÅ›le okreÅ›lonej dla danej pary starterów ( pomiÄ™dzy 45-
60oC)
Synteza DNA (elongacja)
·ð Zachodzi wÅ‚aÅ›ciwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu.
·ð Zachodzi w temp ~72oC
·ð Tworzy siÄ™ kompleks DNA z primerami i polimerazÄ… DNA, wskutek czego
rozpoczyna siÄ™ synteza nici DNA
I cykl PCR
Wydajność PCR
Zazwyczaj 25 cykli:
- 1 cykl daje kopię ( + oryginał)
-2 cykl kopia oryginału i kopii (4)
- 3 cykl 16
- 4 cykl 32 itd.
Po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek.
Zalety PCR
1. Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu- wystarczy znajomość sekwencji
nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen
2. Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%
3. Metoda specyficzna- przy doborze odpowiednich starterów, powieleniu ulega tylko
jeden odcinek DNA.
4. Metoda bardzo czuła, pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA
Ogólna budowa transgenu
Transgen to gen natywny z różnymi modyfikacjami:
-modyfikowane mogą być wszystkie elementy składowe genu:
-promotor
-część kodująca
-terminator
Modyfikacja promotorów genów
Przyczyny modyfikacji promotorów:
żð Prokariotyczne promotory nie sÄ… rozpoznawalne w komórkach roÅ›linnych i
zwierzęcych
żð Gen nie podlega ekspresji w transformowanych komórkach i biaÅ‚ko nie jest
wytwarzane
Zastępuje się promotory genów prokariotycznych np.: promotorami genów eukariotycznych (
roślinnych) lub wirusów roślin.
1. Silne konstytutywne promotory:
- najczęściej używany jest silny promotor konstytutywny wirusa mozaiki kalfiora
(CaMV 35 S) należy do uniwersalnych promotorów konstytutywnych (roślin)
Zaleta:
Zapewnia wysoki poziom transkrypcji wybranemu genowi
Wada
Produkty transgenów są wytwarzane w każdej komórce rośliny, również tych częściach
roślin, w których nie są potrzebne
Wady stosowania silnych promotorów konsultatywnych
·ð Kukurydza Bt
o Szkodliwość w stosunku do motyla, który żywił się pyłkiem rośliny
transgenicznej, w wyniku czego ginęło wiele motyli
o W pyłku białko Bt nie jest potrzebne, a potrzebne jest w liściach, narażonych
na zniszczenie przez owadzie szkodniki (omacnice prosowiankÄ™)
·ð Ziemniak Bt
o Wytwarzane białbko Bt w bulwach ziemniaków opornych na stonkę, podczas
gdy białko jest potrzebne w liściach i łodygach
o Np.: ziemniak Bt  wytwarzane białko Bt w bulwach ziemniaków, podczas
gdy białko potrzebne jest w liściach i łodygach
Modyfikacja terminatorów genów
Wiele sekwencji terminatorowych jest prawie wymiennych między genami i między
gatunkami.
Najczęściej zmienia się natywne terminatory na:
- terminator genu syntazy nopalinowej (nos) pochodzÄ…cy z Agrobacterium tumefacins